JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة جراحية موحدة لنموذج AAA الناجم عن الإيلاستاز من خلال التطبيق المباشر للإيلاستاز على أدفينتيتيا الشريان الأورطي البطني اللعينى في الفئران.

Abstract

تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني (AAA) ، على الرغم من أنه بدون أعراض في المقام الأول ، يحتمل أن يهدد الحياة لأن تمزق AAA عادة ما يكون له نتيجة مدمرة. حاليا ، هناك العديد من النماذج التجريبية المتميزة ل AAA ، كل منها يؤكد على جانب مختلف في التسبب في AAA. نموذج AAA الناجم عن الإيلاستاز هو ثاني أكثر نماذج AAA استخداما للقوارض. يتضمن هذا النموذج التسريب المباشر أو تطبيق elastase البنكرياس الخنازير (PPE) على الجزء الرقيق من الشريان الأورطي. نظرا للتحديات التقنية ، يتم تنفيذ معظم نماذج AAA التي يسببها الإيلاستاز في الوقت الحاضر باستخدام التطبيق الخارجي بدلا من التسريب داخل اللمعان لمعدات الوقاية الشخصية. سيؤدي تسلل الإيلاستاز إلى تدهور الصفائح المرنة في الطبقات الإنسية ، مما يؤدي إلى فقدان سلامة جدار الأبهر والتمدد اللاحق للشريان الأورطي البطني. ومع ذلك ، فإن أحد عيوب نموذج AAA الناجم عن الإيلاستاز هو الاختلاف الحتمي لكيفية إجراء الجراحة. على وجه التحديد ، يمكن أن تكون التقنية الجراحية لعزل الجزء اللعابي من الشريان الأورطي ، والمواد المستخدمة في تغليف الشريان الأورطي وحضانة معدات الوقاية الشخصية ، والنشاط الأنزيمي لمعدات الوقاية الشخصية ، والمدة الزمنية لتطبيق معدات الوقاية الشخصية ، كلها محددات مهمة تؤثر على معدل تكوين AAA النهائي وقطر تمدد الأوعية الدموية. والجدير بالذكر أن الاختلاف في هذه العوامل من الدراسات المختلفة حول AAA يمكن أن يؤدي إلى قضايا التكاثر. توضح هذه المقالة عملية جراحية مفصلة لنموذج AAA الناجم عن الإيلاستاز من خلال التطبيق المباشر لمعدات الوقاية الشخصية على أدفنتيتيا الشريان الأورطي البطني اللعابي في الماوس. بعد هذا الإجراء ، يمكن تحقيق معدل تكوين AAA مستقر يبلغ حوالي 80٪ في الفئران الذكور والإناث. يمكن تعزيز اتساق وقابلية تكرار دراسات AAA باستخدام نموذج AAA الناجم عن الإيلاستاز بشكل كبير من خلال إنشاء إجراء جراحي قياسي.

Introduction

يعرف تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني (AAA) بأنه توسع قطاعي للشريان الأورطي البطني مع زيادة بنسبة 50٪ على الأقل في قطر الوعاء1. AAA من المحتمل أن تكون قاتلة ، حيث يمكن أن يؤدي التمزق إلى معدل وفيات مرتفع للغاية ، حتى مع التدخل2،3،4. وقد أفيد أن AAA مسؤولة عن ما يقرب من 13000 حالة وفاة سنويا في الولايات المتحدة الأمريكية ، مما يجعلها السبب الرئيسيالعاشر للوفاة 1,5.

لم يتم بعد فهم التسبب في AAA بالكامل 6,7,8. للتحقيق في الآلية الجزيئية ل AAA واختبار الأهداف العلاجية المحتملة ، تم إنشاء العديد من نماذج AAA التجريبية 9,10. تشمل نماذج القوارض من AAA نماذج الإيلاستاز وكلوريد الكالسيوم والأنجيوتنسين II و xenograft ، من بينها نموذج AAA الناجم عن الإيلاستاز هو ثاني أكثر النماذج استخداما 10،11،12،13،14،15،16،17. يتضمن هذا النموذج التسريب المباشر أو تطبيق elastase البنكرياس الخنازير (PPE) على الجزء الرقيق من الشريان الأورطي. سيؤدي تغلغل الإيلاستاز في الطبقة الإنسية من الشريان الأورطي إلى تدهور الصفائح المرنة وتسلل الخلايا الالتهابية ، مما يؤدي إلى فقدان سلامة جدار الأبهر والتمدد اللاحق للشريان الأورطي البطني 7,18. تم الإبلاغ عن نموذج AAA الناجم عن الإيلاستاز لأول مرة من قبل Anidjar et al. في عام 1990 باستخدام الفئران ، حيث تم اختراق جزء معزول من الشريان الأورطي مع elastase17. في وقت لاحق من عام 2012 ، تم الإبلاغ عن نموذج معدل باستخدام تطبيق حول المعاصرة لمعدات الوقاية الشخصية من قبل Bhamidipati et al.19. في الوقت الحاضر ، فإن معظم العمليات الجراحية لنموذج AAA الناجم عن الإيلاستاز مستوحاة من مجموعة Bhamidipati ويتم إجراؤها باستخدام التطبيق الخارجي بدلا من التروية داخل اللمعان لمعدات الوقاية الشخصية. على الرغم من أن التطبيق الخارجي لديه متطلبات أقل على المهارات الجراحية الدقيقة ، إلا أن معدل حدوث AAA أقل نسبيا وحجم أصغر إلى حد ما من التروية داخل اللمعان11,19.

على الرغم من استخدامه على نطاق واسع في دراسات AAA ، إلا أن نموذج AAA الناجم عن الإيلاستاز يمتلك قيودا معينة. أحد التحذيرات من هذا النموذج هو الاختلافات الحتمية في كيفية إجراء الجراحة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى مسألة التكاثر. على سبيل المثال ، قد يوجد اختلاف في الإجراء الجراحي فيما يتعلق بكيفية عزل الجزء اللعابي من الشريان الأورطي وأي جزء من الجزء يتم اختياره لتطبيق معدات الوقاية الشخصية بين المختبرات المختلفة. يمكن أن يختلف النشاط الأنزيمي لمعدات الوقاية الشخصية والمدة الزمنية لحضانة معدات الوقاية الشخصية. ومع ذلك ، فإن هذه كلها محددات أساسية تؤثر على معدل تكوين AAA النهائي وقطر تمدد الأوعية الدموية. إن اختلاف هذه المحددات الحرجة يجعل مقارنة بيانات دراسات AAA من مجموعات مختلفة باستخدام هذا النموذج صعبة للغاية. لذلك ، هناك حاجة إلى إجراء جراحي موحد كأداة للحصول على نتائج قابلة للمقارنة من مختلف المؤسسات.

توضح هذه المقالة بروتوكولا جراحيا موحدا لنموذج AAA الناجم عن الإيلاستاز من خلال التطبيق المباشر لمعدات الوقاية الشخصية على Adventitia من الشريان الأورطي البطني داخل الكلوي في الفئران. كما ستتم مناقشة التفاصيل حول المواد الجراحية والإجراءات الضرورية لتوليد AAA بنجاح وقوة في الفئران باستخدام هذا النموذج.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة جامعة ميشيغان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (PRO00010092). تم استخدام الفئران من النوع البري C57BL/6J من الذكور والإناث ، ~ 7 أسابيع من العمر ، لإجراء التجارب.

1. إعداد الحيوان

  1. إطعام الفئران مع النظام الغذائي تشاو القياسية (انظر جدول المواد) قبل وبعد الجراحة.
    ملاحظة: يمكن استخدام سلالات وأعمار مختلفة من الفئران. ومع ذلك ، يوصى بالعمر الذي يتراوح بين 5.5 و 12 أسبوعا لتحقيق أقصى معدل للإصابة.
  2. لكل ماوس ، قم بإعطاء 5 ملغم / كجم من كاربروفين تحت الجلد قبل 30 دقيقة من تحريض التخدير.
  3. بعد 30 دقيقة ، قم بإعطاء 100 مجم / كجم من الكيتامين و 5 مجم / كجم من Xylazine عن طريق الحقن داخل الصفاق للحث على التخدير.

2. التحضير للجراحة

  1. تحضير المواد الجراحية.
    1. قطع قفازات النتريل إلى شرائح من 4 سم × 4 ملم. قطع منصات القطن إلى قطع من 3 سم × 2 ملم. قم بتعقيمها باستخدام أدوات جراحية أخرى ، بما في ذلك المقص الجراحي ، وملقط الأنسجة ، ومرقئ البعوض المهال (انظر جدول المواد).
  2. ضع الماوس في وضع ضعيف على وسادة ضمادة ماصة معقمة. شل حركة الكفوف الأمامية والخلفية مع الشريط الجراحي.
  3. استخدم أدوات تطبيق ذات رؤوس قطنية (انظر جدول المواد) لتنظيف غسول مزيل الشعر بالفرشاة على منطقة البطن الوسطى والسفلية ، ثم قم بمسح المنطقة بشاش جراحي لإزالة الشعر.
  4. قم بتطهير المنطقة الجراحية ثلاث مرات على الأقل في حركة دائرية مع تطبيقات متناوبة من الكحول بنسبة 70٪ وفرك قائم على اليود أو الكلورهيكسيدين. اتركيه حتى يجف.

3. إجراء الجراحة

  1. نفذ الخطوات التالية للوصول إلى تجويف البطن.
    1. اختبر الماوس لعدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم قبل شق الجلد.
    2. قم بعمل شق طولي 2.5 سم على الجلد على طول خط الوسط من البطن الأوسط والسفلي باستخدام مقص جراحي.
    3. اسحب العضلات الأساسية بلطف وقم بعمل شق طولي 2.5 سم على طول خط ألبا للوصول إلى تجويف البطن.
  2. كشف الشريان الأورطي البطني.
    1. استخدم أدوات تطبيق مبللة ذات رؤوس قطنية لتحريك الأمعاء والمعدة إلى الجانب الأيمن من الماوس.
      ملاحظة: من الناحية المثالية ، سيؤدي ذلك إلى كشف الجزء اللعينى من الشريان الأورطي. إذا كان من الصعب تحديد موقع الشريان الأورطي ، يمكن للكلية اليمنى والشريان الكلوي الأيمن تحديد الشريان الأورطي (حيث أن الكلى اليمنى لها موقع تشريحي أقل قليلا من الكلى اليسرى).
    2. استخدم الملقط لإزالة النسيج الضام الذي يغطي الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي (IVC) برفق.
      ملاحظة: يتم احتواء الشريان الأورطي البطني و IVC داخل نفس غمد الوعاء. من غير الضروري إزالة جميع الأنسجة الضامة لأن الإزالة الكاملة ستزيد من خطر إتلاف هاتين الوعاءين.
    3. استخدم الملقط لتشريح الجانب الخلفي من الشريان الأورطي البطني وIVC بلطف من العضلات الأساسية.
      ملاحظة: يجب أن تذهب أطراف الملقط إلى الجانب الخلفي من الغمد بشكل عرضي وتخلق ثقبا في اللفافة يربط الغمد بالعضلات الأساسية. بمجرد إجراء الثقب ، قم بتوسيع حجمه عن طريق إطلاق الملقط ببطء.
    4. ضع قطعة من شريط القفازات 4 سم × 4 مم (كما ذكرنا سابقا ، الخطوة 2.1.1) من خلال الجانب الخلفي من الشريان الأورطي البطني و IVC ، ثم قم بتصويب الشريط. ضع الشريط على بعد 0.5 سم تقريبا من الشريان الكلوي الأيمن.
      ملاحظة: تأكد من أن الثقب كبير بما فيه الكفاية بحيث لا تقوم اللفافة المحيطة بتحريف الشريط.
    5. فوق الشريط ، ضع قطعة من وسادة قطنية 3 سم × 2 مم من خلال الجانب الخلفي من الشريان الأورطي البطني و IVC ، ثم قم بتصويب وسادة القطن.
  3. احتضان الإيلاستاز.
    1. استخدم ماصة لإسقاط 30 ميكرولتر من elastase البنكرياس الخنزير (إجمالي النشاط الأنزيمي من 1.8 وحدة ، انظر جدول المواد) على جزء الشريان الأورطي فوق وسادة القطن ، ثم لف وسادة القطن والشريط حول الشريان الأورطي و IVC. شطف قطعة من الشاش 10 سم × 10 سم مع محلول ملحي معقم 0.9 ٪ ووضعها على البطن.
      ملاحظة: يحتاج الشاش إلى شطف جزئي فقط لأن المبالغة في العمل من شأنها أن تخاطر بتخفيف الإيلاستاز تحته.
    2. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة الشريط ووسادة القطن باستخدام الملقط.
  4. أغلق تجويف البطن باتباع الخطوات أدناه.
    1. ري الشريان الأورطي وتجويف البطن مع 500 ميكرولتر من محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪. استخدم شاشا 10 سم × 10 سم لامتصاص المياه المالحة المتبقية.
    2. إعادة تقريب طبقات العضلات مع تشغيل 6-0 خياطة أحادية الخيوط غير قابلة للامتصاص.
    3. أغلق الجلد ب 3-4 خيوط أحادية الخيوط غير قابلة للامتصاص 6-0 متقطعة.

4. رعاية ما بعد الجراحة

  1. إدارة 5 ملغ / كغ من كاربروفين تحت الجلد في اليوم 1 بعد الجراحة.
  2. إزالة خيوط الجلد في اليوم 10 بعد الجراحة.

5. قياس قطر تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني

  1. القتل الرحيم للفئران عن طريق جرعةزائدة من CO 2 في اليوم 14 بعد الجراحة. وهذا يمثل النقطة الزمنية للتوسع الأقصى.
  2. الوصول إلى تجويف البطن كما هو موضح في الخطوة 3.1.
  3. إجراء تروية الأوعية الدموية عن طريق حقن 10 مل من محلول ملحي بنسبة 0.9٪ في الدورة الدموية من خلال البطين الأيسر.
  4. كشف الجزء اللعينى من الشريان الأورطي البطني كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.2. قم بإزالة النسيج الضام المحيط بعناية وافصل الشريان الأورطي البطني عن IVC.
  5. قياس قطر الشريان الأورطي البطني مع الفرجار.

النتائج

تم تشغيل ما مجموعه ثلاثة وعشرين فأرا من النوع البري (WT) عمرها 7 أسابيع ، بما في ذلك 12 أنثى و 11 ذكرا ، وفقا للبروتوكول المعروض. كان معدل البقاء على قيد الحياة 100٪ (باستثناء الوفيات الجراحية). تم قياس أقصى قطر للشريان الأورطي البطني بواسطة الفرجار.

تم تعريف AAA على أنه توسيع الشريان...

Discussion

تم الإبلاغ عن نموذج AAA الناجم عن الإيلاستاز لأول مرة من قبل Anidjar et al. باستخدام الفئران في عام 199017. تم تقديم مجموعة متنوعة من الإصدارات المعدلة في السنوات الثلاثين الماضية ، إلى جانب تحسن كبير في التقنيات الجراحية19،20،21،22....

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر وحدة طب المختبر بجامعة ميشيغان على مساعدتها في تغذية الحيوانات وتربيتها. هذه الدراسة مدعومة من قبل NIH RO1 HL138139 ، NIH RO1 HL153710 إلى J. Zhang ، NIH RO1 HL109946 ، RO1 HL134569 إلى Y.E. Chen ، ومنحة جمعية القلب الأمريكية 20POST35110064 إلى G. Zhao.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6-0 non-absorbable monofilament suturePro AdvantageP420697
CarprofenZoetis Inc.NDC: 54771-8507
Chow DietLabDiet3005659-220PicoLab 5L0D
Cotton ApplicatorDynarex4303
Cotton PadRaelUPC: 810027130969
GraphPad Prism 8GraphPad Software Inc.Version 8.4.3
Grarfe ForcepsFine Science Tools11051-10
Halsted Mosquito HemostatsFine Science Tools13009-12
KetaminePar PharmaceuticalNDC: 42023-0115-10
Nitrile glovesFisherbrand19-130-1597
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher15140122
Porcine pancreatic elastaseSigma-AldrichE1250-100MG
ScissorsFine Science Tools14068-12
Sterile 0.9% saline solutionBaxter2B1324X
XylazineAkornNDC: 59399-110-20

References

  1. Kent, K. C. Clinical practice: Abdominal aortic aneurysms. The New England Journal of Medicine. 371 (22), 2101-2108 (2014).
  2. Karthikesalingam, A., et al. Mortality from ruptured abdominal aortic aneurysms: Clinical lessons from a comparison of outcomes in England and the USA. Lancet. 383 (9921), 963-969 (2014).
  3. Noel, A. A., et al. Ruptured abdominal aortic aneurysms: The excessive mortality rate of conventional repair. Journal of Vascular Surgery. 34 (1), 41-46 (2001).
  4. Lederle, F. A., et al. Rupture rate of large abdominal aortic aneurysms in patients refusing or unfit for elective repair. JAMA. 287 (22), 2968-2972 (2002).
  5. Kochanek, K. D., Xu, J., Murphy, S. L., Minino, A. M., Kung, H. C. Deaths: Final data for 2009. National Vital Statistics Reports. 60 (3), 1 (2011).
  6. Daugherty, A., Cassis, L. A. Mechanisms of abdominal aortic aneurysm formation. Current Atherosclerosis Reports. 4 (3), 222-227 (2002).
  7. Quintana, R. A., Taylor, W. R. Cellular mechanisms of aortic aneurysm formation. Circulation Research. 124 (4), 607-618 (2019).
  8. Kuivaniemi, H., Ryer, E. J., Elmore, J. R., Tromp, G. Understanding the pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 13 (9), 975-987 (2015).
  9. Trollope, A., Moxon, J. V., Moran, C. S., Golledge, J. Animal models of abdominal aortic aneurysm and their role in furthering management of human disease. Cardiovascular Pathology. 20 (2), 114-123 (2011).
  10. Patelis, N., et al. Animal models in the research of abdominal aortic aneurysms development. Physiological Research. 66 (6), 899-915 (2017).
  11. Senemaud, J., et al. Translational relevance and recent advances of animal models of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (3), 401-410 (2017).
  12. Lysgaard Poulsen, J., Stubbe, J., Lindholt, J. S. Animal models used to explore abdominal aortic aneurysms: A systematic review. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 52 (4), 487-499 (2016).
  13. Tsui, J. C. Experimental models of abdominal aortic aneurysms. Open Cardiovascular Medicine Journal. 4, 221-230 (2010).
  14. Manning, M. W., Cassi, L. A., Huang, J., Szilvassy, S. J., Daugherty, A. Abdominal aortic aneurysms: Fresh insights from a novel animal model of the disease. Vascular Medicine. 7 (1), 45-54 (2002).
  15. Chiou, A. C., Chiu, B., Pearce, W. H. Murine aortic aneurysm produced by periarterial application of calcium chloride. Journal of Surgical Research. 99 (2), 371-376 (2001).
  16. Allaire, E., Guettier, C., Bruneval, P., Plissonnier, D., Michel, J. B. Cell-free arterial grafts: Morphologic characteristics of aortic isografts, allografts, and xenografts in rats. Journal of Vascular Surgery. 19 (3), 446-456 (1994).
  17. Anidjar, S., et al. Elastase-induced experimental aneurysms in rats. Circulation. 82 (3), 973-981 (1990).
  18. Sun, J., et al. Mast cells modulate the pathogenesis of elastase-induced abdominal aortic aneurysms in mice. Journal of Clinical Investigation. 117 (11), 3359-3368 (2007).
  19. Bhamidipati, C. M., et al. Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase. Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).
  20. Pyo, R., et al. Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1641-1649 (2000).
  21. Tanaka, A., Hasegawa, T., Chen, Z., Okita, Y., Okada, K. A novel rat model of abdominal aortic aneurysm using a combination of intraluminal elastase infusion and extraluminal calcium chloride exposure. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1423-1432 (2009).
  22. Busch, A., et al. Four surgical modifications to the classic elastase perfusion aneurysm model enable haemodynamic alterations and extended elastase perfusion. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 56 (1), 102-109 (2018).
  23. Liang, W., et al. KLF11 protects against venous thrombosis via suppressing tissue factor expression. Thrombosis and Haemostasis. , (2021).
  24. Marinov, G. R., et al. Can the infusion of elastase in the abdominal aorta of the Yucatan miniature swine consistently produce experimental aneurysms. Journal of Investigative Surgery. 10 (3), 129-150 (1997).
  25. Shannon, A. H., et al. Porcine model of infrarenal abdominal aortic aneurysm. Journal of Visualized Experiments. (153), e60169 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved