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要約

本プロトコールは、マウスの腹部内大動脈の外側へのエラスターゼの直接適用によるエラスターゼ誘導AAAモデルのための標準化された外科的方法を記載する。

要約

腹部大動脈瘤(AAA)は、主に無症候性であるが、AAAの破裂は通常壊滅的な結果をもたらすため、潜在的に生命を脅かす可能性がある。現在、AAAのいくつかの異なる実験モデルがあり、それぞれがAAAの病因における異なる側面を強調している。エラスターゼ誘導AAAモデルは、2番目に多く使用されるげっ歯類AAAモデルである。このモデルは、大動脈の炎症領域へのブタ膵臓エラスターゼ(PPE)の直接注入または適用を含む。技術的な課題のため、今日のほとんどのエラスターゼ誘導AAAモデルは、PPEの管腔内注入ではなく外部適用で実施される。エラスターゼの浸潤は、内側層における弾性層層の分解を引き起こし、その結果、大動脈壁の完全性の喪失およびその後の腹部大動脈の拡張をもたらす。しかしながら、エラスターゼ誘導AAAモデルの1つの欠点は、手術の実施方法の必然的な変動である。具体的には、大動脈の内腎セグメントを単離する外科的技術、大動脈ラッピングおよびPPEインキュベーションに使用される材料、PPEの酵素活性、およびPPE適用の時間持続時間はすべて、最終的なAAA形成速度および動脈瘤径に影響を及ぼす重要な決定因子となり得る。特に、AAAに関するさまざまな研究からのこれらの要因の違いは、再現性の問題につながる可能性があります。本稿では、マウスの腹部内大動脈の外側へのPPEの直接適用によるエラスターゼ誘導AAAモデルの詳細な外科的プロセスを説明する。この手順に従うと、雄および雌マウスにおいて約80%の安定したAAA形成率が達成可能である。エラスターゼ誘導AAAモデルを用いたAAA研究の一貫性および再現性は、標準的な外科的処置を確立することによって有意に増強され得る。

概要

腹部大動脈瘤(AAA)は、血管径1の少なくとも50%の増加を伴う腹部大動脈の分節拡張として定義される。AAAは、破裂が介入2,3,4であっても非常に高い死亡率をもたらす可能性があるため、潜在的に致命的である。AAAは米国で年間約13,000人の死亡の原因となっていると報告されており、これは1,5人の死因の第10位となっています。

AAAの病因はまだ完全には理解されていない6,7,8。AAAの分子機構を調査し、潜在的な治療標的を試験するために、いくつかの実験的AAAモデルが確立されている9、10。AAAのげっ歯類モデルには、エラスターゼ、塩化カルシウム、アンジオテンシンIIおよび異種移植片モデルが含まれ、その中でエラスターゼ誘導AAAモデルは、2番目に多く使用されるモデル10、11、12、13、14、15、16、17である。このモデルは、大動脈の炎症領域へのブタ膵臓エラスターゼ(PPE)の直接注入または適用を含む。大動脈の内側層へのエラスターゼの浸透は、弾性層状の分解および炎症性細胞の浸潤を引き起こし、大動脈壁の完全性の喪失およびその後の腹部大動脈の拡張をもたらす7,18。エラスターゼ誘導AAAモデルは、1990年にAnidjarらによってラットを用いて最初に報告され、大動脈の単離された部分をエラスターゼ17で灌流した。2012年後半に、PPEの周到性適用を用いた改変モデルがBhamidipatiらによって報告された19。今日、エラスターゼ誘導AAAモデルのほとんどの手術は、バミディパティのグループに触発され、PPEの管腔内灌流ではなく外部適用で行われます。外部適用は、細かい外科的技能に対する要求が少ないが、AAAの発生率は比較的低く、管腔内灌流のそれよりも幾分小さいサイズ11,19。

AAA研究で広く使用されているが、エラスターゼ誘導AAAモデルには一定の限界がある。このモデルの1つの注意点は、手術の実施方法の必然的な変動であり、再現性の問題につながる可能性があります。例えば、大動脈の破腎セグメントがどのように単離されるか、およびセグメントのどの部分が異なる実験室間でPPE適用のために選択されるかに関して、外科的処置に相違が存在する可能性がある。PPEの酵素活性およびPPEインキュベーションの時間持続時間も変化し得る。しかし、これらはすべて、最終的なAAA形成速度および動脈瘤直径に影響を及ぼす重要な決定因子である。これらの重要な決定要因の変動は、このモデルを使用する異なるグループからのAAA研究のデータ比較を非常に困難にする。したがって、標準化された外科的処置は、様々な機関から同等の結果を得るためのツールとして必要とされている。

本稿では、マウスの腹部内大動脈の外側へのPPEの直接適用によるエラスターゼ誘導AAAモデルの標準化された外科的プロトコールについて説明する。このモデルを用いたマウスにおけるAAAの正常かつ堅牢な生成に不可欠な外科的材料および手順に関する詳細についても議論する。

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プロトコル

動物プロトコルは、ミシガン大学機関動物ケアおよび使用委員会(PRO00010092)によって承認された。雄および雌のC57BL/6J野生型(WT)マウス、〜7週齢を、実験に使用した。

1. 動物の準備

  1. 手術の前後に標準的な固形飼料( 材料表を参照)をマウスに給餌する。
    注:マウスの異なる系統および年齢を使用することができる。しかし、最大発生率を達成するためには、5.5〜12週齢の範囲の年齢が推奨される。
  2. 各マウスについて、麻酔開始の30分前に5mg / kgのカルプロフェンを皮下投与する。
  3. 30分後、100mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジンを腹腔内注射 で 投与し、麻酔を誘発する。

2. 手術の準備

  1. 手術材料を準備する。
    1. ニトリル手袋を4 cm x 4 mmの短冊に切ります。綿のパッドを3 cm x 2 mmの断片に切ります。これらを、外科用はさみ、組織鉗子、およびハルステッド蚊止血器を含む他の手術器具でオートクレーブする( 材料表を参照)。
  2. マウスを滅菌吸収性ドレッシングパッド上の仰臥位に置きます。前足と後足を外科用テープで固定します。
  3. 綿先のアプリケーター( 材料表を参照)を使用して、中腹部と下腹部にヘアリムーバーローションをブラッシングし、手術用ガーゼでその領域を拭き取って髪を取り除きます。
  4. 70%アルコールとヨウ素系またはクロルヘキシジン系のスクラブを交互に塗布して、円運動で手術領域を少なくとも3回消毒する。乾燥させます。

3. 手術手順

  1. 腹腔にアクセスするには、次の手順を実行します。
    1. 皮膚切開前につま先ピンチ反応の欠如についてマウスをテストします。
    2. 外科用はさみを使用して、中腹部および下腹部の正中線に沿って皮膚に2.5cm縦切開を行う。
    3. 下にある筋肉を静かに引き上げ、腹腔にアクセスするためにアルバ線に沿って2.5cmの縦方向切開を行う。
  2. 腹部大動脈を露出させる。
    1. 濡れた綿先のアプリケーターを使用して、腸と胃をマウスの右側に動かします。
      注:理想的には、これは大動脈の収縮部を露出させる。大動脈を見つけるのが難しい場合、右腎臓と右腎動脈は大動脈を識別することができます(右腎臓は左腎臓よりも解剖学的位置がわずかに低いため)。
    2. 鉗子を使用して、腹部大動脈および下大静脈(IVC)を覆う結合組織を静かに除去する。
      注:腹部大動脈とIVCは同じ血管シース内に含まれています。完全な除去はこれら2つの血管を損傷するリスクを増加させるので、すべての結合組織を除去する必要はない。
    3. 鉗子を使用して、腹部大動脈の裏側とIVCを下層の筋肉から静かに解剖します。
      注:鉗子の先端は、横方向にシースの裏側に入り、シースを基礎となる筋肉に接続する筋膜に穴を開ける必要があります。穴が開いたら、鉗子をゆっくりと離してサイズを広げます。
    4. 4 cm x 4 mm の手袋ストライプ (前述のように、ステップ 2.1.1) を腹部大動脈と IVC の裏側から挿入し、ストライプをまっすぐにします。縞模様を右腎動脈から約0.5cm離して置きます。
      メモ: 周囲の筋膜が縞模様をねじらないように、穴が十分に大きいことを確認してください。
    5. ストライプの上に、腹部大動脈とIVCの裏側を通して3cm x 2mmの綿パッドを置き、綿パッドをまっすぐにします。
  3. エラスターゼをインキュベートする。
    1. ピペットを使用して、30 μLのブタ膵臓エラスターゼ(総酵素活性1.8単位、 材料表を参照)を綿パッドの上の大動脈セグメントに滴下し、綿パッドを包み込み、大動脈とIVCの周りにストライプします。10 cm x 10 cmガーゼを滅菌した0.9%生理食塩水ですすぎ、腹部に置きます。
      注:ガーゼは、過度のやり過ぎが下のエラスターゼを希釈する危険性があるため、部分的なすすぎのみが必要です。
    2. 30分後、鉗子でストライプと綿のパッドを取り除きます。
  4. 以下の手順に従って腹腔を閉じます。
    1. 大動脈および腹腔を500μLの滅菌0.9%生理食塩水で灌漑する。10 cm x 10 cmのガーゼを使用して、残りの生理食塩水を吸収します。
    2. ランニング6-0非吸収性モノフィラメント縫合糸で筋肉層を再近似する。
    3. 3-4中断された6-0非吸収性モノフィラメント縫合糸で皮膚を閉じる。

4. 術後ケア

  1. 術後1日目に5mg / kgのカルプロフェンを皮下投与する。
  2. 術後10日目に皮膚縫合糸を除去する。

5. 腹部大動脈瘤径の測定

  1. 術後14日目にCO2 過剰摂取によりマウスを安楽死させる。これは、最大拡張の時点を表します。
  2. ステップ3.1の説明に従って腹腔にアクセスします。
  3. 左心室を通る循環に0.9%生理食塩水10mLを注入して血管灌流を行う。
  4. ステップ3.1-3.2で説明されているように腹部大動脈の背部部分を露出させる。周囲の結合組織を慎重に除去し、腹部大動脈をIVCから分離する。
  5. ノギスで腹部大動脈の直径を測定します。

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結果

12匹の雌および11匹の雄を含む合計23匹の7週齢の野生型(WT)マウスを、提示されたプロトコールに従って操作した。生存率は100%であった(外科的死亡率は除く)。腹部大動脈の最大径はノギスにより測定した。

AAAは、50%の血管径増加を伴う腹部大動脈を拡張することと定義した。したがって、腹部大動脈の最大径の50%の増加が、AAA誘導を成功させるためのカットオフポイント...

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ディスカッション

エラスターゼ誘導AAAモデルは、1990年にラットを用いてAnidjarらによって最初に報告された17。様々な修正版が過去30年間に導入され、外科的技術19,20,21,22の大幅な改善が伴った。何百もの研究機関が、AAA研究で2番目に多く使用されているげっ歯類実験モデルとしてエラスターゼ誘?...

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開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

ミシガン大学の実験動物医学ユニットには、動物の給餌と繁殖に関する彼らの助けに感謝します。この研究は、J. Zhangに対するNIH RO1 HL1 HL153710、J. ZhangへのNIH RO1 HL1 HL109946、Y.E. ChenへのRO1 HL134569、およびG. Zhaoへの米国心臓協会の助成金20POST35110064によって支持されている。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
6-0 non-absorbable monofilament suturePro AdvantageP420697
CarprofenZoetis Inc.NDC: 54771-8507
Chow DietLabDiet3005659-220PicoLab 5L0D
Cotton ApplicatorDynarex4303
Cotton PadRaelUPC: 810027130969
GraphPad Prism 8GraphPad Software Inc.Version 8.4.3
Grarfe ForcepsFine Science Tools11051-10
Halsted Mosquito HemostatsFine Science Tools13009-12
KetaminePar PharmaceuticalNDC: 42023-0115-10
Nitrile glovesFisherbrand19-130-1597
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher15140122
Porcine pancreatic elastaseSigma-AldrichE1250-100MG
ScissorsFine Science Tools14068-12
Sterile 0.9% saline solutionBaxter2B1324X
XylazineAkornNDC: 59399-110-20

参考文献

  1. Kent, K. C. Clinical practice: Abdominal aortic aneurysms. The New England Journal of Medicine. 371 (22), 2101-2108 (2014).
  2. Karthikesalingam, A., et al. Mortality from ruptured abdominal aortic aneurysms: Clinical lessons from a comparison of outcomes in England and the USA. Lancet. 383 (9921), 963-969 (2014).
  3. Noel, A. A., et al. Ruptured abdominal aortic aneurysms: The excessive mortality rate of conventional repair. Journal of Vascular Surgery. 34 (1), 41-46 (2001).
  4. Lederle, F. A., et al. Rupture rate of large abdominal aortic aneurysms in patients refusing or unfit for elective repair. JAMA. 287 (22), 2968-2972 (2002).
  5. Kochanek, K. D., Xu, J., Murphy, S. L., Minino, A. M., Kung, H. C. Deaths: Final data for 2009. National Vital Statistics Reports. 60 (3), 1(2011).
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  16. Allaire, E., Guettier, C., Bruneval, P., Plissonnier, D., Michel, J. B. Cell-free arterial grafts: Morphologic characteristics of aortic isografts, allografts, and xenografts in rats. Journal of Vascular Surgery. 19 (3), 446-456 (1994).
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  24. Marinov, G. R., et al. Can the infusion of elastase in the abdominal aorta of the Yucatan miniature swine consistently produce experimental aneurysms. Journal of Investigative Surgery. 10 (3), 129-150 (1997).
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