تحليل حجم أراضي الخلايا النجمية والتبليط في أقسام الأنسجة السميكة العائمة بحرية

Summary

يصف هذا البروتوكول طرق تقسيم وتلطيخ وتصوير أقسام الأنسجة العائمة الحرة في دماغ الفأر ، متبوعا بوصف مفصل لتحليل حجم منطقة الخلايا النجمية وتداخل أراضي الخلايا النجمية أو تبليطها.

Abstract

تمتلك الخلايا النجمية درجة مذهلة من التعقيد المورفولوجي الذي يمكنها من التفاعل مع كل نوع من الخلايا والبنية تقريبا داخل الدماغ. من خلال هذه التفاعلات ، تنظم الخلايا النجمية بنشاط العديد من وظائف الدماغ الحرجة ، بما في ذلك تكوين المشبك العصبي ، والنقل العصبي ، والتوازن الأيوني. في دماغ القوارض ، تنمو الخلايا النجمية في الحجم والتعقيد خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الولادة وتنشئ مناطق متميزة وغير متداخلة لتجانب الدماغ. يوفر هذا البروتوكول طريقة راسخة لتحليل حجم منطقة الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية باستخدام أقسام الأنسجة العائمة الحرة من دماغ الفأر. أولا ، يصف هذا البروتوكول خطوات جمع الأنسجة ، والتقسيم بالتبريد ، والتلطيخ المناعي لأقسام الأنسجة العائمة الحرة. ثانيا، يصف هذا البروتوكول اكتساب الصور وتحليل حجم أراضي الخلايا النجمية وحجم تداخل الأراضي، باستخدام برامج تحليل الصور المتاحة تجاريا. وأخيرا، تناقش هذه المخطوطة المزايا والاعتبارات الهامة والمزالق الشائعة والقيود المفروضة على هذه الأساليب. يتطلب هذا البروتوكول أنسجة المخ مع وضع علامات فلورية متفرقة أو فسيفسائية على الخلايا النجمية ، وهو مصمم للاستخدام مع معدات المختبر الشائعة ، والمجهر البؤري ، وبرامج تحليل الصور المتاحة تجاريا.

Introduction

الخلايا النجمية هي خلايا متفرعة بشكل متقن تؤدي العديد من الوظائف المهمة في الدماغ¹. في قشرة الفأر ، تؤدي الخلايا الجذعية الدبقية الشعاعية إلى ظهور الخلايا النجمية خلال المراحل الجنينية المتأخرة والمبكرة بعد الولادة². خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الولادة ، تنمو الخلايا النجمية في الحجم والتعقيد ، وتطور الآلاف من الفروع الدقيقة التي تتفاعل مباشرة مع نقاط الاشتباك العصبي¹. في الوقت نفسه ، تتفاعل الخلايا النجمية مع الخلايا النجمية المجاورة لإنشاء مناطق منفصلة وغير متداخلة لتجانب الدماغ³ ، مع الحفاظ على الاتصال عبر قنوات تقاطع الفجوة⁴. تتعطل مورفولوجيا الخلايا النجمية وتنظيمها في العديد من الحالات المرضية بعد الإهانة أو الإصابة⁵ ، مما يشير إلى أهمية هذه العمليات لوظائف الدماغ السليمة. يمكن أن يوفر تحليل الخصائص المورفولوجية للخلايا النجمية أثناء التطور الطبيعي والشيخوخة والمرض رؤى قيمة في بيولوجيا الخلايا النجمية وعلم وظائف الأعضاء. علاوة على ذلك ، يعد تحليل مورفولوجيا الخلايا النجمية بعد التلاعب الجيني أداة قيمة لتمييز الآليات الخلوية والجزيئية التي تحكم إنشاء وصيانة التعقيد المورفولوجي للخلايا النجمية.

تحليل مورفولوجيا الخلايا النجمية في دماغ الفأر معقد بسبب كل من تعقيد تفرع الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية. تلطيخ الأجسام المضادة باستخدام البروتين الحمضي الليفي الدبقي الخيطي الوسيط (GFAP) كعلامة خاصة بالخلايا النجمية يلتقط فقط الفروع الرئيسية ، ويقلل إلى حد كبير من التعقيد المورفولوجي للخلايا النجمية¹. تقوم علامات أخرى خاصة بالخلايا مثل ناقل الغلوتامات 1 (GLT-1 ؛ slc1a2) أو جلوتامين سينثيتاز أو S100β بعمل أفضل في وضع العلامات على فروع الخلايا النجمية⁶ ، ولكنها تقدم مشكلة جديدة. مناطق الخلايا النجمية غير متداخلة إلى حد كبير ، ولكن توجد درجة صغيرة من التداخل عند الحواف الطرفية. بسبب تعقيد التفرع ، عندما يتم تصنيف الخلايا النجمية المجاورة بنفس اللون ، من المستحيل التمييز بين المكان الذي تنتهي فيه إحدى الخلايا النجمية وتبدأ الأخرى. إن وضع العلامات المتناثرة أو الفسيفسائية للخلايا النجمية مع البروتينات الفلورية الذاتية المنشأ يحل كلتا المشكلتين: تملأ علامة الفلورسنت الخلية لالتقاط جميع الفروع وتسمح بتصوير الخلايا النجمية الفردية التي يمكن تمييزها عن جيرانها. تم استخدام العديد من الاستراتيجيات المختلفة لتحقيق وضع العلامات الفلورية المتناثرة للخلايا النجمية ، مع أو بدون التلاعب الجيني ، بما في ذلك الحقن الفيروسي ، أو كهربية البلازميد ، أو خطوط الفئران المعدلة وراثيا. يتم وصف تفاصيل تنفيذ هذه الاستراتيجيات في الدراسات والبروتوكولات المنشورة سابقا¹،⁷،⁸،⁹،^{10،11،12،13}.

توضح هذه المقالة طريقة لقياس حجم مساحة الخلايا النجمية من أدمغة الفئران باستخدام وسم الفلورسنت في مجموعة متفرقة من الخلايا النجمية (الشكل 1). نظرا لأن متوسط قطر الخلايا النجمية في قشرة الفأر يبلغ حوالي 60 ميكرومتر ، يتم استخدام أقسام بسماكة 100 ميكرومتر لتحسين الكفاءة في التقاط الخلايا النجمية الفردية بالكامل. التلطيخ المناعي غير مطلوب ولكن يوصى به لتعزيز إشارة الفلورسنت الذاتية المنشأ للتصوير والتحليل البؤري. قد يتيح التلطيخ المناعي أيضا كشفا أفضل لفروع الخلايا النجمية الدقيقة ويقلل من التبييض الضوئي للبروتينات الداخلية أثناء الحصول على الصورة. لتحسين تغلغل الأجسام المضادة في الأقسام السميكة ، وللحفاظ على حجم الأنسجة من التقسيم من خلال التصوير ، يتم استخدام أقسام الأنسجة العائمة بحرية. يتم إجراء تحليل حجم أراضي الخلايا النجمية باستخدام برنامج تحليل الصور المتاح تجاريا. بالإضافة إلى ذلك ، يصف هذا البروتوكول طريقة لتحليل بلاط الخلايا النجمية في أقسام الأنسجة مع وضع علامات الفسيفساء ، حيث تعبر الخلايا النجمية المجاورة عن تسميات فلورية مختلفة. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح في العديد من الدراسات الحديثة¹،^8،9 لتوصيف نمو الخلايا النجمية أثناء نمو الدماغ الطبيعي ^، وكذلك تأثير التلاعب الجيني على تطور الخلايا النجمية.

Protocol

تم استخدام جميع الفئران وفقا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل وقسم الطب المقارن (بروتوكول IACUC رقم 21-116.0). تم استخدام الفئران من كلا الجنسين في اليوم 21 بعد الولادة (P21) لهذه التجارب. تم الحصول على الفئران CD1 تجاريا (جدول المواد) ، وتم وصف الفئران MADM9 WT: WT و MADM9 WT: KO سابقا⁹.

ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول أدمغة ذات تعبير بروتين فلورسنت في مجموعة قليلة من الخلايا النجمية. يمكن إدخال تعبير البروتين الفلوري وراثيا أو فيروسيا أو عن طريق الكهروبورات. تم وصف تفاصيل طرق تسمية الخلايا النجمية بشكل ضئيل في الدراسات والبروتوكولات المنشورة سابقا¹،⁷،⁸،⁹،^10،11،^12،13.

1. جمع الأنسجة وإعدادها

تحذير: بارافورمالدهيد (PFA) مادة كيميائية خطرة. نفذ جميع الخطوات باستخدام PFA في غطاء الدخان الكيميائي.

1. تخدير الفئران بمخدر قابل للحقن (على سبيل المثال ، Avertin؛ 0.8 مجم / كجم) وضمان عمق التخدير مع قرصة إصبع القدم. استخدم مضخة تمعجية لإجراء التروية داخل القلب باستخدام محلول ملحي مخزن بالثلج (TBS) + الهيبارين بمعدل ~ 3 مل / دقيقة حتى يصبح الكبد صافيا (عادة 3-5 دقائق) ، يليه 4٪ PFA بارد في TBS بمعدل ~ 3 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: يتم تحسين معدل التدفق والأوقات للفئران بعد يوم 21 (P21) بعد الولادة. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات على معدل التدفق ووقت التروية للفئران من مختلف الأعمار.
2. بعد التروية ، استخدم زوجا من مقص التشغيل لفصل الرأس وإزالة الجلد لفضح الجمجمة. بعد ذلك ، استخدم زوجا من مقص التشريح الدقيق لإزالة الجزء العلوي من الجمجمة لفضح الدماغ. استخدم زوجا من الملقط أو ملعقة صغيرة لإزالة الدماغ ونقله إلى أنبوب يحتوي على 4٪ PFA بارد واحتضانه بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: تأكد من استخدام أنبوب ذو قاع مسطح ، مثل قارورة تلألؤ 7 مل ، بحيث لا يصبح الدماغ إسفينيا في قاع الأنبوب ، مما قد يضغط على الأنسجة ويغير حجم الخلايا النجمية.
3. في اليوم التالي ، صب PFA من الأنبوب. أضف 5 مل من 1x TBS إلى الأنبوب لشطف الدماغ وإزالة PFA المتبقية. اسكب السل وكرر هذه العملية مرتين أخريين لما مجموعه ثلاث غسلات.
4. أضف 4-5 مل من 30٪ من السكروز في TBS واحتضن الدماغ عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أيام ، أو حتى يغرق الدماغ في قاع الأنبوب.
   ملاحظة: تكون الأدمغة جاهزة للتجميد بمجرد غرقها ولكن يمكن تخزينها في محلول السكروز عند 4 درجات مئوية لعدة أسابيع.
5. تحضير وسط التجميد في أنبوب 50 مل عن طريق خلط 15 مل من مركب درجة حرارة القطع المثلى 100٪ (OCT) مع 30 مل من السكروز 30٪ في TBS. اخلطي على الجوز أو الخلاط المداري لمدة 1 ساعة على الأقل لضمان خلط المحلول بالكامل. حافظ على الأنبوب في وضع مستقيم لمدة ساعة إضافية للسماح لأي فقاعات بالارتفاع إلى السطح.
   ملاحظة: يمكن تحضير وسط التجميد مسبقا وتخزينه في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع.
6. استخدم ماصة مصلية لإضافة وسط تجميد إلى قالب تضمين مربع (جدول المواد). احرص على تجنب إدخال الفقاعات إلى الوسط. بالنسبة لدماغ الماوس P21 ، يكفي 3 مل. اضبط مستوى الصوت حسب الحاجة لمختلف الأعمار بحيث يكون الدماغ مغمورا تماما.
7. أضف الدماغ إلى الوسط واستخدم زوجا من الملقط رقم 5 لإزالة أي جذع دماغي قد يمنع الدماغ من الجلوس بشكل مسطح في القالب. اصطف الجزء الأمامي من الدماغ بحافة واحدة من القالب.
8. انقل القالب إلى سطح مستو مبرد بالثلج الجاف. علبة غداء معدنية مليئة بالثلج الجاف تعمل بشكل جيد لهذا الغرض. أحط القالب بكريات الثلج الجاف لضمان بطء وحتى التجميد.
9. بمجرد أن يصبح وسط التجميد أبيض وصلبا تماما ، قم بتخزين القالب عند -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن تخزين الأدمغة عند -80 درجة مئوية لعدة سنوات.

2. التكسير

ملاحظة: تهدف طريقة التقسيم هذه إلى العمل مع العديد من منظمات التبريد المختلفة المتاحة تجاريا. مع cryostat المستخدمة هنا (جدول المواد) ، فإن درجة حرارة قطع رأس العينة المثلى هي -23 درجة مئوية ، مع درجة حرارة الغرفة المحيطة بين -23 درجة مئوية و -25 درجة مئوية.

تنبيه: شفرة cryostat حادة للغاية. توخ الحذر أثناء التلاعب بالشفرة وتشغيل قاعدة التبريد.

1. تحضير وسط التقسيم عن طريق خلط 25 مل من 1x TBS و 25 مل من الجلسرين في أنبوب 50 مل. من الأسهل إضافة الجلسرين عن طريق سكبه مباشرة في الأنبوب واستخدام العلامات الموجودة على الأنبوب للقياس. رج / دوامة الأنبوب للخلط. يمكن تخزين هذا الحل في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع.
2. استعد لجمع أقسام الأنسجة عن طريق إضافة 2 مل من وسط التقسيم لكل بئر إلى لوحة من 12 بئرا. قم بتسمية الجزء العلوي والسفلي من اللوحة بمعلومات العينة. ضع اللوحة، جنبا إلى جنب مع غيرها من الإمدادات (شفرة cryostat ، شفرة الحلاقة ، تشاك ، وفرش الطلاء) ، مباشرة في cryostat ، واسمح لهم بالتأقلم مع درجة الحرارة لمدة 5 دقائق تقريبا.
3. حرك الأدمغة إلى غرفة التبريد واسمح لها بالتأقلم مع درجة الحرارة مع الإمدادات.
4. قم بإزالة كتلة الأنسجة المجمدة من القالب عن طريق قطع زاويتين من القالب باستخدام شفرة حلاقة وتقشير القالب بعيدا عن الأنسجة. قم بتوجيه الكتلة بحيث تكون مقدمة الدماغ متجهة لأعلى.
5. أضف OCT إلى الظرف بحيث يتم تغطية ~ 2/3 من الظرف ب OCT ووضع كتلة الأنسجة على الفور على الظرف ، مع الحفاظ على الاتجاه الموضح أعلاه. اضغط على الكتلة لأسفل في OCT بحيث تكون مسطحة على سطح الظرف.
6. بمجرد تجميد OCT بالكامل وتكون كتلة الأنسجة في مكانها بشكل آمن ، قم بتثبيت الظرف على رأس العينة. أدخل شفرة cryostat واجعل الشفرة قريبة من العينة.
7. قم بتقليم الدماغ على فترات 100 ميكرومتر حتى قبل الوصول إلى منطقة الدماغ ذات الاهتمام. لتقليل كمية OCT التي تذوب في وسائط التقسيم ، استخدم شفرة حلاقة لتقليم وسط التجميد الزائد من جوانب كتلة الأنسجة.
8. بمجرد الوصول إلى المنطقة ذات الأهمية ، ابدأ في جمع أقسام بسماكة 100 ميكرومتر. اجمع المقاطع إما باستخدام اللوحة المضادة للتدحرج أو عن طريق التقدم ببطء إلى cryostat بيد واحدة أثناء استخدام فرشاة الطلاء في اليد الأخرى لتوجيه القسم خارج الكتلة أثناء تلبسه بالشفرة. إذا كان نموذج cryostat يحتوي على دواسة ، فاستخدم الدواسة لدفع cryostat بحيث يمكن استخدام كلتا اليدين لتوجيه القسم خارج الكتلة.
9. انقل الأقسام إلى لوحة 12 بئرا باستخدام فرشاة طلاء أو ملقط. يمكن لكل بئر أن تستوعب ما لا يقل عن 10-12 قسما. عند إضافة القسم إلى الوسط ، يكفي عادة لمس الحافة السفلية للقسم إلى وسط التقسيم والسماح للقسم بالذوبان في الوسط دون الحصول على الفرشاة أو الملقط مبللا. إذا لمست الفرشاة الوسط ، فتأكد من تجفيفه بمنشفة ورقية أو منديل ورقي ، لأن الفرشاة المبللة بشكل مفرط ستجعل من الصعب نقل أقسام الأنسجة.
10. قم بتأمين اللوحة عن طريق لفها بورق القصدير أو فيلم البارافين. تأكد من تسميته بوضوح ، ثم قم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: بالنسبة لمعظم بروتوكولات التلطيخ ، يمكن تخزين الأقسام عند -20 درجة مئوية لمدة 1-2 سنوات على الأقل دون فقدان كبير للإشارة.

3. تلطيخ المناعة

ملاحظة: قم بإجراء جميع عمليات الغسيل والحضانة على شاكر منصة مدارية تم ضبطه على حوالي 100 دورة في الدقيقة. يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ، باستثناء حضانة الأجسام المضادة الأولية ، والتي يتم تنفيذها عند 4 درجات مئوية. قم بإعداد وسائط التركيب في وقت مبكر عن طريق الجمع بين المكونات في أنبوب سعة 50 مل والخلط على المغذيات طوال الليل. حماية من الضوء وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر. إذا كانت إشارة الفلورسنت الداخلية كافية للتصوير والتحليل دون الحاجة إلى تلطيخ مناعي ، فيمكن تخطي الخطوات 3.1-3.9. في حالة تخطي التلطيخ المناعي ، قم بإجراء ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في TBS وانتقل إلى الخطوة 3.10.

1. قم بإعداد محلول جديد من TBST (0.2٪ Triton in TBS) عن طريق إضافة 1 مل من 10٪ Triton-X إلى أنبوب 50 مل وملء الأنبوب إلى 50 مل ب 1x TBS. قم بإعداد 2 مل من المحاليل المانعة والأجسام المضادة (10٪ مصل الماعز في TBST) لكل دماغ.
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، اصنع TBST طازجا لكل تجربة تلطيخ جديدة واستخدم مصدرا عالي الجودة من Triton-X المائي بنسبة 10٪ (جدول المواد).
2. قم بتسمية لوحة من 24 بئرا وفقا للمخطط (الشكل 1). ضع عينات مختلفة في صفوف مختلفة، وحلولا مختلفة في أعمدة مختلفة. أضف 1 مل من TBST إلى الأعمدة الثلاثة الأولى ("Wash 1" و "Wash 2" و "Wash 3"). أضف 1 مل من حل الحظر إلى العمود الرابع.
3. قم بإعداد قطف زجاجي عن طريق إذابة نهاية ماصة 5.75 في باستور في خطاف صغير باستخدام موقد بنسن. استخدم هذا الاختيار لنقل مقاطع الأنسجة من اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى عمود Wash 1 من اللوحة ذات ال 24 بئرا.
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، قم بفحص الأقسام قبل البدء في تلطيخها. لفحص الأقسام، انقل الأقسام واحدة تلو الأخرى إلى طبق بتري مملوء ب 1x TBS وافحص الأقسام باستخدام مجهر الفلورسنت بهدف 5x أو 10x لضمان وجود عدد كاف من الخلايا المصنفة بالفلورسنت. يوصى بتلطيخ أربعة إلى ستة أقسام لكل بئر ، على الرغم من أن ما يصل إلى ثمانية أقسام لكل بئر قد تكون ملطخة إذا لزم الأمر.
4. اغسل الأقسام لمدة 10 دقائق لكل منها في بئر Wash 1 و 2 و 3 ، متبوعا باحتضان الأقسام لمدة 1 ساعة في محلول الحظر. استخدم اللقطة الزجاجية لنقل الأقسام من بئر إلى آخر. يمكن استخدام الاختيار لنقل أقسام متعددة من الدماغ في وقت واحد.
5. قم بإعداد 1 مل من محلول الأجسام المضادة الأساسي لكل عينة (على سبيل المثال ، Rabbit RFP 1: 2000 أو Chicken GFP 1: 2000). أضف الجسم المضاد إلى محلول الأجسام المضادة ، دوامة لفترة وجيزة ، ثم جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند ≥ 4000 × g عند 4 درجات مئوية. احتضن الأقسام في الأجسام المضادة الأولية لمدة ليلتين إلى ثلاث ليال عند 4 درجات مئوية أثناء الاهتزاز.
6. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، قم بشفط اليوم 1 TBST من آبار الغسيل ، وأضف 1 مل من TBST الجديد إلى كل غسل جيدا ، وانقل الأقسام إلى البئر الأول للغسيل. اغسل الأقسام 3x لمدة 10 دقائق لكل منها.
   ملاحظة: للشفط ، استخدم ماصة 9 في باستور متصلة بأنابيب إلى قارورة فراغ. يمكن استخدام خطوط التفريغ المنزلية أو مضخة التفريغ الكهربائية كمصدر فراغ.
7. أثناء غسل الأقسام ، قم بإعداد محاليل الأجسام المضادة الثانوية بتركيز 1:200 عن طريق إضافة أجسام مضادة إلى محلول الأجسام المضادة (على سبيل المثال ، الماعز المضاد للأرانب 594 ، أو الماعز المضاد للدجاج 488). دوامة لفترة وجيزة ، ثم تدور لمدة 5 دقائق عند ≥ 4000 × غرام عند 4 درجات مئوية.
8. احتضان الأقسام في الأجسام المضادة الثانوية لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. حماية الأقسام من الضوء خلال هذه الخطوة وجميع الخطوات التالية للتخفيف من تبييض الأجسام المضادة الثانوية.
9. بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية ، قم بشفط اليوم 2 TBST من آبار الغسيل ، وأضف 1 مل من TBST الجديد إلى كل غسل جيدا ، وانقل الأقسام إلى الغسيل الأول جيدا. اغسل الأقسام 3x في TBST لمدة 10 دقائق لكل منها.
10. أثناء الغسيل النهائي ، أخرج وسائط التركيب من 4 درجات مئوية واتركها تدفئ إلى درجة حرارة الغرفة. تحضير خليط 2: 1 من 1x TBS: dH₂O وإضافته إلى طبق بتري. قم بإعداد شريحة مجهرية بإضافة 800 ميكرولتر من 2: 1 TBS: dH₂O إلى السطح.
    ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام وسائط تركيب غير معالجة. يمكن أن يؤدي تصلب وسائط التركيب إلى تغيير حجم الأنسجة مما قد يربك تحليل حجم منطقة الخلايا النجمية. يتم توفير وصفة لوسائط تركيب محلية الصنع بسيطة وغير مكلفة في جدول المواد.
11. باستخدام فرشاة طلاء ناعمة، انقل الأقسام واحدة تلو الأخرى من Wash 3 جيدا إلى طبق Petri. تزيل هذه الخطوة التريتون وتساعد الأقسام على التسطيح. بعد ذلك ، انقل الأقسام من طبق بتري إلى السائل الموجود على الشريحة.
12. استخدم فرشاة طلاء للمساعدة في ترتيب الأقسام بحيث تكون مسطحة على الشريحة. قم بإزالة السائل الزائد بعناية من الشريحة باستخدام ماصة P1000 ، متبوعة بشفط الفراغ.
    ملاحظة: أضف طرف ماصة P200 إلى نهاية ماصة باستور للتحكم بشكل أدق في شفط الفراغ.
13. بمجرد إزالة كل السائل الزائد من الشريحة ، استخدم ماصة نقل لإضافة قطرة واحدة من وسائط التركيب على الفور إلى كل قسم ووضع غطاء برفق فوق الشريحة. اسمح لوسائط التركيب بالانتشار لبضع دقائق، ثم قم بإزالة أي وسائط تركيب زائدة تخرج من تحت الغطاء عن طريق الشفط الفراغي.
    ملاحظة: لا تسمح للأقسام في أي وقت بالجفاف قبل إضافة وسائط التركيب. إذا بدأت الأقسام في الجفاف قبل إضافة وسائط التركيب ، فقد يؤثر ذلك على حجم الأنسجة ويعيق جمع البيانات بدقة.
14. أغلق جميع الحواف الأربعة للغطاء بطلاء أظافر شفاف. اترك الشرائح تجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بتخزينها بشكل مسطح عند 4 درجات مئوية. انتظر 2 ساعة على الأقل قبل التصوير ، أو الصورة في اليوم التالي.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأقسام الملطخة بالأجسام المضادة ضد GFP و RFP لمدة تصل إلى 2 أسابيع قبل التصوير ، شريطة أن تكون مغلقة تماما بطلاء الأظافر.

4. التصوير البؤري

ملاحظة: يقدم هذا البروتوكول إرشادات عامة للحصول على الصور تنطبق على نطاق واسع على المجاهر البؤرية المختلفة، بدلا من تفاصيل محددة لواجهة بؤرية وبرمجية معينة.

1. استخدم هدفا 10x لتحديد موقع الخلايا الفردية للتصوير ، مع ملاحظة منطقة الدماغ المحددة أو المنطقة الفرعية (على سبيل المثال ، الطبقة 5 من القشرة البصرية) كما هو مناسب للتجربة. استخدم مقبض التركيز البؤري لمحاولة تحديد ما إذا كانت الخلايا النجمية بأكملها موجودة داخل القسم.
2. قم بالتبديل إلى هدف زيت تكبير أعلى (على سبيل المثال، 40x أو 60x أو 63x) واجعل الخلية في بؤرة التركيز. أثناء النظر من خلال العدسة ، استخدم مقبض التركيز البؤري للانتقال من أعلى الخلية إلى أسفلها.
   1. افحص الخلية بصريا للتأكد من احتواء الخلية بأكملها داخل القسم. إذا خرجت الخلية فجأة عن التركيز البؤري وتم قطعها عند حافة القسم، فاستبعد هذه الخلية وحدد موقع خلية أخرى.
3. باستخدام برنامج الاقتناء المرتبط بالمجهر البؤري ، اضبط معلمات الاقتناء للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء مناسبة ومستوى من التفاصيل (ستوفر دقة 512 × 512 تفاصيل كافية لتحليل المنطقة وستقلل من وقت الحصول على الصورة). استخدم التكبير/التصغير بمعدل 2x في حالة استخدام هدف 40x، ولا يمكنك استخدام هدف 60x أو 63x.
4. اضبط الحدود العلوية والسفلية للمكدس z. لضمان التقاط الخلايا النجمية بأكملها ، يجب ألا تحتوي الصور الأولى والأخيرة للمكدس z على أي وسم فلورسنت للخلية. للحصول على عينات كافية ، استخدم حجم خطوة 0.5 ميكرومتر.

5. تحليل الصور

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول خطوات إجراء تحليل الصور باستخدام برنامج تحليل الصور المتاح تجاريا (أي Imaris؛ انظر جدول المواد). يمكن استخدام إصدارات أخرى من هذا البرنامج مع تعديلات طفيفة على سير العمل. يتطلب هذا البروتوكول أيضا MATLAB لتشغيل ملف Hull XTension المحدب (ملف تكميلي).

1. قبل البدء في التحليل، قم بتثبيت الملف المحدب هال XTension XTSpotsConvexHull.m عن طريق لصق الملف في المجلد الفرعي rtmatlab من المجلد XT.
2. استخدم محول ملفات Imaris لتحويل الصور إلى تنسيق ".ims". افتح ملف صورة في برنامج تحليل الصور واعرض الصورة في وضع العرض ثلاثي الأبعاد عن طريق تحديد زر عرض 3D .
3. قبل التحليل، افحص الخلية للتأكد من أنها تفي بمعايير التضمين.
   1. تأكد من وجود الخلية بأكملها داخل الصورة (أي أنه لا ينبغي قطع أي جزء من الخلية من الصورة). قم بتدوير الصورة لفحص الحواف الأمامية والخلفية.
   2. تأكد من أن الخلية تحتوي على جسم خلية واحد فقط. انقر فوق الزر شريحة ، واسحب المؤشر على يسار الشاشة للتنقل عبر مكدس z ، وتحقق من أن الخلية المصنفة تحتوي على جسم خلية واحد فقط.
   3. تأكد من وجود خلية نجمية فردية يمكن تمييزها عن أي خلايا نجمية مجاورة تحمل نفس اللون.
4. إنشاء سطح
   1. مع تحديد زر 3D View مرة أخرى ، قم بإنشاء سطح جديد بالنقر فوق رمز إضافة أسطح جديدة باللون الأزرق .
      1. في علامة التبويب إنشاء التي تظهر في أسفل يمين نافذة البرنامج، تأكد من تحديد المربعات فقط تقسيم منطقة اهتمام وإحصائيات كائن كائن فقط لإعدادات الخوارزمية، ومن عدم تحديد مربع بدء الإنشاء باستخدام طريقة عرض مقسم طريقة العرض لتفضيلات الإنشاء . انقر على السهم الأزرق للمتابعة.
         ملاحظة: قد لا تكون هناك حاجة إلى منطقة ذات أهمية إذا لم تكن هناك إشارة فلورسنت إضافية في الصورة خارج خلية الاهتمام. في هذه الحالة، اترك الشريحة منطقة اهتمام فقط دون تحديد وانتقل إلى الخطوة 5.4.3.
   2. قم بإنشاء منطقة ذات أهمية حول الخلية عن طريق إدخال الأبعاد في المربعات ضمن حجم أداة إنشاء Surface ، أو سحب حواف المربع الأصفر (الشكل 2A). انقر على السهم الأزرق للمتابعة.
   3. حدد قناة المصدر الصحيحة من القائمة المنسدلة للتحليل (على سبيل المثال، القناة 1، أو القناة التي تحتوي على تعبئة خلية الفلورسنت). يتم تحديد القيمة في مربع تفاصيل الأسطح بواسطة البرنامج واستنادا إلى معلمات الحصول على الصور. تأكد من أن هذه القيمة تظل ثابتة لجميع العينات في التجربة. انقر على السهم الأزرق للمتابعة.
   4. اضبط العتبة (الكثافة المطلقة) عن طريق سحب الشريط الأصفر أو عن طريق إدخال القيم في المربع بحيث يملأ السطح الرمادي أكبر قدر ممكن من إشارة الخلية دون تجاوز حدود الخلية. ستكون كمية صغيرة من إشارة الفلورسنت مرئية عند حواف السطح (الشكل 2B). انقر على السهم الأزرق للمتابعة.
   5. تقوم اللوحة الأخيرة من أداة Surface Creation بتعيين الحد الأدنى لقيمة الجودة، وهي قيمة العتبة الدنيا الافتراضية للبرنامج. في القائمة المنسدلة، تأكد من تحديد عدد Voxels Img=1. تحقق من أن زر الطاقة الأيسر فقط للعتبة الدنيا أخضر (نشط)؛ يجب أن يكون زر الطاقة الأيمن أحمر (غير نشط). يقوم البرنامج افتراضيا بقيمة العتبة الدنيا إلى 10. اترك هذا دون تغيير وانقر على السهم الأخضر لإنهاء توليد السطح.
   6. افحص السطح الذي تم إنشاؤه حديثا بعناية. احذف أي قطع سطحية ليست جزءا من الخلية عن طريق تحديدها ، والنقر فوق أداة تحرير القلم الرصاص ، والنقر فوق الخيار حذف .
   7. قم بتوحيد القطع السطحية المتبقية من خلال النقر على أيقونة مرشح القمع لتحديد الكل ، والنقر فوق رمز تحرير القلم الرصاص ، والنقر فوق خيار توحيد (الشكل 2C).
      ملاحظة: مع ملف صورة كبير، قد يتعطل البرنامج أحيانا أثناء الخطوات اللاحقة لهذا البروتوكول. من الجيد حفظ الملف في هذه المرحلة.
5. توليد بقع قريبة من السطح
   1. انقر على أيقونة إضافة بقع جديدة باللون البرتقالي . مع تحديد البقع الجديدة (على سبيل المثال، "النقاط 1") في علامة التبويب إنشاء ، تأكد من تحديد المربع إحصائيات الكائن الكائن فقط لإعدادات الخوارزمية، وإلغاء تحديد مربع بدء الإنشاء باستخدام طريقة عرض مقسم طريقة العرض لتفضيلات الإنشاء . انقر على السهم الأزرق للمتابعة.
   2. حدد قناة المصدر الصحيحة من القائمة المنسدلة (على سبيل المثال، القناة 1)، ثم أدخل قيمة قطر XY المقدر 0.400 ميكرومتر في المربع. تأكد من تحديد مربع طرح الخلفية فقط. انقر على السهم الأزرق للمتابعة.
      ملاحظة: 0.400 ميكرومتر مناسب لصور 1024 × 1024 أو 512 × 512 باستخدام هدف 63x أو 60x أو 40x. بالنسبة لظروف التصوير الأخرى ، يجب تحديد القطر بناء على ظروف التصوير ويظل ثابتا طوال جميع التحليلات. ستخلق القيمة المناسبة نقاطا كافية لتغطية جميع الإشارات الإيجابية ولكنها لن تضيف نقاطا على إشارة الخلفية.
   3. تقوم اللوحة الأخيرة من أداة Spot Creation بتعيين الحد الأدنى لقيمة الجودة ، وهي قيمة العتبة الدنيا الافتراضية للبرنامج ؛ تأكد من أن هذه القيمة لا تتغير ما لم يكن هناك اختلاف ملحوظ في موضع / توزيع البقع (على سبيل المثال ، بسبب تلطيخ رديء الجودة). انقر على السهم الأخضر لإنهاء إنشاء البقع.
   4. لعرض البقع بشكل أفضل، قم بتغيير شفافية السطح عن طريق تحديد Surface والنقر فوق أداة الألوان متعددة الألوان. ضمن المادة، حدد المادة التي تجعل السطح شفافا بما يكفي لعرض البقع في جميع أنحاء الخلية (المادة الرابعة إلى الأخيرة في القائمة) (الشكل 2D,E).
   5. أعد تحديد البقع، وانقر على أيقونة التصفية وحدد أقصر مسافة إلى الأسطح = الأسطح X، حيث "الأسطح X" هي السطح الذي يتم تحليله (على سبيل المثال، الأسطح 1)، من القائمة المنسدلة. تأكد من أن زري طاقة العتبة السفلى والعتبة العليا أخضر (نشط).
      1. أدخل مسافة لا تقل عن -1.0 ميكرومتر (مسافة البقع من داخل السطح) في مربع العتبة السفلى، ومسافة قصوى قدرها 0.1 ميكرومتر (المسافة من الخارج) في مربع العتبة العليا. انقر فوق الزر تكرار التحديد إلى بقع جديدة لإنهاء إنشاء بقع قريبة من السطح.
         ملاحظة: قد تختلف قيم المسافة الدنيا والقصوى باختلاف معلمات الحصول على الصورة، مثل الهدف والتكبير/التصغير والدقة. يجب تحديد هذه الأرقام تجريبيا. يساعد السطح الشفاف في الحكم على ما إذا كانت القيم تلتقط جميع البقع التي تمثل شكل السطح بدقة.
6. توليد بدن محدب وجمع قياس المنطقة
   1. تأكد من تحديد البقع التي تم إنشاؤها حديثا في اللوحة العلوية اليسرى من نافذة البرنامج (على سبيل المثال، "تحديد النقاط 1 ['أقصر مسافة...]"). انقر فوق رمز أدوات الترس ، ثم المكون الإضافي Convex Hull . انقر فوق المكون الإضافي مرة واحدة فقط وانتظر حتى تظهر نافذة MATLAB ثم تختفي (قد يستغرق ذلك عدة ثوان). سيظهر هيكل صلب في عرض 3D.
   2. في اللوحة العلوية اليمنى، حدد تحديد الهيكل المحدب للبقع X ["أقصر مسافة...]، حيث "تحديد البقع X" هو البقع التي تم إنشاؤها حديثا (على سبيل المثال، تحديد البقع 1)، ثم انقر فوق الهيكل لتحديده (الشكل 2F).
   3. انقر على أيقونة إحصائيات الرسم البياني، واختر علامة التبويب التحديد ، وتأكد من تحديد قيم محددة من القائمة المنسدلة العلوية، ثم اختر مستوى الصوت من القائمة المنسدلة السفلية. سجل حجم الهيكل. احفظ الملف وانتقل إلى الصورة التالية.
7. قياس حجم تداخل الأراضي للخلايا المجاورة ذات التسميات الفلورية المختلفة
   ملاحظة: يمكن استخدام هذا القسم من البروتوكول إذا كانت العينات تحتوي على خلايا نجمية مجاورة تعبر عن تسميات فلورسنت مميزة (على سبيل المثال، Astrocyte 1 يعبر عن GFP فقط و Astrocyte 2 يعبر عن RFP فقط). تم تحقيق هذا التصنيف باستخدام استراتيجيات فيروسية أو جينية كما هو موضح سابقا ^9,10 (الشكل 3A).
   1. باستخدام الخطوات المفصلة في الخطوات 5.4-5.6 ، قم بإنشاء السطح والبقع القريبة من السطح والهيكل المحدب لكل خلية نجمية (الشكل 3B).
   2. مع تحديد Huvex Hull of Spots 1 ... ، انقر فوق رمز تحرير القلم الرصاص وانقر فوق تحديد القناع. في نافذة قناة القناع ، تأكد من تحديد القناة 1 (أو القناة التي تمثل الخلايا النجمية 1 ) وتأكد من تحديد المربع المجاور للقناة المكررة قبل تطبيق خيار القناع . انقر فوق موافق لإنشاء قناة مقنعة CH1.
   3. مع بدن محدب من البقع 2 اختيار... محدد ، انقر فوق رمز تحرير القلم الرصاص وانقر فوق تحديد القناع. في نافذة قناة القناع، حدد القناة 2 (أو القناة التي تمثل الخلايا النجمية 2) من القائمة المنسدلة وتأكد من تحديد المربع المجاور للقناة المكررة قبل تطبيق خيار القناع. انقر فوق موافق لإنشاء قناة مقنعة CH2 (الشكل 3C).
   4. انقر فوق الزر Coloc في الجزء العلوي من الشاشة واستخدم أداة Coloc لإنشاء قناة تعريب مشتركة للقناتين المقنعتين. اضبط القناة A على القناة 3 - CH1 المقنعة والقناة B على القناة 4 - CH2 المقنعة (الشكل 3D).
   5. اسحب شريط الرسم البياني الأصفر إلى اليسار لكلتا القناتين. استخدم طريقة عرض الشريحة أدناه لمراقبة إشارة التوطين المشترك، والتي ستكون مرئية باللون الرمادي. لاحظ أنه نظرا لأن الإشارات الفلورية للخليتين ليست في الواقع مشتركة ، فستحتاج العتبة إلى نقلها إلى اليسار بحيث تبدأ التوطين المشترك الزائف في الظهور عند نقاط اتصال الخلايا الخلوية.
   6. انقر فوق بناء قناة Coloc على الجانب الأيمن لإكمال العملية. انقر فوق طريقة العرض ثلاثية الأبعاد للعودة إلى طريقة العرض ثلاثية الأبعاد القياسية. ستكون قناة نتائج التوطين المشترك مرئية الآن باللون الرمادي وتظهر في مربع ضبط العرض.
   7. قم بإنشاء السطح والبقع القريبة من السطح والهيكل المحدب لقناة نتيجة التوطين المشترك باستخدام الخطوات الموضحة في 5.4-5.7 (الشكل 3E ، F).
   8. سجل حجم الهيكل المحدب. هذا هو حجم تداخل الأراضي. اقسم هذا الرقم على حجم أراضي إحدى الخلايا النجمية لحساب النسبة المئوية لتداخل الأراضي. اختر عنصر التحكم أو الخلايا النجمية من النوع البري إذا تم التلاعب بإحدى الخلايا النجمية وراثيا فيما يتعلق بالأخرى.

النتائج

ويقدم الشكل 1 مخططا تخطيطيا للخطوات الرئيسية وسير العمل لهذا البروتوكول. يوضح الشكل 2 لقطات شاشة للخطوات الرئيسية باستخدام برنامج تحليل الصور لإنشاء سطح ، وتوليد بقع قريبة من السطح ، وإنشاء بدن محدب. يوضح الشكل 3 تطبيق هذه التقنية لتحديد تدا...

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقة راسخة لتحليل حجم أراضي الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية في قشرة الفأر ، مع تفصيل جميع الخطوات الرئيسية التي تبدأ بالتروية وتنتهي بتحليل الصور. يتطلب هذا البروتوكول أدمغة من الفئران التي تعبر عن البروتينات الفلورية في مجموعة متفرقة أو فسيفساء من الخلايا ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Roboz	RS-5045
1 mL TB Syringe	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS (tris-buffered saline)			30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin			28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate	Genesee Scientific	25-107MP
30% Sucrose in TBS			15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS			40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin			0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice	Charles River	022
Collection vial for brains	Fisher Scientific	03-337-20
Confocal acquisition software	Olympous	FV31S-SW
Confocal microscope	Olympus	FV3000RS
Coverslips	Fisher Scientific	12544E
Cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX50
Cryostat blade	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
Embedding mold	Polysciences	18646A-1
Freezing Medium			2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody	Aves Labs	GFP1010
Glycerol	Thermo Scientific	158920010
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A-11039
Goat anti-rabbit 594	Invitrogen	A11037
Goat Serum	Gibco	16210064
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	Version 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
Metal lunch tin	AQUARIUS	N/A	From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol	Sigma-Aldrich	152463
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5921
Mouting medium			20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish	VWR	100491-940
N-propyl gallate	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC	Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6"	Roboz	RS-6820
Orbital platform shaker	Fisher Scientific	88861043	Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush	Bogrinuo	N/A	From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes"
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pasteur pipet (5.75")	VWR	14672-608
Pasteur pipet (9")	VWR	14672-380
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541-500G
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RFP antibody	Rockland	600-401-379
Sectioning medium			1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides	VWR	48311-703
Sodium chrloide	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
TBST (TBS + Triton X-100)			0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet	VWR	414004-002
Tri-bromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100 (high-quality)	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS			xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin			add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST			0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium