Modèle d’anévrisme de l’aorte abdominale de souris induit par l’application périvasculaire d’élastase

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode chirurgicale normalisée pour le modèle AAA induit par l’élastase par l’application directe d’élastase à l’adventice de l’aorte abdominale infrarénale chez la souris.

Résumé

L’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA), bien que principalement asymptomatique, est potentiellement mortel car la rupture de l’AAA a généralement un résultat dévastateur. Actuellement, il existe plusieurs modèles expérimentaux distincts d’AAA, chacun mettant l’accent sur un aspect différent de la pathogenèse de l’AAA. Le modèle AAA induit par l’élastase est le deuxième modèle AAA de rongeur le plus utilisé. Ce modèle implique une perfusion directe ou l’application d’élastase pancréatique porcine (EPI) sur le segment infrarénal de l’aorte. En raison de défis techniques, la plupart des modèles AAA induits par l’élastase sont aujourd’hui réalisés avec l’application externe plutôt qu’avec une perfusion intraluminale d’EPI. L’infiltration d’élastase entraînera la dégradation des lamelles élastiques dans les couches médiales, entraînant la perte de l’intégrité de la paroi aortique et la dilatation ultérieure de l’aorte abdominale. Cependant, l’un des inconvénients du modèle AAA induit par l’élastase est la variation inévitable de la façon dont la chirurgie est effectuée. Plus précisément, la technique chirurgicale d’isolement du segment infrarénal de l’aorte, le matériau utilisé pour l’enveloppement de l’aorte et l’incubation de l’EPI, l’activité enzymatique de l’EPI et la durée d’application de l’EPI peuvent tous être des déterminants importants qui affectent le taux de formation éventuel de l’AAA et le diamètre de l’anévrisme. Notamment, la différence entre ces facteurs et différentes études sur l’AAA peut entraîner des problèmes de reproductibilité. Cet article décrit un processus chirurgical détaillé du modèle AAA induit par l’élastase par application directe d’EPI à l’adventice de l’aorte abdominale infrarénale chez la souris. Après cette procédure, un taux de formation d’AAA stable d’environ 80% chez les souris mâles et femelles est réalisable. La cohérence et la reproductibilité des études AAA utilisant un modèle AAA induit par l’élastase peuvent être considérablement améliorées en établissant une intervention chirurgicale standard.

Introduction

L’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) est défini comme une dilatation segmentaire de l’aorte abdominale avec une augmentation d’au moins 50% du diamètre des vaisseaux¹. L’AAA est potentiellement mortel, car la rupture peut entraîner un taux de mortalité extrêmement élevé, même avec une intervention ^2,3,4. Il a été rapporté que l’AAA est responsable d’environ 13 000 décès par an aux États-Unis, ce qui en fait la^10e cause de décès ^1,5.

La pathogenèse de l’AAA n’est pas encore entièrement comprise ^6,7,8. Pour étudier le mécanisme moléculaire de l’AAA et tester des cibles thérapeutiques potentielles, plusieurs modèles expérimentaux AAA ont été établis ^9,10. Les modèles de rongeurs de l’AAA comprennent les modèles d’élastase, de chlorure de calcium, d’angiotensine II et de xénogreffe, parmi lesquels le modèle AAA induit par l’élastase est le deuxième modèle le plus utilisé 10,11,12,13,14,15,16,17. Ce modèle implique une perfusion directe ou l’application d’élastase pancréatique porcine (EPI) sur le segment infrarénal de l’aorte. La pénétration de l’élastase dans la couche médiale de l’aorte provoquera la dégradation des lamelles élastiques et l’infiltration des cellules inflammatoires, entraînant la perte de l’intégrité de la paroi aortique et la dilatation ultérieure de l’aorte abdominale ^7,18. Le modèle AAA induit par l’élastase a été rapporté pour la première fois par Anidjar et al. en 1990 chez des rats, dans lequel un segment isolé de l’aorte a été perfusé avec de l’élastase¹⁷. Plus tard en 2012, un modèle modifié utilisant une application péri-interventionventitielle d’EPI a été rapporté par Bhamidipati et ^al.19. De nos jours, la plupart des chirurgies pour le modèle AAA induit par l’élastase sont inspirées du groupe de Bhamidipati et sont effectuées avec l’application externe plutôt que la perfusion intraluminale de l’EPI. Bien que l’application externe ait moins besoin de compétences chirurgicales fines, le taux d’incidence de l’AAA est relativement inférieur et la taille un peu plus petite que celle de la perfusion intraluminale^11,19.

Bien que largement utilisé dans les études AAA, le modèle AAA induit par l’élastase présente certaines limites. Une mise en garde de ce modèle est les variations inévitables de la façon dont la chirurgie est effectuée, ce qui peut conduire à la question de la reproductibilité. Par exemple, la différence peut exister dans l’intervention chirurgicale en ce qui concerne la façon dont le segment infrarénal de l’aorte est isolé et quelle partie du segment est sélectionnée pour l’application de l’EPI parmi différents laboratoires. L’activité enzymatique de l’EPI et la durée de l’incubation de l’EPI peuvent également varier. Cependant, ce sont tous des déterminants essentiels qui affectent le taux de formation éventuel de l’AAA et le diamètre de l’anévrisme. La variation de ces déterminants critiques rend très difficile la comparaison des données des études AAA de différents groupes utilisant ce modèle. Par conséquent, une intervention chirurgicale standardisée est nécessaire comme outil pour obtenir des résultats comparables de diverses institutions.

Cet article décrit un protocole chirurgical standardisé pour le modèle AAA induit par l’élastase par application directe d’EPI à l’adventice de l’aorte abdominale infrarénale chez la souris. Les détails sur le matériel chirurgical et les procédures essentielles à la génération réussie et robuste d’AAA chez la souris utilisant ce modèle seront également discutés.

Protocole

Les protocoles pour animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan (PRO00010092). Des souris mâles et femelles de type sauvage C57BL/6J, âgées d’environ 7 semaines, ont été utilisées pour les expériences.

1. Préparation des animaux

1. Nourrissez les souris avec le régime chow standard (voir tableau des matériaux) avant et après la chirurgie.
   REMARQUE: Différentes souches et âges de souris peuvent être utilisés. Cependant, il est recommandé d’avoir entre 5,5 et 12 semaines pour atteindre un taux d’incidence maximal.
2. Pour chaque souris, administrer 5 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée 30 minutes avant l’induction de l’anesthésie.
3. Après 30 min, administrer 100 mg/kg de kétamine et 5 mg/kg de xylazine par injection intrapéritonéale pour induire une anesthésie.

2. Préparation à la chirurgie

1. Préparez le matériel chirurgical.
   1. Couper les gants en nitrile en bandes de 4 cm x 4 mm. Couper les cotons en morceaux de 3 cm x 2 mm. Autoclavez-les avec d’autres instruments chirurgicaux, y compris des ciseaux chirurgicaux, des pinces à tissus et des hémostats Halsted-Mosquito (voir tableau des matériaux).
2. Placez la souris en position couchée sur un pansement absorbant stérile. Immobilisez les pattes avant et arrière avec du ruban adhésif chirurgical.
3. Utilisez des applicateurs à pointe de coton (voir la table des matériaux) pour brosser la lotion démaquillante sur la région abdominale moyenne et inférieure, puis tamponnez la zone avec de la gaze chirurgicale pour enlever les poils.
4. Désinfectez la zone chirurgicale au moins trois fois dans un mouvement circulaire avec des applications alternées d’alcool à 70% et d’un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine. Laisser sécher.

3. Procédure chirurgicale

1. Effectuez les étapes suivantes pour accéder à la cavité abdominale.
   1. Testez la souris pour l’absence de réponse au pincement des orteils avant l’incision cutanée.
   2. Faites une incision longitudinale de 2,5 cm sur la peau le long de la ligne médiane du milieu et du bas-ventre à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
   3. Tirez doucement vers le haut le muscle sous-jacent et faites une incision longitudinale de 2,5 cm le long de linea alba pour accéder à la cavité abdominale.
2. Exposez l’aorte abdominale.
   1. Utilisez des applicateurs à pointe de coton mouillé pour déplacer les intestins et l’estomac vers le côté droit de la souris.
      REMARQUE: Idéalement, cela exposera le segment infrarénal de l’aorte. Si l’aorte est difficile à localiser, le rein droit et l’artère rénale droite peuvent identifier l’aorte (car le rein droit a un emplacement anatomique légèrement inférieur à celui du rein gauche).
   2. Utilisez une pince pour retirer doucement le tissu conjonctif recouvrant l’aorte abdominale et la veine cave inférieure (CIV).
      REMARQUE: L’aorte abdominale et la CIV sont contenues dans la même gaine de vaisseau. Il n’est pas nécessaire d’enlever tout le tissu conjonctif car un retrait complet augmenterait le risque d’endommager ces deux vaisseaux.
   3. Utilisez des pinces pour disséquer doucement l’arrière de l’aorte abdominale et la CIV des muscles sous-jacents.
      REMARQUE: Les pointes des pinces doivent aller à l’arrière de la gaine transversalement et créer un trou dans le fascia qui relie la gaine aux muscles sous-jacents. Une fois le trou fait, étendez sa taille en relâchant lentement les pinces.
   4. Placez un morceau de la bande de gant de 4 cm x 4 mm (comme mentionné précédemment, étape 2.1.1) à l’arrière de l’aorte abdominale et de la CIV, puis redressez la bande. Placez la bande à environ 0,5 cm de l’artère rénale droite.
      REMARQUE: Assurez-vous que le trou est assez grand pour que le fascia environnant ne tord pas la bande.
   5. Au-dessus de la bande, placez un morceau de coton de 3 cm x 2 mm à travers l’arrière de l’aorte abdominale et de la CIV, puis redressez le coton.
3. Incuber l’élastase.
   1. Utilisez une pipette pour déposer 30 μL d’élastase pancréatique porcine (activité enzymatique totale de 1,8 unité, voir Tableau des matériaux) sur le segment de l’aorte au-dessus du coton, puis enroulez le coton et la bande autour de l’aorte et de la CIV. Rincez un morceau de gaze de 10 cm x 10 cm avec une solution saline stérile à 0,9% et placez-le sur l’abdomen.
      REMARQUE: La gaze n’a besoin que d’un rinçage partiel, car une surdose risquerait de diluer l’élastase en dessous.
   2. Après 30 min, retirez la bande et le coton avec une pince.
4. Fermez la cavité abdominale en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Irriguer l’aorte et la cavité abdominale avec 500 μL de solution saline stérile à 0,9%. Utilisez une gaze de 10 cm x 10 cm pour absorber la solution saline restante.
   2. Réabordez les couches musculaires avec une suture monofilament non résorbable 6-0.
   3. Fermez la peau avec 3-4 sutures monofilaments non résorbables interrompues 6-0.

4. Soins postopératoires

1. Administrer 5 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée le jour 1 postopératoire.
2. Retirez les sutures cutanées le jour 10 postopératoire.

5. Mesure du diamètre de l’anévrisme de l’aorte abdominale

1. Euthanasier les souris par surdosage de CO₂ le jour 14 postopératoire. Cela représente le point temporel de dilatation maximale.
2. Accédez à la cavité abdominale comme décrit à l’étape 3.1.
3. Effectuer une perfusion vasculaire en injectant 10 mL de solution saline à 0,9% dans la circulation à travers le ventricule gauche.
4. Exposez le segment infrarénal de l’aorte abdominale comme décrit aux étapes 3.1-3.2. Retirez soigneusement le tissu conjonctif environnant et séparez l’aorte abdominale de la CIV.
5. Mesurez le diamètre de l’aorte abdominale avec un étrier.

Résultats

Au total, vingt-trois souris de type sauvage (WT) âgées de 7 semaines, dont 12 femelles et 11 mâles, ont été opérées selon le protocole présenté. Le taux de survie était de 100 % (mortalité chirurgicale exclue). Le diamètre maximal de l’aorte abdominale a été mesuré par un étrier.

AAA a été défini comme dilatant l’aorte abdominale avec une augmentation de 50% du diamètre des vaisseaux. Par conséquent, une augmentation de 50% du diamètre maximal de l’aorte abdominale...

Discussion

Le modèle AAA induit par l’élastase a été rapporté pour la première fois par Anidjar et al. en utilisant des rats en 1990¹⁷. Une variété de versions modifiées ont été introduites au cours des trente dernières années, ainsi qu’une amélioration significative des techniques chirurgicales ^19,20,21,22. Des centaines d’instituts utilisent des modèles AAA i...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 non-absorbable monofilament suture	Pro Advantage	P420697
Carprofen	Zoetis Inc.	NDC: 54771-8507
Chow Diet	LabDiet	3005659-220	PicoLab 5L0D
Cotton Applicator	Dynarex	4303
Cotton Pad	Rael	UPC: 810027130969
GraphPad Prism 8	GraphPad Software Inc.		Version 8.4.3
Grarfe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Halsted Mosquito Hemostats	Fine Science Tools	13009-12
Ketamine	Par Pharmaceutical	NDC: 42023-0115-10
Nitrile gloves	Fisherbrand	19-130-1597
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Porcine pancreatic elastase	Sigma-Aldrich	E1250-100MG
Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Sterile 0.9% saline solution	Baxter	2B1324X
Xylazine	Akorn	NDC: 59399-110-20