JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, farelerde infrarenal abdominal aortun adventitisine doğrudan elastaz uygulanması yoluyla elastaz kaynaklı AAA modeli için standartlaştırılmış bir cerrahi yöntemi tanımlamaktadır.

Özet

Abdominal aort anevrizması (AAA), öncelikle asemptomatik olmasına rağmen, AAA'nın rüptürü genellikle yıkıcı bir sonuca sahip olduğu için potansiyel olarak hayatı tehdit edicidir. Şu anda, her biri AAA'nın patogenezinde farklı bir yönü vurgulayan birkaç farklı deneysel AAA modeli vardır. Elastaz kaynaklı AAA modeli, en çok kullanılan ikinci kemirgen AAA modelidir. Bu model, domuz pankreas elastazı (KKD) aortun infrarenal segmentine doğrudan infüzyonunu veya uygulanmasını içerir. Teknik zorluklar nedeniyle, günümüzde elastaz kaynaklı AAA modellerinin çoğu, KKD'nin intraluminal infüzyonu yerine eksternal uygulama ile gerçekleştirilmektedir. Elastaz infiltrasyonu, medial tabakalarda elastik lamellerin bozulmasına neden olur, bu da aort duvarı bütünlüğünün kaybına ve ardından abdominal aortun genişlemesine neden olur. Bununla birlikte, elastaz kaynaklı AAA modelinin bir dezavantajı, ameliyatın nasıl yapıldığının kaçınılmaz varyasyonudur. Spesifik olarak, aortun infrarenal segmentini izole eden cerrahi teknik, aort sargısı ve KKD inkübasyonu için kullanılan malzeme, KKD'nin enzimatik aktivitesi ve KKD uygulamasının süresi, nihai AAA oluşum hızını ve anevrizma çapını etkileyen önemli belirleyiciler olabilir. Özellikle, bu faktörlerin AAA ile ilgili farklı çalışmalardan farkı, tekrarlanabilirlik sorunlarına yol açabilir. Bu makalede, KKD'nin faredeki infrarenal abdominal aortun adventitisine doğrudan uygulanması yoluyla elastaz kaynaklı AAA modelinin ayrıntılı bir cerrahi süreci anlatılmaktadır. Bu prosedürü takiben, erkek ve dişi farelerde yaklaşık% 80'lik stabil bir AAA oluşum oranı elde edilebilir. Elastaz kaynaklı AAA modeli kullanılarak yapılan AAA çalışmalarının tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği, standart bir cerrahi prosedür oluşturularak önemli ölçüde artırılabilir.

Giriş

Abdominal aort anevrizması (AAA), abdominal aortun damar çapının en az %50 arttığı segmental dilatasyonu olarak tanımlanır1. AAA potansiyel olarak ölümcüldür, çünkü rüptürmüdahale 2,3,4 ile bile son derece yüksek bir ölüm oranına neden olabilir. AAA'nın ABD'de yılda yaklaşık 13.000 ölümden sorumlu olduğu bildirilmiştir, bu da onu 1,5'in önde gelen10. ölüm nedeni yapar.

AAA'nın patogenezi henüz tam olarak anlaşılamamıştır 6,7,8. AAA'nın moleküler mekanizmasını araştırmak ve potansiyel terapötik hedefleri test etmek için, çeşitli deneysel AAA modelleri 9,10 oluşturulmuştur. AAA'nın kemirgen modelleri, elastaz, kalsiyum klorür, anjiyotensin II ve ksenogreft modellerini içerir; bunların arasında elastaz kaynaklı AAA modeli, en çok kullanılan ikinci model 10,11,12,13,14,15,16,17'dir. Bu model, domuz pankreas elastazı (KKD) aortun infrarenal segmentine doğrudan infüzyonunu veya uygulanmasını içerir. Elastazın aortun medial tabakasına nüfuz etmesi, elastik lamellerin bozulmasına ve enflamatuar hücrelerin infiltrasyonuna neden olarak aort duvarı bütünlüğünün kaybına ve ardından abdominal aortun genişlemesine yol açacaktır 7,18. Elastaz kaynaklı AAA modeli ilk olarak 1990 yılında Anidjar ve ark. tarafından, aortun izole bir segmentinin elastaz17 ile perfüze edildiği sıçanlar kullanılarak bildirilmiştir. Daha sonra 2012 yılında, KKD'nin periadventitial uygulamasını kullanan değiştirilmiş bir model, Bhamidipati ve ark.19 tarafından bildirilmiştir. Günümüzde, elastaz kaynaklı AAA modeli için yapılan ameliyatların çoğu Bhamidipati'nin grubundan esinlenilmekte ve KKD'nin intraluminal perfüzyonu yerine harici uygulama ile gerçekleştirilmektedir. Eksternal uygulamanın ince cerrahi becerilere daha az gereksinimi olmasına rağmen, AAA insidansı nispeten daha düşüktür ve intraluminal perfüzyon 11,19'dan biraz daha küçüktür.

AAA çalışmalarında yaygın olarak kullanılmasına rağmen, elastaz kaynaklı AAA modeli belirli sınırlamalara sahiptir. Bu modelin bir uyarısı, ameliyatın nasıl yapıldığının kaçınılmaz varyasyonlarıdır ve bu da tekrarlanabilirlik sorununa yol açabilir. Örneğin, cerrahi prosedürde, aortun infrarenal segmentinin nasıl izole edildiği ve segmentin hangi bölümünün farklı laboratuvarlar arasında KKD uygulaması için seçildiği ile ilgili fark olabilir. KKD'nin enzimatik aktivitesi ve KKD inkübasyonunun süresi de değişebilir. Bununla birlikte, bunların hepsi nihai AAA oluşum hızını ve anevrizma çapını etkileyen temel belirleyicilerdir. Bu kritik belirleyicilerin varyasyonu, bu modeli kullanan farklı gruplardan AAA çalışmalarının veri karşılaştırmasını çok zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, çeşitli kurumlardan karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için bir araç olarak standartlaştırılmış bir cerrahi prosedüre ihtiyaç vardır.

Bu makalede, farelerde infrarenal abdominal aort adventitisine KKD'nin doğrudan uygulanması yoluyla elastaz kaynaklı AAA modeli için standartlaştırılmış bir cerrahi protokol anlatılmaktadır. Bu modeli kullanan farelerde başarılı ve sağlam AAA üretimi için gerekli cerrahi malzeme ve prosedürler hakkında detaylar da tartışılacaktır.

Protokol

Hayvan protokolleri, Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (PRO00010092) tarafından onaylanmıştır. Deneyler için ~7 haftalık erkek ve dişi C57BL / 6J vahşi tip (WT) fareler kullanıldı.

1. Hayvan hazırlığı

  1. Fareleri ameliyattan önce ve sonra standart chow diyetiyle (bakınız Malzeme Tablosu) besleyin.
    NOT: Farklı fare suşları ve yaşları kullanılabilir. Ancak maksimum insidans oranına ulaşmak için 5.5-12 haftalık yaş aralığı önerilmektedir.
  2. Her fare için, anestezi indüksiyonundan 30 dakika önce deri altından 5 mg / kg Carprofen uygulayın.
  3. 30 dakika sonra, anesteziyi indüklemek için intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 100 mg / kg Ketamin ve 5mg / kg Ksilazin uygulayın.

2. Ameliyata hazırlık

  1. Cerrahi malzemeyi hazırlayın.
    1. Nitril eldivenleri 4 cm x 4 mm'lik şeritler halinde kesin. Pamuklu pedleri 3 cm x 2 mm'lik parçalar halinde kesin. Bunları cerrahi makas, doku forsepsleri ve Halsted-Mosquito hemostatları dahil olmak üzere diğer cerrahi aletlerle otoklav yapın (bkz.
  2. Fareyi steril emici bir pansuman pedi üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Ön ve arka pençeleri cerrahi bantla hareketsiz hale getirin.
  3. Orta ve alt karın bölgesi üzerinde saç sökücü losyon fırçalamak için pamuk uçlu aplikatörler kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız), ardından saçları çıkarmak için bölgeyi cerrahi gazlı bezle sürün.
  4. Cerrahi alanı% 70 alkol ve iyot bazlı veya klorheksidin bazlı bir ovma alternatif uygulamaları ile dairesel bir hareketle en az üç kez dezenfekte edin. Kurumaya bırakın.

3. Ameliyat prosedürü

  1. Karın boşluğuna erişmek için aşağıdaki adımları uygulayın.
    1. Cilt insizyonundan önce fareyi ayak parmağını sıkıştırma tepkisinin olmaması açısından test edin.
    2. Cerrahi makas kullanarak orta ve alt karın orta çizgisi boyunca cilt üzerinde 2,5 cm uzunlamasına bir kesi yapın.
    3. Altta yatan kası yavaşça yukarı çekin ve karın boşluğuna erişmek için linea alba boyunca 2,5 cm uzunlamasına bir kesi yapın.
  2. Abdominal aortu açığa çıkarın.
    1. Bağırsakları ve mideyi farenin sağ tarafına taşımak için ıslak pamuk uçlu aplikatörler kullanın.
      NOT: İdeal olarak, bu aortun infrarenal segmentini açığa çıkaracaktır. Aortun bulunması zorsa, sağ böbrek ve sağ renal arter aortu tanımlayabilir (sağ böbrek sol böbrekten biraz daha düşük bir anatomik lokalizasyona sahip olduğundan).
    2. Abdominal aort ve inferior vena kavayı (IVC) kaplayan bağ dokusunu nazikçe çıkarmak için forseps kullanın.
      NOT: Abdominal aort ve IVC aynı damar kılıfı içinde bulunur. Tüm bağ dokusunun çıkarılması gereksizdir, çünkü tamamen çıkarılması bu iki damara zarar verme riskini artıracaktır.
    3. Abdominal aortun arka tarafını ve IVC'yi altta yatan kaslardan nazikçe diseke etmek için forseps kullanın.
      NOT: Forsepslerin uçları kılıfın arka tarafına enine girmeli ve fasyada kılıfı altta yatan kaslara bağlayan bir delik oluşturmalıdır. Delik açıldıktan sonra, forsepsleri yavaşça serbest bırakarak boyutunu genişletin.
    4. 4 cm x 4 mm eldiven şeridinin bir parçasını (daha önce de belirtildiği gibi, adım 2.1.1) abdominal aort ve IVC'nin arka tarafına yerleştirin, ardından şeridi düzeltin. Şeridi sağ renal arterden ~ 0,5 cm uzağa yerleştirin.
      NOT: Deliğin yeterince büyük olduğundan emin olun, böylece çevredeki fasya, şeridi bükmez.
    5. Şeridin üstüne, karın aortunun ve IVC'nin arka tarafına 3 cm x 2 mm pamuklu ped parçası yerleştirin, ardından pamuklu pedi düzeltin.
  3. Elastazı inkübe edin.
    1. 30 μL domuz pankreas elastazı (toplam enzimatik aktivite 1.8 birim, bakınız Malzeme Tablosu) pamuklu pedin üzerindeki aort segmentine damlatmak için bir pipet kullanın, ardından pamuklu pedi sarın ve aort ve IVC'nin etrafına şerit çekin. 10 cm x 10 cm'lik bir gazlı bez parçasını steril% 0.9 salin ile durulayın ve karın üzerine yerleştirin.
      NOT: Gazlı bezin sadece kısmi durulamaya ihtiyacı vardır, çünkü aşırıya kaçmak altındaki elastazı seyreltme riski taşır.
    2. 30 dakika sonra, çizgiyi ve pamuklu pedi forsepsle çıkarın.
  4. Aşağıdaki adımları izleyerek karın boşluğunu kapatın.
    1. Aort ve karın boşluğunu 500 μL steril% 0.9 salin ile sulayın. Kalan salini emmek için 10 cm x 10 cm'lik bir gazlı bez kullanın.
    2. Kas katmanlarını 6-0 emilemeyen monofilament sütür ile yeniden yakınlaştırın.
    3. 3-4 kesilmiş 6-0 emilemeyen monofilament dikişlerle yakın cilt.

4. Ameliyat sonrası bakım

  1. Ameliyat sonrası 1. günde 5mg / kg Carprofen'i deri altından uygulayın.
  2. Ameliyat sonrası 10. günde cilt dikişlerini çıkarın.

5. Abdominal aort anevrizması çapının ölçülmesi

  1. Ameliyat sonrası 14. günde CO2 doz aşımı ile fareleri ötenazileştirin. Bu, maksimum dilatasyonun zaman noktasını temsil eder.
  2. Adım 3.1'de açıklandığı gibi karın boşluğuna erişin.
  3. Sol ventrikülden dolaşıma 10 mL% 0.9 salin enjekte ederek vasküler perfüzyon yapın.
  4. Abdominal aortun infrarenal segmentini adım 3.1-3.2'de açıklandığı gibi ortaya çıkarın. Çevreleyen bağ dokusunu dikkatlice çıkarın ve abdominal aortu IVC'den ayırın.
  5. Abdominal aortun çapını bir kumpas ile ölçün.

Sonuçlar

Sunulan protokolü takiben, 12 dişi ve 11 erkek olmak üzere toplam yirmi üç 7 haftalık vahşi tip (WT) fare ameliyat edildi. Sağkalım oranı %100 idi (cerrahi mortalite hariç). Maksimal abdominal aort çapı kumpas ile ölçüldü.

AAA, abdominal aortun damar çapının %50 artması ile dilate edilmesi olarak tanımlandı. Bu nedenle, başarılı AAA indüksiyonu için kesme noktası olarak maksimal abdominal aort çapında% 50'lik bir artış seçildi. Bu kritere dayanarak, ameliyat s...

Tartışmalar

Elastaz kaynaklı AAA modeli ilk olarak Anidjar ve ark. tarafından 1990 yılında sıçanlar kullanılarak bildirilmiştir17. Son otuz yılda çeşitli modifiye versiyonlar tanıtılmış ve cerrahi tekniklerde önemli gelişmeler kaydedilmiştir 19,20,21,22. Yüzlerce enstitü, AAA çalışmaları için en çok kullanılan ikinci kemirgen deney modeli olarak elastaz ka...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Michigan Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Tıbbı Birimi'ne hayvan besleme ve yetiştirme konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH RO1 HL138139, J. Zhang'a NIH RO1 HL153710, YE Chen'e NIH RO1 HL109946, RO1 HL134569 ve Amerikan Kalp Derneği hibesi G. Zhao'ya 20POST35110064 tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
6-0 non-absorbable monofilament suturePro AdvantageP420697
CarprofenZoetis Inc.NDC: 54771-8507
Chow DietLabDiet3005659-220PicoLab 5L0D
Cotton ApplicatorDynarex4303
Cotton PadRaelUPC: 810027130969
GraphPad Prism 8GraphPad Software Inc.Version 8.4.3
Grarfe ForcepsFine Science Tools11051-10
Halsted Mosquito HemostatsFine Science Tools13009-12
KetaminePar PharmaceuticalNDC: 42023-0115-10
Nitrile glovesFisherbrand19-130-1597
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher15140122
Porcine pancreatic elastaseSigma-AldrichE1250-100MG
ScissorsFine Science Tools14068-12
Sterile 0.9% saline solutionBaxter2B1324X
XylazineAkornNDC: 59399-110-20

Referanslar

  1. Kent, K. C. Clinical practice: Abdominal aortic aneurysms. The New England Journal of Medicine. 371 (22), 2101-2108 (2014).
  2. Karthikesalingam, A., et al. Mortality from ruptured abdominal aortic aneurysms: Clinical lessons from a comparison of outcomes in England and the USA. Lancet. 383 (9921), 963-969 (2014).
  3. Noel, A. A., et al. Ruptured abdominal aortic aneurysms: The excessive mortality rate of conventional repair. Journal of Vascular Surgery. 34 (1), 41-46 (2001).
  4. Lederle, F. A., et al. Rupture rate of large abdominal aortic aneurysms in patients refusing or unfit for elective repair. JAMA. 287 (22), 2968-2972 (2002).
  5. Kochanek, K. D., Xu, J., Murphy, S. L., Minino, A. M., Kung, H. C. Deaths: Final data for 2009. National Vital Statistics Reports. 60 (3), 1 (2011).
  6. Daugherty, A., Cassis, L. A. Mechanisms of abdominal aortic aneurysm formation. Current Atherosclerosis Reports. 4 (3), 222-227 (2002).
  7. Quintana, R. A., Taylor, W. R. Cellular mechanisms of aortic aneurysm formation. Circulation Research. 124 (4), 607-618 (2019).
  8. Kuivaniemi, H., Ryer, E. J., Elmore, J. R., Tromp, G. Understanding the pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 13 (9), 975-987 (2015).
  9. Trollope, A., Moxon, J. V., Moran, C. S., Golledge, J. Animal models of abdominal aortic aneurysm and their role in furthering management of human disease. Cardiovascular Pathology. 20 (2), 114-123 (2011).
  10. Patelis, N., et al. Animal models in the research of abdominal aortic aneurysms development. Physiological Research. 66 (6), 899-915 (2017).
  11. Senemaud, J., et al. Translational relevance and recent advances of animal models of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (3), 401-410 (2017).
  12. Lysgaard Poulsen, J., Stubbe, J., Lindholt, J. S. Animal models used to explore abdominal aortic aneurysms: A systematic review. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 52 (4), 487-499 (2016).
  13. Tsui, J. C. Experimental models of abdominal aortic aneurysms. Open Cardiovascular Medicine Journal. 4, 221-230 (2010).
  14. Manning, M. W., Cassi, L. A., Huang, J., Szilvassy, S. J., Daugherty, A. Abdominal aortic aneurysms: Fresh insights from a novel animal model of the disease. Vascular Medicine. 7 (1), 45-54 (2002).
  15. Chiou, A. C., Chiu, B., Pearce, W. H. Murine aortic aneurysm produced by periarterial application of calcium chloride. Journal of Surgical Research. 99 (2), 371-376 (2001).
  16. Allaire, E., Guettier, C., Bruneval, P., Plissonnier, D., Michel, J. B. Cell-free arterial grafts: Morphologic characteristics of aortic isografts, allografts, and xenografts in rats. Journal of Vascular Surgery. 19 (3), 446-456 (1994).
  17. Anidjar, S., et al. Elastase-induced experimental aneurysms in rats. Circulation. 82 (3), 973-981 (1990).
  18. Sun, J., et al. Mast cells modulate the pathogenesis of elastase-induced abdominal aortic aneurysms in mice. Journal of Clinical Investigation. 117 (11), 3359-3368 (2007).
  19. Bhamidipati, C. M., et al. Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase. Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).
  20. Pyo, R., et al. Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1641-1649 (2000).
  21. Tanaka, A., Hasegawa, T., Chen, Z., Okita, Y., Okada, K. A novel rat model of abdominal aortic aneurysm using a combination of intraluminal elastase infusion and extraluminal calcium chloride exposure. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1423-1432 (2009).
  22. Busch, A., et al. Four surgical modifications to the classic elastase perfusion aneurysm model enable haemodynamic alterations and extended elastase perfusion. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 56 (1), 102-109 (2018).
  23. Liang, W., et al. KLF11 protects against venous thrombosis via suppressing tissue factor expression. Thrombosis and Haemostasis. , (2021).
  24. Marinov, G. R., et al. Can the infusion of elastase in the abdominal aorta of the Yucatan miniature swine consistently produce experimental aneurysms. Journal of Investigative Surgery. 10 (3), 129-150 (1997).
  25. Shannon, A. H., et al. Porcine model of infrarenal abdominal aortic aneurysm. Journal of Visualized Experiments. (153), e60169 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır