血管周围应用弹性蛋白酶诱导的小鼠腹主动脉瘤模型

摘要

本方案描述了一种标准化的手术方法，通过弹性蛋白酶直接应用于小鼠红外腹主动脉的外来，用于弹性蛋白酶诱导的AAA模型。

摘要

腹主动脉瘤 （AAA） 虽然主要无症状，但可能危及生命，因为 AAA 破裂通常具有毁灭性后果。目前，AAA有几种不同的实验模型，每种模型都强调AAA发病机制的不同方面。弹性蛋白酶诱导的AAA模型是第二常用的啮齿动物AAA模型。该模型涉及直接输注或应用猪胰腺弹性蛋白酶（PPE）到主动脉的红外线段。由于技术挑战，现在大多数弹性蛋白酶诱导的AAA模型都是通过外部应用而不是腔内输注PPE进行的。弹性蛋白酶的浸润会导致内侧层弹性薄片的降解，导致主动脉壁完整性的丧失和随后的腹主动脉扩张。然而，弹性蛋白酶诱导的AAA模型的一个缺点是手术方式的不可避免的变化。具体而言，分离主动脉红外段的手术技术、用于主动脉包裹和PPE孵育的材料、PPE的酶活性以及PPE应用的持续时间都是影响最终AAA形成速率和动脉瘤直径的重要决定因素。值得注意的是，这些因素与AAA不同研究的差异可能导致可重复性问题。本文描述了弹性蛋白酶诱导的AAA模型的详细手术过程，方法是将PPE直接应用于小鼠红外腹主动脉的外膜。按照这一程序，雄性和雌性小鼠的稳定AAA形成率约为80%是可以实现的。通过建立标准外科手术，使用弹性蛋白酶诱导的AAA模型的AAA研究的一致性和可重复性可以显着提高。

引言

腹主动脉瘤 （AAA） 定义为腹主动脉节段性扩张，血管直径至少增加 50%¹。AAA可能是致命的，因为破裂可导致极高的死亡率，即使有干预^2，3，4。据报道，AAA每年在美国造成约13，000人死亡，这使其成为^第 10大死因^1，5。

AAA的发病机制尚未完全了解^6，7，8。为了研究AAA的分子机制并测试潜在的治疗靶点，已经建立了几个实验AAA模型^9，10。AAA的啮齿动物模型包括弹性蛋白酶、氯化钙、血管紧张素II和异种移植物模型，其中弹性蛋白酶诱导的AAA模型是第二常用的模型^{10、11、12、13、14、15、16、17}。该模型涉及直接输注或应用猪胰腺弹性蛋白酶（PPE）到主动脉的红外线段。弹性蛋白酶渗透到主动脉的内侧层将导致弹性薄片的降解和炎性细胞的浸润，导致主动脉壁完整性的丧失和随后腹主动脉^7，18的扩张。弹性蛋白酶诱导的AAA模型于1990年由Anidjar等人使用大鼠首次报道，其中分离的主动脉部分灌注弹性蛋白酶¹⁷。2012年晚些时候，Bhamidipati等人报告了使用个人防护装备的腹膜应用的改进^模型。如今，弹性蛋白酶诱导的AAA模型的大多数手术都受到Bhamidipati组的启发，并且通过外部应用而不是PPE的腔内灌注进行。虽然外用对精细手术技能的要求较低，但AAA的发生率相对较低，且尺寸略小于腔内灌注^11，19。

虽然在AAA研究中广泛使用，但弹性蛋白酶诱导的AAA模型具有一定的局限性。该模型的一个警告是手术方式的不可避免的变化，这可能导致可重复性的问题。例如，在如何分离主动脉的红外线段以及选择该段的哪个部分用于不同实验室的PPE应用方面，外科手术中可能存在差异。PPE的酶活性和PPE孵育的持续时间也可能不同。然而，这些都是影响最终AAA形成率和动脉瘤直径的基本决定因素。这些关键决定因素的变化使得使用该模型的不同组的AAA研究的数据比较非常困难。因此，需要标准化的外科手术程序作为从各种机构获得可比结果的工具。

本文描述了弹性蛋白酶诱导的AAA模型的标准化手术方案，方法是将PPE直接应用于小鼠红外腹主动脉的外膜。还将讨论有关使用此模型在小鼠中成功和稳健地生成AAA所必需的手术材料和程序的详细信息。

研究方案

动物协议已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（PRO00010092）的批准。雄性和雌性C57BL / 6J野生型（WT）小鼠，〜7周龄，用于实验。

1. 动物准备

1. 在手术前后用标准的食物喂养小鼠（参见 材料表）。
   注意:可以使用不同的菌株和年龄的小鼠。然而，建议年龄在 5.5-12 周龄范围内，以达到最大发病率。
2. 对于每只小鼠，在麻醉诱导前30分钟皮下施用5mg / kg卡洛芬。
3. 30分钟后， 通过 腹膜注射给予100mg / kg氯胺酮和5mg / kg甲苯噻嗪以诱导麻醉。

2. 手术准备

1. 准备手术材料。
   1. 将丁腈手套切成4厘米x 4毫米的条状。将化妆棉切成3厘米x 2毫米的碎片。用其他手术器械高压灭菌这些，包括手术剪刀，组织镊子和Halsted-Mosquito止血器（ 见材料表）。
2. 将鼠标置于无菌吸收剂敷料垫上的仰卧位。用手术胶带固定前爪和后爪。
3. 使用棉头涂抹器（见 材料表）将脱毛剂化妆水刷在中下腹部区域，然后用手术纱布擦拭该区域以去除毛发。
4. 以打圈的方式对手术区域进行至少三次消毒，交替使用70%酒精和碘基或氯己定基磨砂膏。让其干燥。

3. 手术程序

1. 执行以下步骤以进入腹腔。
   1. 在皮肤切口前测试小鼠缺乏脚趾夹反应。
   2. 使用手术剪刀沿着中下腹部的中线在皮肤上做一个2.5厘米的纵向切口。
   3. 轻轻拉起下面的肌肉，沿着白线做一个2.5厘米的纵向切口，以进入腹腔。
2. 暴露腹主动脉。
   1. 使用湿润的棉头涂抹器将肠道和胃移动到小鼠的右侧。
      注意:理想情况下，这将暴露主动脉的红外线段。如果主动脉难以定位，右肾和右肾动脉可以识别主动脉（因为右肾的解剖位置略低于左肾）。
   2. 使用镊子轻轻切除覆盖腹主动脉和下腔静脉（IVC）的结缔组织。
      注意:腹主动脉和IVC包含在同一血管鞘内。没有必要去除所有结缔组织，因为完全去除会增加损坏这两个血管的风险。
   3. 使用镊子轻轻地从下面的肌肉中解剖腹主动脉和IVC的背面。
      注意:镊子的尖端应横向进入鞘的背面，并在筋膜上形成一个将鞘连接到下层肌肉的孔。一旦孔被打好，通过缓慢释放镊子来扩大其尺寸。
   4. 将一块4厘米x 4毫米的手套条纹（如前所述，步骤2.1.1）穿过腹主动脉和IVC的背面，然后拉直条纹。将条纹放置在距离右肾动脉约0.5厘米的地方。
      注意:确保孔足够大，以便周围的筋膜不会扭曲条纹。
   5. 在条纹上方，将一块3厘米x 2毫米的化妆棉垫穿过腹主动脉和IVC的背面，然后拉直化妆棉。
3. 孵育弹性蛋白酶。
   1. 使用移液器将30μL猪胰腺弹性蛋白酶（总酶活性为1.8单位，见 材料表）滴到化妆棉上方的主动脉段上，然后将化妆棉包裹在主动脉和IVC周围。用无菌的0.9%盐水冲洗一块10厘米x 10厘米的纱布，并将其放在腹部。
      注意:纱布只需要部分冲洗，因为过量使用可能会稀释下面的弹性蛋白酶。
   2. 30分钟后，用镊子取下条纹和化妆棉。
4. 按照以下步骤关闭腹腔。
   1. 用500μL无菌0.9%盐水冲洗主动脉和腹腔。使用10厘米x 10厘米的纱布吸收剩余的盐水。
   2. 用6-0不可吸收的单丝缝合线重新靠近肌肉层。
   3. 用3-4根中断的6-0不可吸收的单丝缝合线闭合皮肤。

4. 术后护理

1. 术后第1天皮下注射5mg / kg卡洛芬。
2. 在术后第10天去除皮肤缝合线。

5. 测量腹主动脉瘤直径

1. 在术后第₁₄ 天通过CO 2过量对小鼠实施安乐死。这表示最大膨胀的时间点。
2. 按照步骤3.1中所述进入腹腔。
3. 通过将 10 mL 0.9% 盐水通过左心室注射到循环中来进行血管灌注。
4. 暴露腹主动脉的红外线段，如步骤3.1-3.2中所述。小心切除周围的结缔组织，将腹主动脉与IVC分开。
5. 用卡尺测量腹主动脉的直径。

结果

总共有23只7周龄的野生型（WT）小鼠，包括12只雌性和11只雄性，按照所提出的方案进行手术。存活率为100%（不包括手术死亡率）。最大腹主动脉直径由卡尺测量。

AAA被定义为腹主动脉扩张，血管直径增加50%。因此，选择腹主动脉最大直径增加 50% 作为成功 AAA 诱导的临界点。根据这一标准，雌性动物术后第14天AAA的发生率为91.7%，接受手术的12只动物中有11只发展为AAA;而雄性动...

讨论

弹性蛋白酶诱导的AAA模型首先由Anidjar等人于1990年使用大鼠报道¹⁷。在过去的三十年中，已经引入了各种改进版本，同时在手术技术方面有显着改进^{19，20，21，22}。数百个研究所使用弹性蛋白酶诱导的AAA模型作为AAA研究的第二常用啮齿动物实验模型¹²。很自然，不同?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 non-absorbable monofilament suture	Pro Advantage	P420697
Carprofen	Zoetis Inc.	NDC: 54771-8507
Chow Diet	LabDiet	3005659-220	PicoLab 5L0D
Cotton Applicator	Dynarex	4303
Cotton Pad	Rael	UPC: 810027130969
GraphPad Prism 8	GraphPad Software Inc.		Version 8.4.3
Grarfe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Halsted Mosquito Hemostats	Fine Science Tools	13009-12
Ketamine	Par Pharmaceutical	NDC: 42023-0115-10
Nitrile gloves	Fisherbrand	19-130-1597
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Porcine pancreatic elastase	Sigma-Aldrich	E1250-100MG
Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Sterile 0.9% saline solution	Baxter	2B1324X
Xylazine	Akorn	NDC: 59399-110-20