Modelo de aneurisma aórtico abdominal de ratón inducido por la aplicación perivascular de elastasa

Resumen

El presente protocolo describe un método quirúrgico estandarizado para el modelo AAA inducido por elastasa a través de la aplicación directa de elastasa a la adventicia de la aorta abdominal infrarrenal en ratones.

Resumen

El aneurisma aórtico abdominal (AAA), aunque principalmente asintomático, es potencialmente mortal ya que la ruptura de AAA generalmente tiene un resultado devastador. Actualmente, hay varios modelos experimentales distintos de AAA, cada uno enfatizando un aspecto diferente en la patogénesis de AAA. El modelo AAA inducido por elastasa es el segundo modelo AAA de roedores más utilizado. Este modelo implica la infusión directa o la aplicación de elastasa pancreática porcina (EPP) en el segmento infrarrenal de la aorta. Debido a los desafíos técnicos, la mayoría de los modelos AAA inducidos por elastasa hoy en día se realizan con la aplicación externa en lugar de una infusión intraluminal de EPP. La infiltración de elastasa causará la degradación de las láminas elásticas en las capas mediales, lo que resultará en la pérdida de la integridad de la pared aórtica y la posterior dilatación de la aorta abdominal. Sin embargo, una desventaja del modelo AAA inducido por elastasa es la variación inevitable de cómo se realiza la cirugía. Específicamente, la técnica quirúrgica de aislar el segmento infrarrenal de la aorta, el material utilizado para el envoltorio de la aorta y la incubación del EPP, la actividad enzimática del EPP y la duración del tiempo de aplicación del EPP pueden ser determinantes importantes que afectan la eventual tasa de formación de AAA y el diámetro del aneurisma. En particular, la diferencia en estos factores de diferentes estudios sobre AAA puede conducir a problemas de reproducibilidad. Este artículo describe un proceso quirúrgico detallado del modelo AAA inducido por elastasa a través de la aplicación directa de EPP a la adventicia de la aorta abdominal infrarrenal en el ratón. Después de este procedimiento, se puede lograr una tasa de formación AAA estable de alrededor del 80% en ratones machos y hembras. La consistencia y reproducibilidad de los estudios AAA que utilizan un modelo AAA inducido por elastasa se puede mejorar significativamente mediante el establecimiento de un procedimiento quirúrgico estándar.

Introducción

El aneurisma aórtico abdominal (AAA) se define como una dilatación segmentaria de la aorta abdominal con al menos un aumento del 50% del diámetro del vaso¹. Aaa es potencialmente fatal, ya que la ruptura puede resultar en una tasa de mortalidad extremadamente alta, incluso con la intervención ^2,3,4. Se ha informado que AAA es responsable de aproximadamente 13,000 muertes anuales en los Estados Unidos, lo que la convierte en la^10ª causa principal de muerte ^1,5.

La patogénesis de AAA aún no se entiende completamente ^6,7,8. Para investigar el mecanismo molecular de AAA y probar posibles dianas terapéuticas, se han establecido varios modelos^{experimentales} de AAA ^9,10. Los modelos de roedores de AAA incluyen modelos de elastasa, cloruro de calcio, angiotensina II y xenoinjerto, entre los cuales el modelo AAA inducido por elastasa es el segundo modelo más utilizado 10,11,12,13,14,15,16,17. Este modelo implica la infusión directa o la aplicación de elastasa pancreática porcina (EPP) en el segmento infrarrenal de la aorta. La penetración de la elastasa en la capa medial de la aorta provocará la degradación de las láminas elásticas y la infiltración de células inflamatorias, lo que conllevará la pérdida de la integridad de la pared aórtica y la posterior dilatación de la aorta abdominal ^7,18. El modelo AAA inducido por elastasa fue reportado por primera vez por Anidjar et al. en 1990 utilizando ratas, en las que un segmento aislado de la aorta fue perfundido con elastasa¹⁷. Más tarde, en 2012, Bhamidipati et ^al.19 informaron de un modelo modificado que utilizaba una aplicación periadventitial de EPP. Hoy en día, la mayoría de las cirugías para el modelo AAA inducido por elastasa están inspiradas en el grupo de Bhamidipati y se realizan con la aplicación externa en lugar de la perfusión intraluminal de EPP. Aunque la aplicación externa tiene menos requerimiento de habilidades quirúrgicas finas, la tasa de incidencia de AAA es relativamente menor y el tamaño algo menor que el de la perfusión intraluminal^11,19.

Aunque se usa ampliamente en estudios AAA, el modelo AAA inducido por elastasa posee ciertas limitaciones. Una advertencia de este modelo son las variaciones inevitables de cómo se realiza la cirugía, lo que puede llevar a la cuestión de la reproducibilidad. Por ejemplo, puede existir la diferencia en el procedimiento quirúrgico con respecto a cómo se aísla el segmento infrarrenal de la aorta y qué parte del segmento se selecciona para la aplicación de EPP entre diferentes laboratorios. La actividad enzimática del EPI y la duración del tiempo de incubación del EPI también pueden variar. Estos, sin embargo, son todos determinantes esenciales que afectan la eventual tasa de formación de AAA y el diámetro del aneurisma. La variación de estos determinantes críticos hace que la comparación de datos de estudios AAA de diferentes grupos que utilizan este modelo sea muy difícil. Por lo tanto, se necesita un procedimiento quirúrgico estandarizado como una herramienta para obtener resultados comparables de varias instituciones.

Este artículo describe un protocolo quirúrgico estandarizado para el modelo AAA inducido por elastasa a través de la aplicación directa de EPP a la adventicia de la aorta abdominal infrarrenal en ratones. También se discutirán los detalles sobre el material quirúrgico y los procedimientos esenciales para la generación exitosa y robusta de AAA en ratones que utilizan este modelo.

Protocolo

Los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan (PRO00010092). Para los experimentos se utilizaron ratones machos y hembras C57BL / 6J de tipo salvaje (WT), de ~ 7 semanas de edad.

1. Preparación animal

1. Alimente a los ratones con la dieta estándar de chow (ver Tabla de Materiales) antes y después de la cirugía.
   NOTA: Se pueden utilizar diferentes cepas y edades de ratones. Sin embargo, se recomienda una edad que oscila entre 5,5 y 12 semanas de edad para lograr la tasa de incidencia máxima.
2. Para cada ratón, administrar 5 mg/kg de Carprofen por vía subcutánea 30 min antes de la inducción de la anestesia.
3. Después de 30 min, administrar 100 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilazina mediante inyección intraperitoneal para inducir la anestesia.

2. Preparación para la cirugía

1. Preparar el material quirúrgico.
   1. Cortar los guantes de nitrilo en tiras de 4 cm x 4 mm. Corta las almohadillas de algodón en trozos de 3 cm x 2 mm. Autoclave estos con otros instrumentos quirúrgicos, incluyendo tijeras quirúrgicas, fórceps de tejido y hemostáticos Halsted-Mosquito (ver Tabla de Materiales).
2. Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla de apósito absorbente estéril. Inmovilizar las patas delanteras y traseras con cinta quirúrgica.
3. Use aplicadores con punta de algodón (consulte la Tabla de materiales) para cepillar la loción removedora de vello sobre el área abdominal media e inferior, luego frote el área con una gasa quirúrgica para eliminar el vello.
4. Desinfecte el área quirúrgica al menos tres veces en un movimiento circular con aplicaciones alternas de alcohol al 70% y un exfoliante a base de yodo o a base de clorhexidina. Dejar secar.

3. Procedimiento quirúrgico

1. Realice los siguientes pasos para acceder a la cavidad abdominal.
   1. Pruebe al ratón para detectar la falta de respuesta de pellizco en el dedo del pie antes de la incisión en la piel.
   2. Haga una incisión longitudinal de 2,5 cm en la piel a lo largo de la línea media del abdomen medio e inferior con tijeras quirúrgicas.
   3. Tire suavemente hacia arriba del músculo subyacente y haga una incisión longitudinal de 2,5 cm a lo largo de la línea alba para acceder a la cavidad abdominal.
2. Exponer la aorta abdominal.
   1. Use aplicadores húmedos con punta de algodón para mover los intestinos y el estómago hacia el lado derecho del ratón.
      NOTA: Idealmente, esto expondrá el segmento infrarrenal de la aorta. Si la aorta es difícil de localizar, el riñón derecho y la arteria renal derecha pueden identificar la aorta (ya que el riñón derecho tiene una ubicación anatómica ligeramente más baja que el riñón izquierdo).
   2. Use fórceps para extraer suavemente el tejido conectivo que cubre la aorta abdominal y la vena cava inferior (IVC).
      NOTA: La aorta abdominal y la CIV están contenidas dentro de la misma vaina del vaso. Es innecesario eliminar todo el tejido conectivo, ya que la eliminación completa aumentaría el riesgo de dañar estos dos vasos.
   3. Use fórceps para diseccionar suavemente la parte posterior de la aorta abdominal y la CIV de los músculos subyacentes.
      NOTA: Las puntas de los fórceps deben ir a la parte posterior de la vaina transversalmente y crear un agujero en la fascia que conecte la vaina con los músculos subyacentes. Una vez hecho el agujero, extienda su tamaño soltando lentamente las pinzas.
   4. Coloque un trozo de la guantera de 4 cm x 4 mm (como se mencionó anteriormente, paso 2.1.1) a través de la parte posterior de la aorta abdominal y la CIV, luego enderece la raya. Coloque la raya a ~ 0.5 cm de distancia de la arteria renal derecha.
      NOTA: Asegúrese de que el orificio sea lo suficientemente grande como para que la fascia circundante no tuerza la raya.
   5. Sobre la raya, coloque un trozo de algodón de 3 cm x 2 mm a través de la parte posterior de la aorta abdominal y el IVC, luego enderece la almohadilla de algodón.
3. Incubar la elastasa.
   1. Use una pipeta para dejar caer 30 μL de elastasa pancreática porcina (actividad enzimática total de 1.8 unidades, consulte la Tabla de materiales) sobre el segmento de la aorta sobre la almohadilla de algodón, luego envuelva la almohadilla de algodón y la raya alrededor de la aorta y la IVC. Enjuague un trozo de gasa de 10 cm x 10 cm con solución salina estéril al 0,9% y colóquelo sobre el abdomen.
      NOTA: La gasa solo necesita enjuague parcial, ya que exagerar correría el riesgo de diluir la elastasa debajo.
   2. Después de 30 minutos, retire la raya y la almohadilla de algodón con fórceps.
4. Cierre la cavidad abdominal siguiendo los pasos a continuación.
   1. Irrigar la aorta y la cavidad abdominal con 500 μL de solución salina estéril al 0,9%. Use una gasa de 10 cm x 10 cm para absorber la solución salina restante.
   2. Reaproximar las capas musculares con una sutura de monofilamento no absorbible 6-0.
   3. Cierre la piel con 3-4 suturas de monofilamentos no absorbibles interrumpidas 6-0.

4. Cuidados postoperatorios

1. Administrar 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea en el postoperatorio día 1.
2. Retire las suturas de la piel en el postoperatorio Día 10.

5. Medición del diámetro del aneurisma de la aorta abdominal

1. Sacrificar a los ratones por sobredosis de CO₂ en el día 14 postoperatorio. Esto representa el punto temporal de la dilatación máxima.
2. Acceda a la cavidad abdominal como se describe en el paso 3.1.
3. Realizar perfusión vascular inyectando 10 mL de solución salina al 0,9% en la circulación a través del ventrículo izquierdo.
4. Exponer el segmento infrarrenal de la aorta abdominal como se describe en los pasos 3.1-3.2. Retire con cuidado el tejido conectivo circundante y separe la aorta abdominal de la IVC.
5. Mide el diámetro de la aorta abdominal con una pinza.

Resultados

Un total de veintitrés ratones de tipo salvaje (WT) de 7 semanas de edad, incluidas 12 hembras y 11 machos, fueron operados siguiendo el protocolo presentado. La tasa de supervivencia fue del 100% (excluida la mortalidad quirúrgica). El diámetro máximo de la aorta abdominal se midió mediante una pinza.

La AAA se definió como la dilatación de la aorta abdominal con un aumento del 50% en el diámetro de los vasos. Por lo tanto, se seleccionó un aumento del 50% en el diámetro máximo de ...

Discusión

El modelo AAA inducido por elastasa fue reportado por primera vez por Anidjar et al. usando ratas en 1990¹⁷. Una variedad de versiones modificadas se han introducido en los últimos treinta años, junto con una mejora significativa en las técnicas quirúrgicas 19,20,21,22. Cientos de institutos utilizan modelos AAA inducidos por elastasa como el segundo modelo experimen...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 non-absorbable monofilament suture	Pro Advantage	P420697
Carprofen	Zoetis Inc.	NDC: 54771-8507
Chow Diet	LabDiet	3005659-220	PicoLab 5L0D
Cotton Applicator	Dynarex	4303
Cotton Pad	Rael	UPC: 810027130969
GraphPad Prism 8	GraphPad Software Inc.		Version 8.4.3
Grarfe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Halsted Mosquito Hemostats	Fine Science Tools	13009-12
Ketamine	Par Pharmaceutical	NDC: 42023-0115-10
Nitrile gloves	Fisherbrand	19-130-1597
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Porcine pancreatic elastase	Sigma-Aldrich	E1250-100MG
Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Sterile 0.9% saline solution	Baxter	2B1324X
Xylazine	Akorn	NDC: 59399-110-20