Модель аневризмы брюшной аорты мыши, индуцированная периваскулярным применением эластазы

Резюме

Настоящий протокол описывает стандартизированный хирургический метод для модели ААА, индуцированной эластазой, путем прямого применения эластазы к адвентициям инфраренальной брюшной аорты у мышей.

Аннотация

Аневризма брюшной аорты (ААА), хотя в основном бессимптомная, потенциально опасна для жизни, поскольку разрыв ААА обычно имеет разрушительный результат. В настоящее время существует несколько различных экспериментальных моделей ААА, каждая из которых подчеркивает отдельный аспект патогенеза ААА. Модель ААА, индуцированная эластазой, является второй наиболее используемой моделью ААА грызунов. Эта модель включает прямую инфузию или применение эластазы поджелудочной железы свиней (СИЗ) к инфраренальному сегменту аорты. Из-за технических проблем большинство моделей ААА, индуцированных эластазой, в настоящее время выполняется с внешним применением, а не с внутрипросветной инфузией СИЗ. Инфильтрация эластазы вызовет деградацию эластических ламелей в медиальных слоях, что приведет к потере целостности стенки аорты и последующему расширению брюшной аорты. Однако одним из недостатков модели ААА, индуцированной эластазой, является неизбежное изменение способа проведения операции. В частности, хирургическая техника выделения инфраренального сегмента аорты, материал, используемый для обертывания аорты и инкубации СИЗ, ферментативная активность СИЗ и продолжительность применения СИЗ могут быть важными детерминантами, которые влияют на возможную скорость образования ААА и диаметр аневризмы. Примечательно, что разница в этих факторах из различных исследований ААА может привести к проблемам воспроизводимости. В этой статье подробно описан хирургический процесс модели ААА, индуцированной эластазой, путем прямого применения СИЗ к адвентиции инфраренальной брюшной аорты у мыши. После этой процедуры достижима стабильная скорость образования ААА около 80% у самцов и самок мышей. Согласованность и воспроизводимость исследований ААА с использованием модели ААА, индуцированной эластазой, может быть значительно улучшена путем установления стандартной хирургической процедуры.

Введение

Аневризма брюшной аорты (ААА) определяется как сегментарная дилатация брюшной аорты с увеличением диаметра сосуда¹ по меньшей мере на 50%. ААА потенциально смертельна, так как разрыв может привести к чрезвычайно высокому уровню смертности, даже при вмешательстве ^2,3,4. Сообщалось, что ААА несет ответственность примерно за 13 000 смертей в год в США, что делает его^10-й ведущей причиной смерти ^1,5.

Патогенез ААА еще не до конца изучен ^6,7,8. Для исследования молекулярного механизма ААА и тестирования потенциальных терапевтических мишеней было создано несколько экспериментальных моделей ААА ^9,10. Модели Грызунов ААА включают модели эластазы, хлорида кальция, ангиотензина II и ксенотрансплантата, среди которых модель ААА, индуцированная эластазой^, является второй наиболее используемой моделью ^{10,11,12,13,14,15,16,17}. Эта модель включает прямую инфузию или применение эластазы поджелудочной железы свиней (СИЗ) к инфраренальному сегменту аорты. Проникновение эластазы в медиальный слой аорты вызовет деградацию эластичных ламелей и инфильтрацию воспалительных клеток, что приведет к потере целостности стенки аорты и последующему расширению брюшной аорты ^7,18. Модель ААА, индуцированная эластазой, была впервые представлена Anidjar et al. в 1990 году с использованием крыс, у которых изолированный сегмент аорты был перфузирован эластазой¹⁷. Позже, в 2012 году, Bhamidipati et ^al.19 сообщили о модифицированной модели, использующей периадвентициальное применение СИЗ. В настоящее время большинство операций по модели ААА, индуцированной эластазой, вдохновлены группой Бхамидипати и выполняются с внешним применением, а не внутрипросветной перфузией СИЗ. Хотя внешнее применение имеет меньше требований к тонким хирургическим навыкам, уровень заболеваемости ААА относительно ниже и размер несколько меньше, чем у внутрипросветной перфузии^11,19.

Несмотря на то, что модель ААА широко используется в исследованиях ААА, индуцированная эластазой, обладает определенными ограничениями. Одним из предостережений этой модели являются неизбежные вариации того, как выполняется операция, что может привести к проблеме воспроизводимости. Например, в хирургической процедуре может существовать различие в отношении того, как изолирован инфраренальный сегмент аорты и какая часть сегмента выбрана для применения СИЗ среди различных лабораторий. Ферментативная активность СИЗ и продолжительность инкубации СИЗ также могут варьироваться. Все они, однако, являются существенными детерминантами, которые влияют на конечную скорость образования ААА и диаметр аневризмы. Изменение этих критических детерминант делает сравнение данных исследований ААА из разных групп с использованием этой модели очень трудным. Поэтому стандартизированная хирургическая процедура необходима в качестве инструмента для получения сопоставимых результатов от различных учреждений.

В этой статье описывается стандартизированный хирургический протокол для модели ААА, индуцированной эластазой, путем прямого применения СИЗ к адвентициям инфраренальной брюшной аорты у мышей. Также будут обсуждаться подробности о хирургическом материале и процедурах, необходимых для успешной и надежной генерации ААА у мышей, использующих эту модель.

протокол

Протоколы для животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Мичиганского университета (PRO00010092). Для экспериментов использовались самцы и самки мышей дикого типа C57BL/6J (WT), возраст ~ 7 недель.

1. Подготовка животных

1. Кормите мышей стандартной диетой чау-чау (см. Таблицу материалов) до и после операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать различные штаммы и возраст мышей. Тем не менее, возраст в диапазоне от 5,5 до 12 недель рекомендуется для достижения максимального уровня заболеваемости.
2. Каждой мышке вводят 5 мг/кг карпрофена подкожно за 30 мин до индукции анестезии.
3. Через 30 мин вводят 100 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина через внутрибрюшинную инъекцию, чтобы вызвать анестезию.

2. Подготовка к операции

1. Подготовьте хирургический материал.
   1. Нарежьте нитриловые перчатки полосками размером 4 см х 4 мм. Разрежьте ватные диски на кусочки по размеру 3 см х 2 мм. Автоклавируйте их с другими хирургическими инструментами, включая хирургические ножницы, тканевые щипцы и гемостаты Halsted-Mosquito (см. Таблицу материалов).
2. Поместите мышь в положение лежа на спине на стерильной абсорбирующей подушечке. Обездвижить передние и задние лапы хирургическим скотчем.
3. Используйте аппликаторы с ватными наконечниками (см. Таблицу материалов), чтобы расчесать лосьон для удаления волос над средней и нижней частью живота, а затем смазать область хирургической марлей для удаления волос.
4. Продезинфицируйте хирургическую область не менее трех раз круговыми движениями с чередованием применений 70% спирта и скраба на основе йода или хлоргексида. Дайте высохнуть.

3. Хирургическая процедура

1. Выполните следующие действия для доступа к брюшной полости.
   1. Проверьте мышь на отсутствие реакции на защемление пальца ноги перед разрезом кожи.
   2. Сделайте продольный разрез 2,5 см на коже по средней линии средней и нижней части живота хирургическими ножницами.
   3. Осторожно подтяните нижележащую мышцу и сделайте продольный разрез 2,5 см вдоль linea alba для доступа к брюшной полости.
2. Обнажают брюшную аорту.
   1. Используйте смачиваемые аппликаторы с хлопковыми наконечниками, чтобы переместить кишечник и желудок в правую сторону мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале это обнажит инфраренальный сегмент аорты. Если аорту трудно локализовать, правая почка и правая почечная артерия могут идентифицировать аорту (так как правая почка имеет немного более низкое анатомическое расположение, чем левая почка).
   2. Используйте щипцы, чтобы аккуратно удалить соединительную ткань, покрывающую брюшную аорту и нижнюю полую вену (IVC).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Брюшная аорта и IVC содержатся в одной оболочке сосуда. Нет необходимости удалять всю соединительную ткань, так как полное удаление увеличит риск повреждения этих двух сосудов.
   3. Используйте щипцы, чтобы аккуратно рассечь заднюю сторону брюшной аорты и IVC от нижележащих мышц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кончики щипцов должны входить в заднюю сторону оболочки поперечно и создавать отверстие в фасции, которое соединяет оболочку с нижележащими мышцами. Как только отверстие сделано, увеличьте его размер, медленно отпуская щипцы.
   4. Поместите кусок полосы перчаток размером 4 см х 4 мм (как упоминалось ранее, шаг 2.1.1) через заднюю сторону брюшной аорты и IVC, затем выпрямите полосу. Поместите полосу ~ 0,5 см от правой почечной артерии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что отверстие достаточно большое, чтобы окружающая фасция не скручивала полосу.
   5. Над полосой поместите кусок ватного диска размером 3 см х 2 мм через заднюю сторону брюшной аорты и IVC, затем выпрямите ватный диск.
3. Инкубируют эластазу.
   1. Используйте пипетку, чтобы капнуть 30 мкл свиной поджелудочной эластазы (общая ферментативная активность 1,8 единицы, см. Таблица материалов) на сегмент аорты над ватным диском, затем обернуть ватный диск и полоску вокруг аорты и IVC. Промыть кусочек марли размером 10 см х 10 см стерильным 0,9% физиологическим раствором и поместить его на брюшко.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Марля нуждается только в частичном промывании, так как переусердствование может привести к разбавлению эластазы под ней.
   2. Через 30 мин снимите полоску и ватный диск щипцами.
4. Закройте брюшную полость, выполнив следующие действия.
   1. Орошают аорту и брюшную полость 500 мкл стерильного 0,9% физиологического раствора. Используйте марлю размером 10 см х 10 см, чтобы впитать оставшийся физиологический раствор.
   2. Повторное оплодотворение мышечных слоев бегущим 6-0 нерассасывающимся монофиламентным швом.
   3. Закройте кожу 3-4 прерванными 6-0 нерассасывающимися монофиламентными швами.

4. Послеоперационный уход

1. Вводят 5 мг/кг карпрофена подкожно в послеоперационный день 1.
2. Снимают кожные швы на 10-й послеоперационный день.

5. Измерение диаметра аневризмы брюшной аорты

1. Усыплите мышей передозировкой_CO2 на послеоперационный 14-й день. Это представляет собой временную точку максимальной дилатации.
2. Доступ к брюшной полости, как описано в шаге 3.1.
3. Выполняют перфузию сосудов путем введения 10 мл 0,9% физиологического раствора в циркуляцию через левый желудочек.
4. Обнажите инфраренальный сегмент брюшной аорты, как описано в шагах 3.1-3.2. Осторожно удалите окружающую соединительную ткань и отделите брюшную аорту от IVC.
5. Измерьте диаметр брюшной аорты с помощью суппорта.

Результаты

В общей сложности двадцать три 7-недельные мыши дикого типа (WT), включая 12 самок и 11 самцов, были прооперированы в соответствии с представленным протоколом. Выживаемость составила 100% (без хирургической смертности). Максимальный диаметр брюшной аорты измерялся суппортом.

А...

Обсуждение

Модель ААА, индуцированная эластазой, была впервые сообщена Anidjar et al. с использованием крыс в 1990^{году 17}. За последние тридцать лет были введены различные модифицированные версии, наряду со значительным улучшением хирургических методов 19,20,21,22....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 non-absorbable monofilament suture	Pro Advantage	P420697
Carprofen	Zoetis Inc.	NDC: 54771-8507
Chow Diet	LabDiet	3005659-220	PicoLab 5L0D
Cotton Applicator	Dynarex	4303
Cotton Pad	Rael	UPC: 810027130969
GraphPad Prism 8	GraphPad Software Inc.		Version 8.4.3
Grarfe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Halsted Mosquito Hemostats	Fine Science Tools	13009-12
Ketamine	Par Pharmaceutical	NDC: 42023-0115-10
Nitrile gloves	Fisherbrand	19-130-1597
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Porcine pancreatic elastase	Sigma-Aldrich	E1250-100MG
Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Sterile 0.9% saline solution	Baxter	2B1324X
Xylazine	Akorn	NDC: 59399-110-20