Mausmodell für das abdominale Aortenaneurysma, das durch die perivaskuläre Anwendung der Elastase induziert wird

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine standardisierte chirurgische Methode für das Elastase-induzierte AAA-Modell durch die direkte Anwendung von Elastase auf die Adventitia der infrarenalen abdominalen Aorta bei Mäusen.

Zusammenfassung

Abdominales Aortenaneurysma (AAA), obwohl in erster Linie asymptomatisch, ist potenziell lebensbedrohlich, da der Bruch von AAA in der Regel ein verheerendes Ergebnis hat. Derzeit gibt es mehrere verschiedene experimentelle Modelle von AAA, die jeweils einen anderen Aspekt in der Pathogenese von AAA betonen. Das Elastase-induzierte AAA-Modell ist das am zweithäufigsten verwendete Nagetier-AAA-Modell. Dieses Modell beinhaltet eine direkte Infusion oder Anwendung der porcinen Pankreaselastase (PPE) auf das infrarenale Segment der Aorta. Aufgrund technischer Herausforderungen werden die meisten Elastase-induzierten AAA-Modelle heutzutage mit der externen Anwendung und nicht mit einer intraluminalen Infusion von PSA durchgeführt. Die Infiltration der Elastase führt zu einem Abbau elastischer Lamellen in den medialen Schichten, was zum Verlust der Integrität der Aortenwand und zur anschließenden Erweiterung der Bauchaorta führt. Ein Nachteil des Elastase-induzierten AAA-Modells ist jedoch die unvermeidliche Variation der Art und Weise, wie die Operation durchgeführt wird. Insbesondere die chirurgische Technik der Isolierung des infrarenalen Segments der Aorta, das Material, das für die Aortenwicklung und die PSA-Inkubation verwendet wird, die enzymatische Aktivität von PSA und die zeitliche Dauer der PSA-Anwendung können wichtige Determinanten sein, die die eventuelle AAA-Bildungsrate und den Aneurysmadurchmesser beeinflussen. Insbesondere der Unterschied in diesen Faktoren aus verschiedenen Studien zu AAA kann zu Reproduzierbarkeitsproblemen führen. Dieser Artikel beschreibt einen detaillierten chirurgischen Ablauf des Elastase-induzierten AAA-Modells durch direkte Anwendung von PSA auf die Adventitia der infrarenalen Bauchaorta in der Maus. Nach diesem Verfahren ist eine stabile AAA-Bildungsrate von etwa 80% bei männlichen und weiblichen Mäusen erreichbar. Die Konsistenz und Reproduzierbarkeit von AAA-Studien unter Verwendung eines Elastase-induzierten AAA-Modells kann durch die Etablierung eines chirurgischen Standardverfahrens erheblich verbessert werden.

Einleitung

Das Abdominalaortenaneurysma (AAA) ist definiert als eine segmentale Erweiterung der Bauchaorta mit einer Zunahme des Gefäßdurchmessers¹ um mindestens 50%. AAA ist potenziell tödlich, da der Bruch zu einer extrem hohen Sterblichkeitsrate führen kann, selbst bei^Intervention 2,3,4. Es wurde berichtet, dass AAA in den USA jährlich für etwa 13.000 Todesfälle verantwortlich ist, was sie zur 10. häufigsten Todesursache ^{von 1,5} macht.

Die Pathogenese von AAA ist noch nicht vollständig verstanden ^6,7,8. Um den molekularen Mechanismus von AAA zu untersuchen und potenzielle therapeutische Ziele zu testen, wurden mehrere experimentelle ^AAA-Modelle erstellt ^9,10. Nagetiermodelle von AAA umfassen Elastase-, Calciumchlorid-, Angiotensin-II^- und Xenograft-Modelle, unter denen das Elastase-induzierte AAA-Modell das am zweithäufigsten verwendete Modell 10,11,12,13,14,15,16,17 ist. Dieses Modell beinhaltet eine direkte Infusion oder Anwendung der porcinen Pankreaselastase (PPE) auf das infrarenale Segment der Aorta. Das Eindringen von Elastase in die mediale Schicht der Aorta führt zum Abbau elastischer Lamellen und zur Infiltration von Entzündungszellen, was zum Verlust der Integrität der Aortenwand und zur anschließenden Erweiterung der Bauchaorta^{führt 7,18}. Das Elastase-induzierte AAA-Modell wurde erstmals 1990 von Anidjar et al. an Ratten berichtet, bei denen ein isoliertes Segment der Aorta mit Elastase¹⁷ durchblutet wurde. Später im Jahr 2012 wurde ein modifiziertes Modell mit einer periadventitiellen Anwendung von PSA von Bhamidipati et ^al.19 berichtet. Heutzutage sind die meisten Operationen für das Elastase-induzierte AAA-Modell von Bhamidipatis Gruppe inspiriert und werden mit der externen Anwendung und nicht mit intraluminaler Perfusion von PSA durchgeführt. Obwohl die externe Anwendung weniger Anforderungen an feine chirurgische Fähigkeiten stellt, ist die Inzidenzrate von AAA relativ niedriger und die Größe etwas kleiner als die der intraluminalen Perfusion^11,19.

Obwohl das Elastase-induzierte AAA-Modell in AAA-Studien weit verbreitet ist, weist es bestimmte Einschränkungen auf. Ein Vorbehalt dieses Modells sind die unvermeidlichen Variationen der Art und Weise, wie die Operation durchgeführt wird, was zu dem Problem der Reproduzierbarkeit führen kann. Zum Beispiel kann der Unterschied im chirurgischen Verfahren bestehen, wie das infrarenale Segment der Aorta isoliert wird und welcher Teil des Segments für die PSA-Anwendung in verschiedenen Labors ausgewählt wird. Die enzymatische Aktivität von PSA und die Zeitdauer der PSA-Inkubation können ebenfalls variieren. Dies sind jedoch alles wesentliche Determinanten, die die eventuelle AAA-Bildungsrate und den Aneurysmadurchmesser beeinflussen. Die Variation dieser kritischen Determinanten macht den Datenvergleich von AAA-Studien aus verschiedenen Gruppen mit diesem Modell sehr schwierig. Daher ist ein standardisierter chirurgischer Eingriff als Werkzeug erforderlich, um vergleichbare Ergebnisse von verschiedenen Institutionen zu erhalten.

Dieser Artikel beschreibt ein standardisiertes chirurgisches Protokoll für das Elastase-induzierte AAA-Modell durch direkte Anwendung von PSA auf die Adventitia der infrarenalen Bauchaorta bei Mäusen. Details über chirurgisches Material und Verfahren, die für eine erfolgreiche und robuste Erzeugung von AAA bei Mäusen mit diesem Modell unerlässlich sind, werden ebenfalls diskutiert.

Protokoll

Die Tierprotokolle wurden vom University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee (PRO00010092) genehmigt. Männliche und weibliche C57BL/6J Wildtyp-Mäuse (WT) im Alter von ~ 7 Wochen wurden für die Experimente verwendet.

1. Tierpräparation

1. Füttern Sie die Mäuse vor und nach der Operation mit der Standard-Chow-Diät (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Verschiedene Stämme und Altersstufen von Mäusen können verwendet werden. Es wird jedoch empfohlen, ein Alter von 5,5 bis 12 Wochen alt zu sein, um eine maximale Inzidenzrate zu erreichen.
2. Verabreichen Sie für jede Maus 30 Minuten vor der Einleitung der Anästhesie 5 mg/kg Carprofen subkutan.
3. Nach 30 min 100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazine über intraperitoneale Injektion verabreichen, um eine Anästhesie zu induzieren.

2. Vorbereitung auf die Operation

1. Bereiten Sie das chirurgische Material vor.
   1. Schneiden Sie die Nitrilhandschuhe in Streifen von 4 cm x 4 mm. Schneiden Sie die Wattepads in Stücke von 3 cm x 2 mm. Autoklavieren Sie diese mit anderen chirurgischen Instrumenten, einschließlich chirurgischer Scheren, Gewebezange und Halsted-Moskito-Hämostaten (siehe Materialtabelle).
2. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein steriles, saugfähiges Verbandspad. Immobilisieren Sie die Vorder- und Hinterpfoten mit chirurgischem Klebeband.
3. Verwenden Sie Applikatoren mit Baumwollspitze (siehe Materialtabelle), um die Haarentfernerlotion über den mittleren und unteren Bauchbereich zu bürsten, und tupfen Sie dann den Bereich mit chirurgischer Gaze ab, um die Haare zu entfernen.
4. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mindestens dreimal in einer kreisförmigen Bewegung mit abwechselnden Anwendungen von 70% Alkohol und einem Peeling auf Jod- oder Chlorhexidinbasis. Trocknen lassen.

3. Chirurgischer Eingriff

1. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um auf die Bauchhöhle zuzugreifen.
   1. Testen Sie die Maus auf das Fehlen einer Zehenklemmreaktion vor dem Hautschnitt.
   2. Machen Sie einen 2,5 cm langen Längseinschnitt auf der Haut entlang der Mittellinie des Mittel- und Unterbauches mit einer chirurgischen Schere.
   3. Ziehen Sie den darunter liegenden Muskel vorsichtig hoch und machen Sie einen 2,5 cm langen Längseinschnitt entlang der Linea alba, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten.
2. Legen Sie die Bauchaorta frei.
   1. Verwenden Sie benetzte Applikatoren mit Baumwollspitze, um den Darm und den Magen auf die rechte Seite der Maus zu bewegen.
      HINWEIS: Im Idealfall wird dadurch das infrarenale Segment der Aorta freigelegt. Wenn die Aorta schwer zu lokalisieren ist, können die rechte Niere und die rechte Nierenarterie die Aorta identifizieren (da die rechte Niere eine etwas niedrigere anatomische Lage hat als die linke Niere).
   2. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Bindegewebe, das die Bauchaorta und die Hohlvene inferior (IVC) bedeckt, vorsichtig zu entfernen.
      HINWEIS: Die Bauchaorta und IVC sind in derselben Gefäßscheide enthalten. Es ist unnötig, das gesamte Bindegewebe zu entfernen, da eine vollständige Entfernung das Risiko einer Beschädigung dieser beiden Gefäße erhöhen würde.
   3. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Rückseite der Bauchaorta und IVC sanft von den darunter liegenden Muskeln zu sezieren.
      HINWEIS: Spitzen der Pinzette sollten quer in die Rückseite der Scheide gehen und ein Loch in der Faszie erzeugen, das die Hülle mit den darunter liegenden Muskeln verbindet. Sobald das Loch gemacht ist, erweitern Sie seine Größe, indem Sie die Pinzette langsam loslassen.
   4. Legen Sie ein Stück des 4 cm x 4 mm großen Handschuhstreifens (wie bereits erwähnt, Schritt 2.1.1) durch die Rückseite der Bauchaorta und IVC, dann richten Sie den Streifen aus. Platzieren Sie den Streifen ~ 0,5 cm von der rechten Nierenarterie entfernt.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Loch groß genug ist, damit die umgebende Faszie den Streifen nicht verdreht.
   5. Über dem Streifen ein Stück 3 cm x 2 mm Wattepad durch die Rückseite der Bauchaorta und IVC legen und dann das Wattepad begradigen.
3. Inkubieren Sie die Elastase.
   1. Verwenden Sie eine Pipette, um 30 μL Schweinepankreas-Elastase (Gesamtenzymaktivität von 1,8 Einheiten, siehe Materialtabelle) auf das Aortensegment über dem Wattepad zu tropfen, wickeln Sie dann das Wattepad und streifen Sie es um die Aorta und IVC. Spülen Sie ein Stück 10 cm x 10 cm Gaze mit steriler 0,9% Kochsalzlösung ab und legen Sie es auf den Bauch.
      HINWEIS: Die Gaze muss nur teilweise gespült werden, da eine Übertreibung die darunter liegende Elastase verdünnen könnte.
   2. Nach 30 min den Streifen und das Wattepad mit einer Pinzette entfernen.
4. Schließen Sie die Bauchhöhle mit den folgenden Schritten.
   1. Bewässern Sie die Aorta und die Bauchhöhle mit 500 μL steriler 0,9% Kochsalzlösung. Verwenden Sie eine 10 cm x 10 cm große Gaze, um die verbleibende Kochsalzlösung zu absorbieren.
   2. Reapproximieren Sie die Muskelschichten mit einer laufenden 6-0 nicht resorbierbaren monofilen Naht.
   3. Schließen Sie die Haut mit 3-4 unterbrochenen 6-0 nicht resorbierbaren monofilen Nähten.

4. Nachsorge

1. Verabreichen Sie 5 mg/kg Carprofen subkutan am postoperativen Tag 1.
2. Entfernen Sie Hautnähte am postoperativen Tag 10.

5. Messung des Durchmessers des Bauchaortenaneurysmas

1. Euthanasie die Mäuse durch CO₂ Überdosierung am postoperativen Tag 14. Dies stellt den Zeitpunkt der maximalen Dilatation dar.
2. Greifen Sie wie in Schritt 3.1 beschrieben auf die Bauchhöhle zu.
3. Führen Sie eine vaskuläre Perfusion durch, indem Sie 10 ml 0,9% Kochsalzlösung durch den linken Ventrikel in den Kreislauf injizieren.
4. Belichten Sie das infrarenale Segment der Bauchaorta, wie in den Schritten 3.1-3.2 beschrieben. Entfernen Sie vorsichtig das umgebende Bindegewebe und trennen Sie die Bauchaorta von IVC.
5. Messen Sie den Durchmesser der Bauchaorta mit einem Bremssattel.

Ergebnisse

Insgesamt dreiundzwanzig 7 Wochen alte Wildtyp-Mäuse (WT), darunter 12 Weibchen und 11 Männchen, wurden nach dem vorgestellten Protokoll operiert. Die Überlebensrate betrug 100% (chirurgische Mortalität ausgeschlossen). Der maximale Durchmesser der Bauchaorta wurde mit einem Bremssattel gemessen.

AAA wurde definiert als Erweiterung der Bauchaorta mit einer 50%igen Gefäßdurchmesserzunahme. Daher wurde eine 50%ige Erhöhung des maximalen Bauchaortendurchmessers als Cut-off-Punkt für eine ...

Diskussion

Das Elastase-induzierte AAA-Modell wurde erstmals 1990 von Anidjar et al. mit Ratten berichtet¹⁷. In den letzten dreißig Jahren wurde eine Vielzahl von modifizierten Versionen eingeführt, zusammen mit einer signifikanten Verbesserung der chirurgischen Techniken ^19,20,21,22. Hunderte von Instituten verwenden Elastase-induzierte AAA-Modelle als das am zweithäufigsten ve...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 non-absorbable monofilament suture	Pro Advantage	P420697
Carprofen	Zoetis Inc.	NDC: 54771-8507
Chow Diet	LabDiet	3005659-220	PicoLab 5L0D
Cotton Applicator	Dynarex	4303
Cotton Pad	Rael	UPC: 810027130969
GraphPad Prism 8	GraphPad Software Inc.		Version 8.4.3
Grarfe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Halsted Mosquito Hemostats	Fine Science Tools	13009-12
Ketamine	Par Pharmaceutical	NDC: 42023-0115-10
Nitrile gloves	Fisherbrand	19-130-1597
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Porcine pancreatic elastase	Sigma-Aldrich	E1250-100MG
Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Sterile 0.9% saline solution	Baxter	2B1324X
Xylazine	Akorn	NDC: 59399-110-20