Modelo de Aneurisma De aootico Abdominal do Rato Induzido pela Aplicação Perivascular do Elastase

Resumo

O presente protocolo descreve um método cirúrgico padronizado para o modelo AAA induzido por elastase através da aplicação direta de elastase à adventitia da aorta abdominal infrarenal em camundongos.

Resumo

O aneurisma de aorta abdominal (AAA), embora principalmente assintomático, é potencialmente fatal, pois a ruptura do AAA geralmente tem um resultado devastador. Atualmente, existem vários modelos experimentais distintos de AAA, cada um enfatizando um aspecto diferente na patogênese do AAA. O modelo AAA induzido por elastase é o segundo modelo AAA de roedor mais usado. Este modelo envolve infusão direta ou aplicação de elastase pancreática porcina (EPI) ao segmento infrarenal da aorta. Devido a desafios técnicos, o modelo AAA mais induzido por elastase atualmente é realizado com a aplicação externa em vez de uma infusão intraluminal de EPI. A infiltração da elastase causará degradação de lamellae elástica nas camadas medial, resultando na perda da integridade da parede aórtica e posterior dilatação da aorta abdominal. No entanto, uma desvantagem do modelo AAA induzido por elastase é a inevitável variação de como a cirurgia é realizada. Especificamente, a técnica cirúrgica de isolar o segmento infrarenal da aorta, o material utilizado para embrulho de aorta e incubação de EPI, a atividade enzimática de EPI e a duração do tempo de aplicação de EPI podem ser determinantes importantes que afetam a eventual taxa de formação AAA e o diâmetro do aneurisma. Notavelmente, a diferença desses fatores de diferentes estudos sobre AAA pode levar a problemas de reprodutibilidade. Este artigo descreve um processo cirúrgico detalhado do modelo AAA induzido por elastase através da aplicação direta de EPI à adventitia da aorta abdominal infrarenal no camundongo. Após este procedimento, uma taxa de formação AAA estável de cerca de 80% em camundongos machos e fêmeas é alcançável. A consistência e a reprodutibilidade dos estudos AAA usando um modelo AAA induzido por elastase podem ser significativamente aprimoradas estabelecendo um procedimento cirúrgico padrão.

Introdução

O aneurisma de aorta abdominal (AAA) é definido como uma dilatação segmental da aorta abdominal com pelo menos 50% de aumento do diâmetro do vaso¹. AAA é potencialmente fatal, pois a ruptura pode resultar em uma taxa de mortalidade extremamente alta, mesmo com a intervenção ^2,3,4. Foi relatado que a AAA é responsável por aproximadamente 13.000 mortes anualmente nos EUA, o que faz dele a^10ª principal causa de morte ^1,5.

A patogênese do AAA ainda não é totalmente compreendida ^6,7,8. Para investigar o mecanismo molecular do AAA e testar potenciais alvos terapêuticos, vários modelos experimentais de AAA foram estabelecidos ^9,10. Os modelos de AAA de roedores incluem modelos de elastácio, cloreto de cálcio, angiotensina II e xenoenxerto, entre os quais o modelo AAA induzido por elastase é o segundo modelo mais utilizado 10,11,12,13,14,15,16,17. Este modelo envolve infusão direta ou aplicação de elastase pancreática porcina (EPI) ao segmento infrarenal da aorta. A penetração da elastase na camada medial da aorta causará degradação de lamellae elástica e infiltração de células inflamatórias, levando à perda da integridade da parede aórtica e à subsequente dilatação da aorta abdominal ^7,18. O modelo AAA induzido por elastase foi relatado pela primeira vez por Anidjar et al. em 1990 usando ratos, no qual um segmento isolado da aorta foi perfundido com elastase¹⁷. Mais tarde, em 2012, um modelo modificado usando uma aplicação periadventitial de EPI foi relatado por Bhamidipati et ^al.19. Atualmente, a maioria das cirurgias para o modelo AAA induzido por elastase são inspiradas no grupo de Bhamidipati e são realizadas com a aplicação externa em vez de perfusão intraluminal de EPI. Embora a aplicação externa tenha menor exigência de habilidades cirúrgicas finas, a taxa de incidência de AAA é relativamente menor e tamanho um pouco menor do que o da perfusão intraluminal^11,19.

Embora amplamente utilizado em estudos AAA, o modelo AAA induzido por elastase possui certas limitações. Uma ressalva desse modelo são as variações inevitáveis de como a cirurgia é realizada, o que pode levar à questão da reprodutibilidade. Por exemplo, pode existir a diferença no procedimento cirúrgico sobre como o segmento infrarenal da aorta é isolado e qual parte do segmento é selecionada para aplicação de EPI entre diferentes laboratórios. A atividade enzimática do EPI e a duração do tempo de incubação de EPI também podem variar. Estes, no entanto, são todos determinantes essenciais que afetam a eventual taxa de formação AAA e o diâmetro do aneurisma. A variação desses determinantes críticos torna muito difícil a comparação de dados de estudos AAA de diferentes grupos que utilizam esse modelo. Portanto, é necessário um procedimento cirúrgico padronizado como ferramenta para obter resultados comparáveis de várias instituições.

Este artigo descreve um protocolo cirúrgico padronizado para o modelo AAA induzido por elastase através da aplicação direta de EPI à adventitia da aorta abdominal infrarenal em camundongos. Detalhes sobre material cirúrgico e procedimentos essenciais para a geração bem-sucedida e robusta de AAA em camundongos usando este modelo também serão discutidos.

Protocolo

Os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan (PRO00010092). Camundongos machos e fêmeas C57BL/6J (WT), ~7 semanas de idade, foram usados para os experimentos.

1. Preparação animal

1. Alimente os camundongos com a dieta padrão de chow (ver Tabela de Materiais) antes e depois da cirurgia.
   NOTA: Podem ser utilizadas diferentes cepas e idades dos ratos. No entanto, recomenda-se idade que varia entre 5,5 e 12 semanas de idade para atingir a taxa máxima de incidência.
2. Para cada rato, administre 5 mg/kg de Carprofen subcutâneamente 30 min antes da indução da anestesia.
3. Após 30 min, administre 100 mg/kg de cetamina e 5mg/kg de Xylazine via injeção intraperitoneal para induzir anestesia.

2. Preparação para cirurgia

1. Prepare o material cirúrgico.
   1. Corte as luvas de nitrito em tiras de 4 cm x 4 mm. Corte as almofadas de algodão em pedaços de 3 cm x 2 mm. Autoclave-os com outros instrumentos cirúrgicos, incluindo tesoura cirúrgica, fórceps teciduais e hemostatos halsted-mosquito (ver Tabela de Materiais).
2. Coloque o mouse na posição supina em um absorvente estéril. Imobilize as patas dianteiras e traseiras com fita cirúrgica.
3. Use aplicadores com ponta de algodão (ver Tabela de Materiais) para escovar a loção de removedor de cabelo sobre a área abdominal média e inferior, em seguida, cotonhar a área com gaze cirúrgica para remover o cabelo.
4. Desinfetar a área cirúrgica pelo menos três vezes em um movimento circular com aplicações alternadas de 70% de álcool e um esfoliante à base de iodo ou clorexidina. Deixe secar.

3. Procedimento cirúrgico

1. Realize as seguintes etapas para acessar a cavidade abdominal.
   1. Teste o mouse para a falta de resposta de dedo do dedo do dedo antes da incisão da pele.
   2. Faça uma incisão longitudinal de 2,5 cm na pele ao longo da linha média do abdômen médio e inferior usando uma tesoura cirúrgica.
   3. Puxe suavemente o músculo subjacente e faça uma incisão longitudinal de 2,5 cm ao longo da linhaa alba para acessar a cavidade abdominal.
2. Exponha a aorta abdominal.
   1. Use aplicadores com ponta de algodão molhados para mover os intestinos e o estômago para o lado direito do mouse.
      NOTA: Idealmente, isso irá expor o segmento infrarenal da aorta. Se a aorta for difícil de localizar, o rim direito e a artéria renal direita podem identificar a aorta (já que o rim direito tem uma localização anatômica ligeiramente menor do que o rim esquerdo).
   2. Use fórceps para remover suavemente o tecido conjuntivo que cobre a aorta abdominal e a veia cava inferior (IVC).
      NOTA: A aorta abdominal e o IVC estão contidos na mesma baia do vaso. É desnecessário remover todo o tecido conjuntivo, pois a remoção completa aumentaria o risco de danificar esses dois vasos.
   3. Use fórceps para dissecar suavemente a parte traseira da aorta abdominal e IVC dos músculos subjacentes.
      NOTA: As pontas das fórceps devem ir para a parte de trás da bainha transversalmente e criar um buraco na fáscia que conecta a bainha aos músculos subjacentes. Uma vez feito o orifício, estenda seu tamanho liberando lentamente os fórceps.
   4. Coloque um pedaço da faixa de luva de 4 cm x 4 mm (como mencionado anteriormente, passo 2.1.1) através da parte traseira da aorta abdominal e IVC, em seguida, endireitar a listra. Coloque a listra ~0,5 cm de distância da artéria renal direita.
      NOTA: Certifique-se de que o orifício é grande o suficiente para que a fáscia circundante não torça a listra.
   5. Acima da listra, coloque um pedaço de 3 cm x 2 mm de algodão pela parte de trás da aorta abdominal e IVC, em seguida, endireitar a almofada de algodão.
3. Incubar o elastase.
   1. Use uma pipeta para soltar 30 μL de elastase pancreática porcina (atividade enzimática total de 1,8 unidade, ver Tabela de Materiais) no segmento de aorta acima do bloco de algodão, em seguida, enrole o bloco de algodão e listra ao redor da aorta e IVC. Enxágüe um pedaço de gaze de 10 cm x 10 cm com soro fisiológico e coloque-o no abdômen.
      NOTA: A gaze precisa apenas de lavagem parcial, pois o exagero correria o risco de diluir o elastase abaixo.
   2. Depois de 30 min, remova a listra e a almofada de algodão com fórceps.
4. Feche a cavidade abdominal seguindo os passos abaixo.
   1. Irrigar a aorta e a cavidade abdominal com 500 μL de soro fisiológico estéril de 0,9%. Use uma gaze de 10 cm x 10 cm para absorver o salino restante.
   2. Reaproximar as camadas musculares com uma sutura de monofilamento não absorvível de 6-0.
   3. Pele próxima com 3-4 interrompidas 6-0 suturas monofilamentos não absorvíveis.

4. Cuidados pós-operatórios

1. Administrar 5mg/kg de Carprofen subcutâneamente no dia 1 pós-operatório.
2. Remova as suturas da pele no dia 10 pós-operatório.

5. Medição do diâmetro do aneurisma de aorta abdominal

1. Eutanize os ratos por CO₂ sobredosagem no dia 14 pós-operatório. Isso representa o ponto de tempo da dilatação máxima.
2. Acesse a cavidade abdominal conforme descrito na etapa 3.1.
3. Realize a perfusão vascular injetando 10 mL de soro fisiológico de 0,9% na circulação através do ventrículo esquerdo.
4. Expor o segmento infrarenal da aorta abdominal conforme descrito nas etapas 3.1-3.2. Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo circundante e separe a aorta abdominal do IVC.
5. Meça o diâmetro da aorta abdominal com uma pinça.

Resultados

Um total de vinte e três camundongos do tipo selvagem (WT) de 7 semanas, incluindo 12 fêmeas e 11 machos, foram operados seguindo o protocolo apresentado. A taxa de sobrevivência foi de 100% (exclusão da mortalidade cirúrgica). O diâmetro da aorta abdominal máxima foi medido por uma pinça.

AAA foi definida como dilatando a aorta abdominal com um aumento de 50% no diâmetro do vaso. Por isso, foi selecionado um aumento de 50% no diâmetro máximo da aorta abdominal como ponto de corte p...

Discussão

O modelo AAA induzido por elastase foi relatado pela primeira vez por Anidjar et al. usando ratos em 1990¹⁷. Uma variedade de versões modificadas foram introduzidas nos últimos trinta anos, juntamente com uma melhora significativa nas técnicas cirúrgicas 19,20,21,22. Centenas de institutos usam modelos AAA induzidos por elastase como o segundo modelo experimental de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 non-absorbable monofilament suture	Pro Advantage	P420697
Carprofen	Zoetis Inc.	NDC: 54771-8507
Chow Diet	LabDiet	3005659-220	PicoLab 5L0D
Cotton Applicator	Dynarex	4303
Cotton Pad	Rael	UPC: 810027130969
GraphPad Prism 8	GraphPad Software Inc.		Version 8.4.3
Grarfe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Halsted Mosquito Hemostats	Fine Science Tools	13009-12
Ketamine	Par Pharmaceutical	NDC: 42023-0115-10
Nitrile gloves	Fisherbrand	19-130-1597
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Porcine pancreatic elastase	Sigma-Aldrich	E1250-100MG
Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Sterile 0.9% saline solution	Baxter	2B1324X
Xylazine	Akorn	NDC: 59399-110-20