Modello di aneurisma dell'aorta addominale del topo indotto dall'applicazione perivascolare dell'elastasi

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un metodo chirurgico standardizzato per il modello AAA indotto da elastasi attraverso l'applicazione diretta di elastasi all'avventizia dell'aorta addominale infrarenale nei topi.

Abstract

L'aneurisma dell'aorta addominale (AAA), sebbene principalmente asintomatico, è potenzialmente pericoloso per la vita in quanto la rottura di AAA di solito ha un esito devastante. Attualmente, ci sono diversi modelli sperimentali distinti di AAA, ognuno dei quali enfatizza un aspetto diverso nella patogenesi di AAA. Il modello AAA indotto da elastasi è il secondo modello AAA di roditore più utilizzato. Questo modello prevede l'infusione diretta o l'applicazione di elastasi pancreatica suina (PPE) al segmento infrarenale dell'aorta. A causa di sfide tecniche, la maggior parte dei modelli AAA indotti da elastasi al giorno d'oggi viene eseguita con l'applicazione esterna piuttosto che con un'infusione intraluminale di DPI. L'infiltrazione di elastasi causerà la degradazione delle lamelle elastiche negli strati mediali, con conseguente perdita dell'integrità della parete aortica e successiva dilatazione dell'aorta addominale. Tuttavia, uno svantaggio del modello AAA indotto da elastasi è l'inevitabile variazione di come viene eseguito l'intervento chirurgico. In particolare, la tecnica chirurgica di isolamento del segmento infrarenale dell'aorta, il materiale utilizzato per l'avvolgimento dell'aorta e l'incubazione dei DPI, l'attività enzimatica dei DPI e la durata temporale dell'applicazione dei DPI possono essere tutti determinanti importanti che influenzano l'eventuale tasso di formazione dell'AAA e il diametro dell'aneurisma. In particolare, la differenza in questi fattori da diversi studi sull'AAA può portare a problemi di riproducibilità. Questo articolo descrive un processo chirurgico dettagliato del modello AAA indotto da elastasi attraverso l'applicazione diretta di DPI all'avventizia dell'aorta addominale infrarenale nel topo. Seguendo questa procedura, è possibile ottenere un tasso di formazione AAA stabile di circa l'80% nei topi maschi e femmine. La coerenza e la riproducibilità degli studi AAA che utilizzano un modello AAA indotto dall'elastasi possono essere significativamente migliorate stabilendo una procedura chirurgica standard.

Introduzione

L'aneurisma dell'aorta addominale (AAA) è definito come una dilatazione segmentale dell'aorta addominale con un aumento di almeno il 50% del diametro del vaso¹. L'AAA è potenzialmente fatale, in quanto la rottura può comportare un tasso di mortalità estremamente elevato, anche con l'intervento ^2,3,4. È stato riferito che aAA è responsabile di circa 13.000 morti all'anno negli Stati Uniti, il che lo rende la^10a causa di morte ^1,5.

La patogenesi dell'AAA non è ancora del tutto compresa ^6,7,8. Per studiare il meccanismo molecolare dell'AAA e testare potenziali bersagli terapeutici, sono stati stabiliti diversi modelli sperimentali di AAA ^9,10. I modelli di roditori di AAA includono modelli di elastasi, cloruro di calcio, angiotensina II e xenotrapianto, tra i quali il modello AAA indotto da elastasi è il secondo modello più utilizzato 10,11,12,13,14,15,16,17. Questo modello prevede l'infusione diretta o l'applicazione di elastasi pancreatica suina (PPE) al segmento infrarenale dell'aorta. La penetrazione dell'elastasi nello strato mediale dell'aorta causerà la degradazione delle lamelle elastiche e l'infiltrazione delle cellule infiammatorie, portando alla perdita dell'integrità della parete aortica e alla successiva dilatazione dell'aorta addominale ^7,18. Il modello AAA indotto da elastasi è stato riportato per la prima volta da Anidjar et al. nel 1990 utilizzando ratti, in cui un segmento isolato dell'aorta è stato perfuso con elastasi¹⁷. Più tardi, nel 2012, un modello modificato che utilizza un'applicazione periavventiziale di DPI è stato riportato da Bhamidipati et ^al.19. Al giorno d'oggi, la maggior parte degli interventi chirurgici per il modello AAA indotto da elastasi sono ispirati al gruppo di Bhamidipati e vengono eseguiti con l'applicazione esterna piuttosto che con la perfusione intraluminale di DPI. Sebbene l'applicazione esterna abbia meno requisiti sulle abilità chirurgiche fini, il tasso di incidenza di AAA è relativamente più basso e le dimensioni leggermente inferiori a quelle della perfusione intraluminale^11,19.

Sebbene ampiamente utilizzato negli studi AAA, il modello AAA indotto dall'elastasi presenta alcune limitazioni. Un avvertimento di questo modello sono le inevitabili variazioni di come viene eseguito l'intervento chirurgico, che può portare al problema della riproducibilità. Ad esempio, la differenza può esistere nella procedura chirurgica per quanto riguarda il modo in cui il segmento infrarenale dell'aorta è isolato e quale parte del segmento è selezionata per l'applicazione di DPI tra diversi laboratori. Anche l'attività enzimatica dei DPI e la durata dell'incubazione dei DPI possono variare. Questi, tuttavia, sono tutti determinanti essenziali che influenzano l'eventuale tasso di formazione AAA e il diametro dell'aneurisma. La variazione di questi determinanti critici rende molto difficile il confronto dei dati degli studi AAA di diversi gruppi che utilizzano questo modello. Pertanto, è necessaria una procedura chirurgica standardizzata come strumento per ottenere risultati comparabili da varie istituzioni.

Questo articolo descrive un protocollo chirurgico standardizzato per il modello AAA indotto da elastasi attraverso l'applicazione diretta di DPI all'avventizia dell'aorta addominale infrarenale nei topi. Saranno inoltre discussi i dettagli sul materiale chirurgico e le procedure essenziali per una generazione efficace e robusta di AAA nei topi che utilizzano questo modello.

Protocollo

I protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Michigan (PRO00010092). Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschi e femmine C57BL / 6J wild-type (WT), a circa 7 settimane di età.

1. Preparazione animale

1. Nutrire i topi con la dieta standard chow (vedi Tabella dei materiali) prima e dopo l'intervento chirurgico.
   NOTA: È possibile utilizzare diversi ceppi ed età dei topi. Tuttavia, si raccomanda un'età compresa tra 5,5 e 12 settimane per raggiungere il tasso di incidenza massimo.
2. Per ogni topo, somministrare 5 mg/kg di Carprofene per via sottocutanea 30 minuti prima dell'induzione dell'anestesia.
3. Dopo 30 minuti, somministrare 100 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di xilazina tramite iniezione intraperitoneale per indurre l'anestesia.

2. Preparazione per la chirurgia

1. Preparare il materiale chirurgico.
   1. Tagliare i guanti in nitrile in strisce di 4 cm x 4 mm. Tagliare i tamponi di cotone in pezzi di 3 cm x 2 mm. Autoclave questi con altri strumenti chirurgici, tra cui forbici chirurgiche, pinze tissutali ed emostati Halsted-Mosquito (vedi Tabella dei materiali).
2. Posizionare il mouse in posizione supina su una pastiglia assorbente sterile. Immobilizzare le zampe anteriori e posteriori con nastro chirurgico.
3. Utilizzare applicatori con punta di cotone (vedi Tabella dei materiali) per spazzolare la lozione per la rimozione dei capelli sulla zona addominale centrale e inferiore, quindi tamponare l'area con una garza chirurgica per rimuovere i capelli.
4. Disinfettare l'area chirurgica almeno tre volte con un movimento circolare con applicazioni alternate di alcol al 70% e uno scrub a base di iodio o a base di clorexidina. Lasciare asciugare.

3. Procedura chirurgica

1. Eseguire i seguenti passaggi per accedere alla cavità addominale.
   1. Testare il mouse per la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi prima dell'incisione cutanea.
   2. Fare un'incisione longitudinale di 2,5 cm sulla pelle lungo la linea mediana dell'addome medio e inferiore usando le forbici chirurgiche.
   3. Tirare delicatamente verso l'alto il muscolo sottostante e fare un'incisione longitudinale di 2,5 cm lungo la linea alba per accedere alla cavità addominale.
2. Esporre l'aorta addominale.
   1. Utilizzare applicatori con punta di cotone bagnata per spostare l'intestino e lo stomaco sul lato destro del mouse.
      NOTA: Idealmente, questo esporrà il segmento infrarenale dell'aorta. Se l'aorta è difficile da localizzare, il rene destro e l'arteria renale destra possono identificare l'aorta (poiché il rene destro ha una posizione anatomica leggermente inferiore rispetto al rene sinistro).
   2. Utilizzare una pinza per rimuovere delicatamente il tessuto connettivo che copre l'aorta addominale e la vena cava inferiore (IVC).
      NOTA: L'aorta addominale e l'IVC sono contenute all'interno della stessa guaina del vaso. Non è necessario rimuovere tutto il tessuto connettivo poiché la rimozione completa aumenterebbe il rischio di danneggiare questi due vasi.
   3. Utilizzare una pinza per sezionare delicatamente la parte posteriore dell'aorta addominale e IVC dai muscoli sottostanti.
      NOTA: le punte della pinza dovrebbero andare nella parte posteriore della guaina trasversalmente e creare un foro nella fascia che collega la guaina ai muscoli sottostanti. Una volta fatto il foro, estendi le sue dimensioni rilasciando lentamente la pinza.
   4. Posizionare un pezzo della striscia del guanto di 4 cm x 4 mm (come accennato in precedenza, passaggio 2.1.1) attraverso la parte posteriore dell'aorta addominale e dell'IVC, quindi raddrizzare la striscia. Posizionare la striscia a ~ 0,5 cm di distanza dall'arteria renale destra.
      NOTA: assicurarsi che il foro sia abbastanza grande in modo che la fascia circostante non torca la striscia.
   5. Sopra la striscia, posizionare un pezzo di batuffolo di cotone di 3 cm x 2 mm attraverso la parte posteriore dell'aorta addominale e IVC, quindi raddrizzare il batuffolo di cotone.
3. Incubare l'elastasi.
   1. Utilizzare una pipetta per far cadere 30 μL di elastasi pancreatica suina (attività enzimatica totale di 1,8 unità, vedere Tabella dei materiali) sul segmento dell'aorta sopra il batuffolo di cotone, quindi avvolgere il batuffolo di cotone e strisciare intorno all'aorta e all'IVC. Risciacquare un pezzo di garza di 10 cm x 10 cm con soluzione salina sterile allo 0,9% e posizionarlo sull'addome.
      NOTA: La garza ha bisogno solo di risciacquo parziale in quanto esagerare rischierebbe di diluire l'elastasi sottostante.
   2. Dopo 30 minuti, rimuovere la striscia e il batuffolo di cotone con una pinza.
4. Chiudere la cavità addominale seguendo i passaggi seguenti.
   1. Irrigare l'aorta e la cavità addominale con 500 μL di soluzione salina sterile allo 0,9%. Utilizzare una garza di 10 cm x 10 cm per assorbire la soluzione salina rimanente.
   2. Riavvicinare gli strati muscolari con una sutura monofilamento non assorbibile 6-0 in esecuzione.
   3. Chiudere la pelle con 3-4 suture monofilamento non assorbibili interrotte 6-0.

4. Assistenza post-operatoria

1. Somministrare 5 mg/kg di carprofene per via sottocutanea nel giorno 1 post-operatorio.
2. Rimuovere le suture cutanee il giorno post-operatorio 10.

5. Misurazione del diametro dell'aneurisma dell'aorta addominale

1. Eutanasia dei topi con sovradosaggio di CO₂ il giorno 14 post-operatorio. Questo rappresenta il punto temporale della massima dilatazione.
2. Accedere alla cavità addominale come descritto al punto 3.1.
3. Eseguire la perfusione vascolare iniettando 10 ml di soluzione salina allo 0,9% nella circolazione attraverso il ventricolo sinistro.
4. Esporre il segmento infrarenale dell'aorta addominale come descritto nei passaggi 3.1-3.2. Rimuovere con cura il tessuto connettivo circostante e separare l'aorta addominale dall'IVC.
5. Misurare il diametro dell'aorta addominale con una pinza.

Risultati

Un totale di ventitré topi wild-type (WT) di 7 settimane, tra cui 12 femmine e 11 maschi, sono stati operati seguendo il protocollo presentato. Il tasso di sopravvivenza è stato del 100% (mortalità chirurgica esclusa). Il diametro massimo dell'aorta addominale è stato misurato da una pinza.

L'AAA è stato definito come dilatazione dell'aorta addominale con un aumento del diametro del vaso del 50%. Pertanto, un aumento del 50% del diametro massimo dell'aorta addominale è stato selezionato ...

Discussione

Il modello AAA indotto da elastasi è stato riportato per la prima volta da Anidjar et al. usando ratti nel 1990¹⁷. Una varietà di versioni modificate sono state introdotte negli ultimi trent'anni, insieme a un significativo miglioramento delle tecniche chirurgiche 19,20,21,22. Centinaia di istituti utilizzano modelli AAA indotti da elastasi come secondo modello sperime...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 non-absorbable monofilament suture	Pro Advantage	P420697
Carprofen	Zoetis Inc.	NDC: 54771-8507
Chow Diet	LabDiet	3005659-220	PicoLab 5L0D
Cotton Applicator	Dynarex	4303
Cotton Pad	Rael	UPC: 810027130969
GraphPad Prism 8	GraphPad Software Inc.		Version 8.4.3
Grarfe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Halsted Mosquito Hemostats	Fine Science Tools	13009-12
Ketamine	Par Pharmaceutical	NDC: 42023-0115-10
Nitrile gloves	Fisherbrand	19-130-1597
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Porcine pancreatic elastase	Sigma-Aldrich	E1250-100MG
Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Sterile 0.9% saline solution	Baxter	2B1324X
Xylazine	Akorn	NDC: 59399-110-20