Ein Nonsequencing-Ansatz für den schnellen Nachweis der RNA-Editierung

Zusammenfassung

Der schnelle Nachweis und die zuverlässige Quantifizierung von RNA-Editing-Ereignissen auf genomischer Ebene bleiben eine Herausforderung und basieren derzeit auf direkten RNA-Sequenzierungsmethoden. Das hier beschriebene Protokoll verwendet die Mikrotemperaturgradientengelelektrophorese (μTGGE) als einfache, schnelle und tragbare Methode zum Nachweis der RNA-Bearbeitung.

Zusammenfassung

RNA-Editing ist ein Prozess, der zu posttranskriptionellen Sequenzveränderungen in RNAs führt. Der Nachweis und die Quantifizierung der RNA-Editierung beruhen hauptsächlich auf Sanger-Sequenzierungs- und RNA-Sequenzierungstechniken. Diese Methoden können jedoch kostspielig und zeitaufwendig sein. In diesem Protokoll wird ein tragbares Mikrotemperatur-Gradienten-Gelelektrophorese-System (μTGGE) als Nicht-Sequenzierungsansatz für den schnellen Nachweis der RNA-Editierung verwendet. Das Verfahren basiert auf dem Prinzip der Elektrophorese, bei der bei hohen Temperaturen Nukleinsäureproben denaturiert werden, während sie sich über ein Polyacrylamidgel bewegen. Über einen Temperaturbereich hinweg bildet ein DNA-Fragment einen Gradienten von vollständig doppelsträngiger DNA zu teilweise getrennten Strängen und dann zu vollständig getrennter einzelsträngiger DNA. RNA-editierte Stellen mit unterschiedlichen Nukleotidbasen erzeugen unterschiedliche Schmelzprofile in μTGGE-Analysen. Wir verwendeten den μTGGE-basierten Ansatz, um die Unterschiede zwischen den Schmelzprofilen von vier editierten RNA-Fragmenten und ihren entsprechenden nicht editierten (Wildtyp-) Fragmenten zu charakterisieren. Pattern Similarity Scores (PaSSs) wurden durch den Vergleich der von den editierten und nicht editierten RNAs erzeugten Bandmuster berechnet und zur Beurteilung der Reproduzierbarkeit der Methode verwendet. Insgesamt ermöglicht die hier beschriebene Plattform den unkomplizierten, einfachen und kostengünstigen Nachweis auch einzelner Basenmutationen in RNAs. Es wird erwartet, dass dieses Analysewerkzeug neue molekularbiologische Erkenntnisse unterstützen wird.

Einleitung

Einzelne Nukleotidvarianten (SNVs) in genomischer RNA, einschließlich A-zu-I-, C-zu-U- und U-zu-C-Varianten, können auf RNA-Editierereignisse hinweisen. Der Nachweis von SNVs in RNA bleibt jedoch eine technisch anspruchsvolle Aufgabe. Herkömmlicherweise wird das Verhältnis von editierter zu nicht editierter RNA durch direkte Sequenzierung, allelspezifische Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt, die^sich 1,2,3,4,5,6 nähert. Diese Ansätze sind jedoch nicht besonders zeit- oder kosteneffizient, und ihre geringen Genauigkeiten, die durch hohe Geräuschpegel verursacht werden, stellen technologische Engpässe für den RNA-basierten SNV-Nachweis dar ^7,8. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das auf der Temperaturgradientengelelektrophorese (TGGE) basiert, um einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNPs) als alternative Methode zu identifizieren, die die Notwendigkeit direkter RNA-Sequenzierungsansätze für RNA-Editing-Analysen eliminiert.

Die Elektrophorese ist eine bevorzugte Methode zur Trennung und Analyse von Biomolekülen in Life-Science-Labors. TGGE ermöglicht die Trennung von doppelsträngigen DNA-Fragmenten, die gleich groß sind, aber unterschiedliche Sequenzen haben. Die Technik beruht auf sequenzbezogenen Unterschieden in den Schmelztemperaturen von DNA-Fragmenten und nachfolgenden Veränderungen ihrer Beweglichkeiten in porösen Gelen mit einem linearen Temperaturgradienten ^9,10. Durch das Schmelzen von DNA-Fragmenten entstehen spezifische Schmelzprofile. Sobald die Domäne mit der niedrigsten Schmelztemperatur die entsprechende Temperatur an einer bestimmten Position im Gel erreicht, erfolgt der Übergang von einer helikalen Struktur zu einer teilweise geschmolzenen Struktur, und die Migration des Moleküls wird praktisch gestoppt. Daher nutzt TGGE sowohl Mobilität (Größeninformation) als auch temperaturinduzierte strukturelle Übergänge von DNA-Fragmenten (sequenzabhängige Information) und ist damit ein leistungsfähiger Ansatz zur Charakterisierung von DNA-Fragmenten. Die Merkmalspunkte in einem TGGE-Schmelzmuster, die drei strukturellen Übergängen des DNA-Moleküls entsprechen, sind der Stranginitialdissoziationspunkt, der Strangmitteldissoziationspunkt und der Strangenddissoziationspunkt (Abbildung 1). Sequenzvariationen innerhalb von Domänen, sogar Unterschiede bei Einzelbasen, beeinflussen die Schmelztemperatur, daher zeigen Moleküle mit unterschiedlichen Sequenzen diskrete Schmelzmuster (Denaturierungsmuster) in TGGE-Analysen. Daher kann TGGE zur Analyse von SNVs in genomischer RNA verwendet werden und kann eine unschätzbare Hochdurchsatzmethode zum Nachweis der RNA-Editierung sein. Dieser hohe Durchsatzgewinn geht verloren, wenn herkömmliches TGGE auf Gelelektrophoresebasis verwendet wird. Eine miniaturisierte Version von TGGE, genannt microTGGE (μTGGE), kann jedoch verwendet werden, um die gelelektrophoretische Zeit zu verkürzen und die Analyse mit einer 100-fachen Produktivitätssteigerung^{zu beschleunigen 11}. Die Einfachheit und Kompaktheit der μTGGE-Methode wurde durch die Einführung von PalmPAGE¹², einem praxistauglichen, tragbaren und erschwinglichen Gelelektrophoresesystem, verbessert.

Hier wird ein neues TGGE-basiertes Protokoll verwendet, um drei Arten von RNA-Editierstellen (A-zu-I, C-zu-U und U-zu-C) in vier Genen zu untersuchen, darunter zwei aus Arabidopsis thaliana-Geweben und zwei in HEK293-Zellen von Säugetieren exprimiert (Abbildung 1A). Das Protokoll integriert die Verwendung von PalmPAGE (Hardware), einem tragbaren System zur schnellen Detektion von RNA-Editierung, und uMelt (Software)¹³. Mit einer durchschnittlichen Laufzeit von 15-30 min ermöglicht dieses Protokoll eine schnelle, zuverlässige und einfache Identifizierung der RNA-Bearbeitung, ohne dass direkte RNA-Sequenzierungsansätze erforderlich sind.

Protokoll

1. Optimierung des Zielfragments

HINWEIS: Vier editierte Gene wurden bei der Entwicklung dieses Protokolls verwendet, darunter zwei Kerngene (AT2G16586 und AT5G02670) von A. thaliana und die Gene, die für blau fluoreszierendes Protein (BFP) und Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) kodieren, die in HEK293-Zellen exprimiert werden.

1. Um Genfragmente mit unterschiedlichen Schmelzprofilen zu identifizieren, die bearbeitete und nicht bearbeitete Bereiche darstellen, generieren Sie vorhergesagte Schmelzkurven mit dem webbasierten Tool uMelt HETS, einer Erweiterung der ursprünglichen uMelt-Software¹³.
   HINWEIS: Dieses Tool sagt die Formen von Schmelzkurven für Heteroduplex- und Homoduplex-Produkte voraus.
2. Entwerfen Sie für jedes Zielgen drei Paare von Genfragmenten (300-324 bp lang). Jedes Paar besteht aus einem Fragment mit einer bearbeiteten Stelle und einem entsprechenden Wildtypfragment mit einer nicht bearbeiteten Stelle, die sich entweder am 5'-terminalen, mittleren oder 3'-terminalen Ende befindet.
3. Wählen Sie das nicht bearbeitete/bearbeitete Paar aus, das die maximale Differenz zwischen den Schmelzbereichen auf der Helizitätsachse für weitere Analysen zeigte. Für die μTGGE-Analyse wird das ausgewählte Genfragment durch PCR-Amplifikation synthetisiert, wie in Abschnitt 2 unten beschrieben.
4. Entwerfen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer mit der DNADynamo-Software (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) und verifizieren Sie sie mit dem NCBI Primer-BLAST-Tool.
5. Verdünnen Sie die Primer in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl mit 1 mM EDTA· Na₂) und lagern Sie sie in einer Konzentration von 100 pmol/μL. Vor der Verwendung verdünnen Sie jeden Primer mit destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 10 pmol/μL.

2. RNA-Extraktion und RT-PCR-Amplifikation des Zielfragments

1. RNA-Extraktion
   1. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus der Quelle der editierten und nicht editierten Gene mit Standardmethoden wie TRIzol-Extraktion¹⁴ oder kommerziell erhältlichen Kits.
   2. Führen Sie die Synthese der entsprechenden cDNA unter Verwendung eines Standard-RT-PCR-Protokolls durch, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
2. Reverse Transkription
   1. Fügen Sie 1 μL Oligo(dT)-Primer, 1 μL 10 mM dNTP-Mischung, 10 μL Gesamt-RNA und 10 μL steriles destilliertes Wasser zu einem nukleasefreien Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.
   2. Die Mischung 5 min bei 65 °C erhitzen und dann mindestens 1 min auf Eis inkubieren.
   3. Sammeln Sie den Inhalt des Röhrchens durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit (12.000 x g) für 2-3 s und fügen Sie 4 μL 5x ReverTra Ace-Puffer, 1 μL 0,1 M DTT und 1 μL M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transkriptase (200 U/μL, Materialverzeichnis) hinzu.
   4. Mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Wenn Sie zufällige Primer verwenden, inkubieren Sie das Rohr bei 25 ° C für 5 min.
   5. Inkubieren Sie das Rohr bei 55 °C für 60 min und inaktivieren Sie dann die Reaktion, indem Sie es 15 min lang bei 70 °C in einem digitalen Trockenbad/Blockheizgerät erhitzen.
   6. Messen Sie die Konzentration von cDNA mit einem Spektralphotometer und speichern Sie sie bei -25 °C.
3. PCR-Amplifikation und bestätigende Sequenzierung von Produkten
   1. Fügen Sie die folgenden Reagenzien zu einem nukleasefreien Mikrozentrifugenröhrchen hinzu: 4 μL 5x Taq-Polymerase-Puffer, 2 μL 2 mM dNTP-Mix, 2 μL 25 mM_MgCl2, 1,6 μL des Primersatzes (vorwärts und rückwärts; jeweils 10 mM), 2 μL cDNA-Vorlage, 0,1 μL Taq-Polymerase (2,5 U/μL) und 8,3 μL steriles destilliertes Wasser (Endvolumen, 20 μL).
   2. Führen Sie eine PCR unter folgenden zyklischen Bedingungen durch: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 2 min; 35 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 2 min, Glühen bei einer geeigneten Temperatur (abhängig vom verwendeten spezifischen Primersatz) für 30 s und Verlängerung bei 72 °C für 2 min; und dann eine letzte Verlängerung bei 72 °C für 7 min.
   3. Um die PCR-Produkte zu reinigen, fügen Sie 2 U Exonuklease I und 0,5 HE Garnelen-alkalische Phosphatase (ExoSAP) hinzu. Inkubieren Sie das Rohr in einem Thermocycler bei 37 °C für 1 h, gefolgt von 80 °C für 15 min, und halten Sie es dann bis zum nächsten Schritt bei 4 °C.
   4. Zur bestätigenden Sequenzierung fügen Sie 11,5 μl steriles destilliertes Wasser, 2,5 μL Vorwärts- oder Rückwärtsprimer und 1 μL PCR-Produkte (mit ExoSAP) zu einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.
      HINWEIS: Verwenden Sie DNA-Sequenzierungsdienste (z. B. Eurofins Genomics) für die Sequenzierungsanalyse.
   5. Um die Spezifität der PCR-Produkte zu validieren, führen Sie eine Sequenzierung mit Vorwärts- und Rückwärtsprimern durch. Die in der repräsentativen Analyse verwendeten Primerpaare sind in Tabelle 1 aufgeführt.
   6. Die gereinigten PCR-Produkte mit entionisiertem Wasser auf eine Konzentration von 200 ng/μL verdünnen. Als nächstes mischen Sie 6 μL des gereinigten Produkts mit 3 μL 6x Gel-Belastungsfarbstoff in einem 250-μL-Röhrchen und erhöhen das Gesamtvolumen mit sterilem Wasser auf 12 μL. Lagern Sie das PCR-Produkt (bei -25 °C), bis es wie unten beschrieben mit μTGGE fortfahren kann.

3. μTGGE-Analyse

HINWEIS: Die μTGGE-Analyse wird unter Verwendung eines miniaturisierten und wirtschaftlichen Systems durchgeführt. Eine Übersicht über das gesamte System, einschließlich der Gelkassetten, des Gelkassettenhalters, der horizontalen Gelelektrophoreseplattform, des Netzteils und des Gelbildgebungssystems, ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Montage der Gelkassetten
   1. Die für die μTGGE-Analyse verwendete Gelkassette ist in Abbildung 2A dargestellt. Das Design besteht aus drei 1-Zoll-Gelplatten: einer unteren Gelplatte, einer oberen Gelplatte und einer Lane-Former-Platte. Sandwichen Sie die obere Gelplatte zwischen die anderen beiden Platten und montieren Sie sie im Gelkassettenhalter für die Gelpolymerisation.
2. Polyacrylamid-Gel-Zubereitung
   1. 7,2 g Harnstoff in ein 50-ml-Röhrchen geben und in 10 ml sterilem Wasser auflösen. Erhitzen Sie die Probe in einer Mikrowelle für 20-30 s und bringen Sie sie dann auf Raumtemperatur (RT).
   2. Zugabe von 3 ml 5x Tris/Borat/EDTA (TBE)-Puffer (Tabelle der Materialien), 2,25 ml 40% (w/v) Acrylamid/bis (19:1), 75 μL 10x Ammoniumpersulfat und 15 μL Tetramethylethylendiamin zur Lösung.
   3. Gießen Sie die Gellösung sofort langsam in den Gelkassettenhalter, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
3. Generierung von Schmelzprofilen mit der μTGGE-Einheit
   1. Verwenden Sie die miniaturisierte, wirtschaftliche Version der in Abbildung 2 gezeigten μTGGE-Apparatur mit einem Temperaturgradienten (25-65 °C), der senkrecht zur Richtung der DNA-Migration eingestellt ist.
   2. Weichen Sie die oberen und unteren Elektrophorese-Pufferpads (0,5 cm x 2,5 cm) in 2 ml 1x TBE-Puffer ein.
   3. Setzen Sie die Gelkassette in die horizontale Elektrophoresekammereinheit ein und positionieren Sie die oberen und unteren Pufferpads entsprechend, wie in Abbildung 2 dargestellt.
   4. Als nächstes laden Sie 10 μL des PCR-Produkts in die mittlere (längere) Vertiefung und 1 μL des PCR-Produkts in jede Seitenvertiefung.
   5. Schließen Sie nach einer 1-minütigen Wartezeit das Netzteil an und versorgen Sie 100 V für 12 Minuten bei einem linearen Temperaturgradienten von 25-65 °C.
   6. Nachdem der Lauf beendet ist, nehmen Sie die Kassette heraus und entfernen Sie die obere Glasabdeckung.
   7. Gießen Sie 300 μL 10x SYBR Gold Fleck auf das Gel. Visualisieren Sie die Schmelzprofile mit der blauen LED-Taschenlampe, die in dem handtellergroßen elektrophoretischen Gerät installiert ist.
      HINWEIS: Eine Soft-Datei des Gelbildes sollte für die Berechnung des Pattern Similarity Score (PaSS) gespeichert werden.
   8. Wiederholen Sie jedes elektrophoretische Experiment 3x, um die Reproduzierbarkeit der Daten zu bestätigen.

4. PaSS-Berechnungen

HINWEIS: Die Berechnungen werden mit der Software μTGGE Analyzer durchgeführt.

1. Laden Sie die Software herunter und öffnen Sie sie.
2. Öffnen Sie die JPEG-Datei, die das Gelbild enthält. Beachten Sie, dass die Software nur Dateien im JPEG-Format akzeptiert.
3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Rahmen und wählen Sie den entsprechenden Bereich ( Rahmen ) des Gelbildes aus.
4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Koordinatenkorrektur , und fügen Sie zwei Referenzpunkte hinzu, wie in Abbildung 1B dargestellt.
5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Feature Points hinzufügen , und fügen Sie Beispielpunkte hinzu, wie in Abbildung 1B dargestellt. Speichern Sie anschließend die verarbeiteten Gelbilddaten im μTGGE (*.tgg)-Format.
6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Beispiel und wählen Sie die Option Nach einfachen Punkten suchen aus, um zwei oder mehr Bilder zu vergleichen.

Ergebnisse

Verwendung von μTGGE zur Identifizierung einzelner Nukleotidbasenänderungen in RNA-Editierungsereignissen
Für dieses Protokoll wurden vier editierte Gene verwendet (Tabelle 1), darunter das BFP-Gen, das in HEK293-Zellen produziert wird (mit C-zu-U-RNA-Editierung durch die Deaminase-Enzyme des Apolipoproteins B mRNA-Editierenzymkomplexes; APOBEC1¹⁵), das EGFP-Gen, das das ockerfarbene Stop Codon (TAA) enthält, das in HEK293-Zellen produziert wird (mit A-zu-I...

Diskussion

RNA-Editieren spielt eine wichtige Rolle in der Biologie; Aktuelle Methoden zum Nachweis der RNA-Editierung, wie Chromatographie und Sequenzierung, stellen jedoch aufgrund ihrer hohen Kosten, ihres übermäßigen Zeitaufwands und ihrer Komplexität mehrere Herausforderungen dar. Das hier beschriebene Protokoll ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zum Nachweis der RNA-Bearbeitung, die ein tragbares, mikroskaliertes, TGGE-basiertes System verwendet. Dieses System kann verwendet werden, um vor der Sanger-...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2U ExoI	Takara	2650A	Exonuclease I
40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)	Thermo fisher	AM9022
Ammonium persulfate (APS)	Thermo Fisher	17874
Centrifuge Mini spin	eppendorf	5452000034
Digital dry bath/ block heater	Thermo fisher	NA
Gold Taq Polymerase Master mixture	Promega	M7122
LATaq DNA polymerase	TAKARA	RR002A	Taq Polymerase
micro-TGGE  cassette holder	BioSeeds Corp.	BS-GE-CH
micro-TGGE apparatus	Lifetech Corp.	TG
micro-TGGE gel cassette	BioSeeds Corp.	BS-TGGE-C
NanoDrop 1000	Thermo fisher	ND-1000	Spectrophotometer
Plant Rneasy Mini kit	Qiagen	74904
ReverTra Ace Master Mix	TOYOBO	TRT101	M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104
Shrimp Alkaline Phosphatase	Takara	2660B
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Thermo fisher	S11494
TBE buffer	Thermo fisher	B52
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Nacalai tesque	33401-72
Urea, Nuclease and protease tested	Nacalai tesque	35940-65