一种快速检测RNA编辑的无序列方法

摘要

在基因组尺度上快速检测和可靠地定量RNA编辑事件仍然具有挑战性，目前依赖于直接RNA测序方法。这里描述的实验方案使用微温梯度凝胶电泳（μTGGE）作为检测RNA编辑的简单，快速和便携式方法。

摘要

RNA编辑是导致RNA转录后序列改变的过程。RNA编辑的检测和定量主要依赖于Sanger测序和RNA测序技术。但是，这些方法可能成本高昂且耗时。在该协议中，便携式微温梯度凝胶电泳（μTGGE）系统被用作快速检测RNA编辑的非测序方法。该过程基于电泳原理，当核酸样品在聚丙烯酰胺凝胶上移动时，该原理使用高温使核酸样品变性。在一定温度范围内，DNA片段形成完全双链DNA到部分分离链的梯度，然后形成完全分离的单链DNA。具有不同核苷酸碱基的RNA编辑位点在μTGGE分析中产生不同的熔解谱。我们使用基于μTGGE的方法表征四个编辑RNA片段的熔解谱与其相应的未编辑（野生型）片段之间的差异。通过比较编辑和未编辑的RNA产生的条带模式来计算模式相似性评分（PaSSs），并用于评估该方法的再现性。总体而言，此处描述的平台能够以直接，简单且经济高效的方式检测RNA中的单个碱基突变。预计该分析工具将有助于新的分子生物学发现。

引言

基因组RNA中的单核苷酸变异（SNVs），包括A-to-I，C-to-U和U-to-C变体，可以指示RNA编辑事件。然而，在RNA中检测SNV仍然是一项技术上具有挑战性的任务。传统上，编辑与未编辑的RNA的比例是通过直接测序，等位基因特异性实时聚合酶链反应（PCR）或变性高效液相色谱（HPLC）方法^1，2，^{3，4，5，6}来确定的。然而，这些方法并不是特别具有时间或成本效益，并且由高水平噪声引起的低准确性为基于RNA的SNV^检测7，8带来了技术瓶颈。在这里，我们描述了一种基于温度梯度凝胶电泳（TGGE）的方案，以鉴定单核苷酸多态性（SNP）作为替代方法，无需直接RNA测序方法进行RNA编辑分析。

电泳是生命科学实验室中分离和分析生物分子的首选方法。TGGE能够分离大小相同但具有不同序列的双链DNA片段。该技术依赖于DNA片段熔化温度的序列相关差异以及随后其在线性温度梯度^为9，10的多孔凝胶中迁移率的变化。DNA片段的熔化产生特定的熔解谱。一旦熔融温度最低的结构域在凝胶中的特定位置达到相应的温度，就会发生从螺旋结构到部分熔化结构的转变，分子的迁移实际上将停止。因此，TGGE利用DNA片段的迁移率（尺寸信息）和温度诱导的结构转变（序列依赖性信息），使其成为表征DNA片段的强大方法。TGGE熔化模式中的特征点对应于DNA分子的三个结构转变，它们是链初始解离点，链中间解离点和链末端解离点（图1）。结构域内的序列变化，甚至是单碱基差异，都会影响熔化温度，因此，具有不同序列的分子在TGGE分析中将显示离散的熔化（变性）模式。因此，TGGE可用于分析基因组RNA中的SNV，并且可以成为检测RNA编辑的宝贵高通量方法。当使用传统的基于凝胶电泳的TGGE时，这种高通量增益会丢失。然而，TGGE的小型化版本，称为microTGGE（μTGGE），可用于缩短凝胶电泳时间并加速分析，使生产率提高100倍¹¹。μTGGE方法的简单性和紧凑性通过引入PalmPAGE 12得到了改善，PalmPAGE¹²是一种现场适用，手持式且价格合理的凝胶电泳系统。

在这里，一种新的基于TGGE的方案用于检查四个基因中的三种类型的RNA编辑位点（A-to-I，C-to-U和U-to-C），包括拟 南 芥组织中的两种和两种在哺乳动物HEK293细胞中表达的RNA编辑位点（图1A）。该协议集成了PalmPAGE（硬件）和uMelt（软件）¹³的使用，PalmPAGE是一种用于快速检测RNA编辑的便携式系统。该方案的平均运行时间为15-30分钟，可实现快速、可靠和轻松的RNA编辑鉴定，而无需直接的RNA测序方法。

研究方案

1. 目标片段的优化

注意：在该协议的开发中使用了四个编辑基因，包括来自 拟南芥的两个核基因（AT2G16586和AT5G02670），以及在HEK293细胞中表达的编码蓝色荧光蛋白（BFP）和增强绿色荧光蛋白（EGFP）的基因。

1. 为了识别具有不同熔解谱的基因片段，代表编辑区域与非编辑区域，使用基于web的uMelt HETS工具（原始uMelt软件¹³的扩展）生成预测的熔解曲线。
   注意：此工具可预测异源双相和同种双相产物的熔解曲线形状。
2. 对于每个靶基因，设计三对基因片段（长度为300-324 bp）。每对包含一个具有编辑位点的片段和一个具有非编辑位点的相应野生型片段组成，该片段位于5'末端，中间位置或3'终端端。
3. 选择在螺旋度轴上显示熔化区域之间最大差异的非编辑/编辑对，以进行进一步分析。对于μTGGE分析，通过PCR扩增合成选定的基因片段，如下文第2节所述。
4. 使用DNADynamo软件（https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm）设计正向和反向引物，并使用NCBI引物-BLAST工具进行验证。
5. 在TE缓冲液中稀释引物（10 mM Tris-HCl，含1 mM EDTA·Na₂）并将其储存在100 pmol / μL的浓度下，使用蒸馏水将每个引物稀释至10 pmol / μL的浓度。

2. 靶片段的RNA提取和RT-PCR扩增

1. 核糖核酸提取
   1. 使用标准方法（例如 TRIzol 提取¹⁴ 或市售试剂盒）从编辑和未编辑基因的来源中提取总 RNA。
   2. 使用步骤2.2中所述的标准RT-PCR方案进行相应cDNA的合成。
2. 反转录
   1. 向无核酸酶微量离心管中加入1μL寡核苷酸（dT）引物，1μL 10mM dNTP混合物，10μL总RNA和10μL无菌蒸馏水。
   2. 将混合物在65°C下加热5分钟，然后在冰上孵育至少1分钟。
   3. 通过以最大速度（12，000× g）离心2-3秒收集管的内容物，并加入4μL的5x ReverTra Ace缓冲液，1μL的0.1M DTT和1μL的M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）逆转录酶（200 U / μL， 材料表）。
   4. 轻轻地上下移液混合。如果使用随机引物，将试管在25°C下孵育5分钟。
   5. 将管在55°C下孵育60分钟，然后通过在70°C下加热15分钟，在数字干浴/块加热器中灭活反应。
   6. 使用分光光度计测量cDNA的浓度并将其储存在-25°C。
3. 产物的PCR扩增和确认测序
   1. 将以下试剂加入无核酸酶的微量离心管中：4 μL 5x Taq聚合酶缓冲液，2 μL 2 mM dNTP混合物，2 μL 25 mM MgCl₂，1.6 μL引物集（正向和反向;每个10 mM），2 μL cDNA模板，0.1μL Taq聚合酶（2.5 U / μL）和8.3μL无菌蒸馏水（最终体积， 20微升）。
   2. 在以下循环条件下进行PCR：在95°C下初始变性2分钟;在95°C下变性35次循环2分钟，在合适的温度下退火（取决于所使用的特定引物集）30秒，并在72°C下延伸2分钟;然后在72°C下最终延伸7分钟。
   3. 为了纯化PCR产物，加入2 U的Exonuclease I和0.5 U的虾碱性磷酸酶（ExoSAP）。将管在37°C的热循环仪中孵育1小时，然后在80°C下孵育15分钟，然后保持在4°C直至下一步。
   4. 对于确证测序，向新的微量离心管中加入11.5μL无菌蒸馏水，2.5μL正向或反向引物以及1μLPCR产物（使用ExoSAP）。
      注意：使用DNA测序服务（例如，Eurofins Genomics）进行测序分析。
   5. 为了验证PCR产物的特异性，使用正向和反向引物进行测序。代表性分析中使用的引物对在 表1中给出。
   6. 用去离子水将纯化的PCR产物稀释至200ng / μL的浓度。接下来，将6μL纯化产物与250μL管中的3μL6x凝胶上样染料混合，并用无菌水将总体积提高至12μL。将PCR产物储存（在-25°C下），直到准备使用μTGGE，如下所述。

3. 微断层分析

注意：μTGGE分析是使用小型化和经济的系统进行的。整个系统概述，包括凝胶盒、凝胶盒支架、水平凝胶电泳平台、电源和凝胶成像系统， 如图2所示。

1. 凝胶盒的组装
   1. 用于μTGGE分析的凝胶盒如图 2A所示。该设计由三个1英寸凝胶板组成：一个底部凝胶板，一个顶部凝胶板和一个通道形成板。将顶部凝胶板夹在另外两个板之间，并组装在凝胶盒支架中以进行凝胶聚合。
2. 聚丙烯酰胺凝胶制备
   1. 向50 mL管中加入7.2g尿素，并溶解在10mL无菌水中。在微波炉中加热样品20-30秒，然后将其带到室温（RT）。
   2. 向溶液中加入3 mL 5x Tris/Borate/EDTA （TBE） 缓冲液（材料表），2.25 mL 40% （w/v） 丙烯酰胺/双 （19：1）、75 μL 10x 过硫酸铵和 15 μL 四甲基乙二胺。
   3. 立即将凝胶溶液缓慢倒入凝胶盒支架中，避免形成气泡。
3. 使用μTGGE单元生成熔解剖面
   1. 使用 图2 所示的μTGGE装置的小型化经济型版本，其温度梯度（25-65°C）垂直于DNA迁移方向。
   2. 将上部和下部电泳缓冲液垫（0.5 cm x 2.5 cm）浸泡在2 mL 1x TBE缓冲液中。
   3. 将凝胶盒置于水平电泳室单元中，并相应地放置上下缓冲垫，如图 2所示。
   4. 接下来，将10μLPCR产物装入中间（较长的）孔中，将1μLPCR产物装入每侧孔中。
   5. 等待1分钟后，连接电源单元并在25-65°C的线性温度梯度下供应100 V 12分钟。
   6. 运行完成后，取出暗盒并取下上部玻璃盖。
   7. 将300μL10x SYBR金染色剂倒入凝胶上。使用安装在手掌大小的电泳设备中的蓝色LED手电筒可视化熔化曲线。
      注意：应保存凝胶图像的软文件，以便计算模式相似性评分（PaSS）。
   8. 重复每个电泳实验3次，以确认数据的可重复性。

4. 帕斯卡计算

注：计算是使用μTGGE分析仪软件执行的。

1. 下载并打开软件。
2. 打开包含凝胶图像的 JPEG 文件。请注意，该软件将只接受JPEG格式的文件。
3. 单击 “镜架 ”按钮，然后选择凝胶图像的相应区域（镜架）。
4. 单击 坐标校正 按钮并添加两个参考点，如图 1B所示。
5. 单击“ 添加特征点 ”按钮并添加采样点，如图 1B 所示。然后将处理后的凝胶图像数据保存为μTGGE（*.tgg）格式。
6. 单击“ 示例 ”按钮，然后选择“ 搜索简单点 ”选项以比较两个或多个图像。

结果

使用μTGGE鉴定RNA编辑事件中的单核苷酸碱基变化
该方案使用了四个编辑基因（表1），包括在HEK293细胞中产生的BFP基因（通过载脂蛋白B mRNA编辑酶复合物的脱氨酶进行C-to-U RNA编辑;APOBEC1¹⁵），含有HEK293细胞中产生的赭色终止密码子（TAA）的EGFP基因（通过腺苷脱氨酶作用于RNA 1进行A-to-I RNA编辑）;ADAR1¹⁶），以及拟南芥17^，1...

讨论

RNA编辑在生物学中起着重要作用;然而，目前检测RNA编辑的方法，如色谱和测序，由于其高成本，过多的时间要求和复杂性，提出了一些挑战。这里描述的实验方案是一种简单，快速且经济高效的RNA编辑检测方法，它使用便携式，微型尺寸，基于TGGE的系统。该系统可用于在Sanger测序之前区分编辑和非编辑基因。具体而言，具有单碱基核苷酸修饰的编辑和未编辑基因可以根据TGGE熔解谱的变化进行区?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2U ExoI	Takara	2650A	Exonuclease I
40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)	Thermo fisher	AM9022
Ammonium persulfate (APS)	Thermo Fisher	17874
Centrifuge Mini spin	eppendorf	5452000034
Digital dry bath/ block heater	Thermo fisher	NA
Gold Taq Polymerase Master mixture	Promega	M7122
LATaq DNA polymerase	TAKARA	RR002A	Taq Polymerase
micro-TGGE  cassette holder	BioSeeds Corp.	BS-GE-CH
micro-TGGE apparatus	Lifetech Corp.	TG
micro-TGGE gel cassette	BioSeeds Corp.	BS-TGGE-C
NanoDrop 1000	Thermo fisher	ND-1000	Spectrophotometer
Plant Rneasy Mini kit	Qiagen	74904
ReverTra Ace Master Mix	TOYOBO	TRT101	M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104
Shrimp Alkaline Phosphatase	Takara	2660B
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Thermo fisher	S11494
TBE buffer	Thermo fisher	B52
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Nacalai tesque	33401-72
Urea, Nuclease and protease tested	Nacalai tesque	35940-65