厚自由漂浮组织切片中星形胶质细胞区域体积和瓷砖的分析

摘要

该协议描述了用于切片，染色和成像小鼠大脑的自由浮动组织切片的方法，随后详细描述了星形胶质细胞区域体积和星形胶质细胞区域重叠或平铺的分析。

摘要

星形胶质细胞具有惊人的形态复杂性，使它们能够与大脑中几乎每种类型的细胞和结构相互作用。通过这些相互作用，星形胶质细胞积极调节许多关键的大脑功能，包括突触形成、神经传递和离子稳态。在啮齿动物大脑中，星形胶质细胞在产后前三周的大小和复杂性增加，并建立不同的，不重叠的领土来平铺大脑。该协议提供了一种使用来自小鼠大脑的自由浮动组织切片分析星形胶质细胞区域体积和星形胶质细胞平铺的既定方法。首先，该方案描述了自由浮动组织切片的组织收集，冷冻切片和免疫染色的步骤。其次，该协议描述了星形胶质细胞区域体积和区域重叠体积的图像采集和分析，使用市售的图像分析软件。最后，本文讨论了这些方法的优点，重要考虑因素，常见陷阱和局限性。该协议要求脑组织具有星形胶质细胞的稀疏或马赛克荧光标记，并且设计用于与常见的实验室设备，共聚焦显微镜和市售的图像分析软件一起使用。

引言

星形胶质细胞是精心分支的细胞，在大脑中执行许多重要功能¹。在小鼠皮层中，桡骨神经胶质干细胞在胚胎晚期和产后早期^阶段2中产生星形胶质细胞。在产后的前三周，星形胶质细胞的大小和复杂性增加，形成数千个直接与突触相互作用的细枝¹。同时，星形胶质细胞与邻近的星形胶质细胞相互作用，以建立离散的、非重叠的区域来平铺大脑³，同时 通过 间隙连接通道⁴保持通信。在侮辱或损伤⁵之后的许多疾病状态中，星形胶质细胞的形态和组织被破坏，这表明这些过程对正常大脑功能的重要性。在正常发育、衰老和疾病期间分析星形胶质细胞的形态特性可以为星形胶质细胞生物学和生理学提供有价值的见解。此外，在遗传操作后分析星形胶质细胞形态是辨别控制星形胶质细胞形态复杂性的建立和维持的细胞和分子机制的宝贵工具。

由于星形胶质细胞分支的复杂性和星形胶质细胞平铺，对小鼠大脑中星形胶质细胞形态的分析很复杂。使用中间丝胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为星形胶质细胞特异性标记物的抗体染色仅捕获主要分支，并且大大低估了星形胶质细胞形态学复杂性¹。其他细胞特异性标记物如谷氨酸转运蛋白1（GLT-1; slc1a2），谷氨酰胺合成酶或S100β在标记星形胶质细胞分支⁶方面做得更好，但引入了一个新问题。星形胶质细胞区域在很大程度上是非重叠的，但在外周边缘存在小程度的重叠。由于分支的复杂性，当相邻的星形胶质细胞被标记为相同的颜色时，无法区分一个星形胶质细胞结束和另一个开始的位置。用内源性荧光蛋白对星形胶质细胞进行稀疏或马赛克标记解决了这两个问题:荧光标记物填充细胞以捕获所有分支，并允许对可以与邻居区分开来的单个星形胶质细胞进行成像。已经使用了几种不同的策略来实现星形胶质细胞的稀疏荧光标记，无论是否具有遗传操作，包括病毒注射，质粒电穿孔或转基因小鼠系。有关执行这些策略的详细信息在先前发表的研究和协议^1，7，^{8，9，10，11，12，13}中描述。

本文描述了一种在稀疏的星形胶质细胞群体中用荧光标记测量小鼠大脑星形胶质细胞区域体积的方法（图1）。由于小鼠皮层中星形胶质细胞的平均直径约为60μm，因此使用100μm厚的部分来提高捕获单个星形胶质细胞的效率。免疫染色不是必需的，但建议用于增强共聚焦成像和分析的内源性荧光信号。免疫染色还可以更好地检测精细的星形胶质细胞分支，并减少图像采集过程中内源性蛋白质的光漂白。为了改善抗体对厚切片的渗透，并保持组织体积不通过成像切片，使用自由浮动的组织切片。星形胶质细胞区域体积的分析使用市售图像分析软件进行。此外，该协议描述了一种分析具有马赛克标记的组织切片中星形胶质细胞平铺的方法，其中相邻的星形胶质细胞表达不同的荧光标记。该协议已在最近的几项研究^1，8，⁹中成功用于表征正常大脑发育过程中的星形胶质细胞生长，以及遗传操作对星形胶质细胞发育的影响。

研究方案

所有小鼠均按照北卡罗来纳大学教堂山分校的机构动物护理和使用委员会（IACUC）和比较医学部（IACUC协议编号21-116.0）使用。产后第21天（P21）的两性小鼠用于这些实验。以商业方式获得CD1小鼠（材料表），前面描述了MADM9的WT:WT和MADM9 WT:KO^小鼠。

注意:该协议要求在稀疏的星形胶质细胞群体中具有荧光蛋白表达的大脑。荧光蛋白表达可以通过遗传、病毒或电穿孔引入。稀疏标记星形胶质细胞的方法的细节在先前发表的研究和方案^1，7，^{8，9，10，11，12，13}中有所描述。

1. 组织收集和制备

注意:多聚甲醛 （PFA） 是一种危险化学品。在化学通风橱中使用PFA执行所有步骤。

1. 用注射麻醉剂（例如，阿维丁; 0.8mg / kg）麻醉小鼠，并用脚趾捏确保麻醉深度。使用蠕动泵以~3 mL /min的速率用冰冷的Tris缓冲盐水（TBS）+肝素进行心内灌注，直到肝脏清澈（通常为3-5分钟），然后以~3 mL / min的速度在TBS中冰冷的4%PFA进行5分钟。
   注意:流速和时间针对产后第21天（P21）小鼠进行了优化。对于不同年龄的小鼠，可能需要调整流速和灌注时间。
2. 灌注后，使用一把手术剪刀将头部拆下并取出皮肤以暴露颅骨。接下来，使用一把微解剖剪刀取出颅骨顶部以暴露大脑。使用一对镊子或一把小刮刀取出大脑并将其转移到含有冰冷的4%PFA的管中，并在4°C下孵育过夜。
   注意:一定要使用底部平坦的试管，例如7 mL闪烁小瓶，这样大脑就不会楔入管的底部，这可能会压缩组织并改变星形胶质细胞体积。
3. 第二天，从管中倒出PFA。向管中加入5毫升1x TBS以冲洗大脑并去除残留的PFA。倒出TBS并重复此过程两次，总共冲洗三次。
4. 在TBS中加入4-5 mL 30%蔗糖，并在4°C下孵育大脑1-2天，或直到大脑沉入管底。
   注意:大脑一旦沉没就准备好冷冻，但可以在4°C的蔗糖溶液中储存数周。
5. 通过将15 mL 100%最佳切割温度（OCT）化合物与TBS中的30 mL 30%蔗糖混合，在50 mL管中制备冷冻培养基。将管子再直立一个小时，以使任何气泡上升到表面。
   注意:冷冻培养基可以提前制备并在室温下储存数周。
6. 使用血清移液器将冷冻培养基添加到方形包埋模具中（材料表）。注意避免将气泡引入培养基中。对于P21小鼠大脑，3毫升就足够了。根据需要调整不同年龄的音量，使大脑完全淹没。
7. 将大脑添加到培养基中，并使用一对#5镊子去除任何可能阻止大脑平放在模具中的脑干。将大脑的前部与模具的一个边缘对齐。
8. 将模具转移到用干冰冷却的平坦表面上。装满干冰的金属午餐罐非常适合用于此目的。用干冰颗粒包围模具，以确保缓慢甚至冻结。
9. 一旦冷冻介质完全变白和固体，将模具储存在-80°C。
   注意:大脑可以在-80°C下储存数年。

2. 旋转

注意:此切片方法旨在与许多不同的市售低温恒温器一起使用。使用此处使用的低温恒温器（材料表），最佳试样头切割温度为-23°C，环境室温度在-23°C至-25°C之间。

注意:低温恒温器刀片非常锋利。操作刀片和操作低温恒温器时要小心。

1. 通过在50 mL管中混合25 mL 1x TBS和25 mL甘油来制备切片培养基。最简单的方法是将甘油直接倒入管中并使用管上的标记进行测量。摇晃/涡旋管以混合。该溶液可以在室温下储存数周。
2. 通过将每孔2 mL切片培养基加入12孔板来准备收集组织切片。用样品信息标记板的顶部和底部。将板与其他用品（低温恒温器刀片，剃须刀片，卡盘和画笔）一起直接放入低温恒温器中，并让它们适应温度约5分钟。
3. 将大脑移入低温恒温器室，让它们与供应一起适应温度。
4. 通过用剃须刀片切割模具的两个角并将模具从组织中剥离出来，从模具中取出冷冻的组织块。调整块的方向，使大脑的前部朝上。
5. 将OCT添加到卡盘中，使约2/3的卡盘被OCT覆盖，并立即将组织块放在卡盘上，保持上述方向。将块向下按入 OCT 中，使其平放在卡盘表面上。
6. 一旦OCT完全冷冻并且组织块牢固到位，将卡盘夹在标本头上。插入低温恒温器刀片，使刀片靠近试样。
7. 以100μm的间隔修剪大脑，直到到达感兴趣的大脑区域之前。为了减少溶解在切片培养基中的OCT量，请使用剃须刀片从组织块的侧面修剪多余的冷冻培养基。
8. 一旦达到感兴趣的区域，就开始收集100μm厚的部分。使用防滚板收集截面，或者用一只手缓慢推进低温恒温器，另一只手使用画笔将截面从块上引出，因为它与刀片相遇。如果低温恒温器型号有踏板，则使用踏板推进低温恒温器，以便双手可用于引导该部分离开块。
9. 使用画笔或镊子将切片转移到12孔板中。每个井至少可以容纳10-12个部分。将切片添加到介质中时，通常将切片的底部边缘接触切片介质并使其部分熔化到介质中而不弄湿刷子或镊子就足够了。如果刷子接触到培养基，请务必用纸巾或纸巾擦干，因为过湿的刷子会使组织切片难以转移。
10. 用铝箔或石蜡薄膜包裹板，固定板。确保清楚地标记它，然后将其储存在-20°C。
    注意:对于大多数染色方案，切片可以在-20°C下储存至少1-2年，而不会有实质性的信号损失。

3. 免疫染色

注:在设置为约 100 rpm 的轨道平台摇床上进行所有洗涤和孵育。所有步骤均在室温下进行，但一抗孵育除外，其在4°C下进行。 通过将配料在50 mL管中混合并在螺母上混合过夜，提前准备安装介质。避光，在4°C下储存长达2个月。如果内源性荧光信号足以用于成像和分析而不需要免疫染色，则可以跳过步骤3.1-3.9。如果跳过免疫染色，请在TBS中进行三次10分钟的洗涤，然后继续步骤3.10。

1. 通过将1 mL 10%Triton-X加入50 mL管中，并用1x TBS将管子填充至50 mL来制备TBST（TBS中0.2%海卫一）的新鲜溶液。
   注意:为获得最佳效果，请为每个新的染色实验制作新鲜的TBST，并使用高质量的10%Triton-X水源（材料表）。
2. 根据原理图标记24孔板（图1）。将不同的示例放在不同的行中，将不同的解决方案放在不同的列中。在前三列中加入 1 mL TBST（"洗涤 1"、"洗涤 2"和"洗涤 3"）。向第四列中加入1mL封闭溶液。
3. 使用本生燃烧器将巴斯德移液器的5.75末端熔化到一个小钩子中，以准备玻璃镐。使用此拾取将组织切片从12孔板转移到24孔板的Wash 1柱中。
   注:为获得最佳效果，请在开始染色前对切片进行筛选。为了筛选切片，将切片逐个转移到装有1x TBS的培养皿中，并使用具有5x或10x物镜的荧光显微镜检查切片，以确保存在足够数量的荧光标记细胞。建议每孔染色四到六段，但如有必要，每孔最多可以染色八段。
4. 在洗涤1，2和3孔中洗涤切片10分钟，然后在封闭溶液中孵育切片1小时。使用玻璃拾取将部分从一个孔转移到下一个孔。该镐头可用于一次转移多个大脑切片。
5. 为每个样品准备1 mL一抗溶液（例如，兔RFP 1:2000或鸡GFP 1:2000）。将抗体加入抗体溶液中，短暂涡旋，然后在4°C下以≥4，000× g 离心5分钟。 在一抗中将切片在4°C下孵育两到三个晚上，同时摇动。
6. 一抗孵育后，从洗涤孔中吸取第1天TBST，向每个洗涤孔中加入1 mL新TBST，然后将切片移入第一个洗涤孔中。将各部分清洗 3 次，每次 10 分钟。
   注意:对于抽吸，请使用与管道连接的9英寸巴斯德移液器连接到真空瓶。室内真空管路或电动真空泵可用作真空源。
7. 在洗涤切片时，通过向抗体溶液中添加抗体（例如，山羊抗兔594或山羊抗鸡488），制备浓度为1:200的二抗溶液。短暂涡旋，然后在4°C下以≥4，000× g 旋转5分钟。
8. 在室温下在二抗中孵育切片3小时。在此步骤和所有后续步骤中保护切片免受光照，以减轻二抗的漂白。
9. 二抗孵育后，从洗涤孔中吸取第2天TBST，向每个洗涤孔中加入1 mL新TBST，然后将切片移入第一个洗涤孔中。在TBST中洗涤3x切片，每次10分钟。
10. 在最后一次洗涤期间，将安装介质从4°C取出，并使其升温至室温。准备1x TBS:dH 2 O的₂:1混合物，并将其添加到培养皿中。通过在表面加入800μL的2:1 TBS:dH₂O来制备显微镜载玻片。
    注:强烈建议使用非固化安装介质。硬化的安装介质可以改变组织的体积，这可能混淆星形胶质细胞区域体积的分析。材料表中提供了简单而廉价的自制安装介质 的配方。
11. 使用细画笔，将切片一次一个地从洗涤3孔转移到培养皿中。此步骤将去除海卫一，并帮助各部分变平。接下来，将培养皿中的部分转移到载玻片上的液体中。
12. 使用画笔帮助排列各部分，使它们平放在幻灯片上。用P1000移液管小心地从载玻片中取出多余的液体，然后进行真空抽吸。
    注意:在巴斯德移液器的末端添加一个 P200 移液器吸头，以便更好地控制真空吸吸。
13. 从载玻片中取出所有多余的液体后，使用转移移液器立即向每个部分添加一滴安装介质，并在载玻片上轻轻地铺上盖玻片。让安装介质扩散几分钟，然后通过真空抽吸从盖玻片下取出的任何多余的安装介质。
    注:在添加安装介质之前，请勿让切片干燥。如果在添加镶样介质之前切片开始干燥，这可能会影响组织体积并阻碍准确的数据收集。
14. 用透明指甲油密封盖玻片的所有四个边缘。让载玻片在室温下干燥30分钟，然后将其平放在4°C。 等待至少2小时，然后再成像，或者第二天成像。
    注意:用抗GFP和RFP抗体染色的部分可以在成像前储存长达2周，前提是它们用指甲油完全密封。

4. 共聚焦成像

注意:该协议提供了广泛适用于不同共聚焦显微镜的一般图像采集指南，而不是特定共聚焦和软件界面的特定细节。

1. 使用10倍物镜定位单个细胞进行成像，注意与实验相关的特定大脑区域或子区域（例如，视觉皮层的第5层）。使用聚焦旋钮尝试确定整个星形胶质细胞是否包含在该部分中。
2. 切换到更高放大倍率的油物镜（例如，40x、60x或63x），使细胞聚焦。通过目镜观察时，使用对焦旋钮从细胞的顶部移动到底部。
   1. 目视检查单元格，以确保整个单元格都包含在该部分中。如果单元格突然失焦并在该部分的边缘被切断，请排除此单元格并找到另一个单元格。
3. 使用共聚焦显微镜的相关采集软件，调整采集参数以获得适当的信噪比和细节水平（512 x 512分辨率将为区域分析提供足够的细节，并将减少图像采集时间）。如果使用 40 倍物镜，则使用 2 倍变焦，如果使用 60 倍或 63 倍物镜，则不进行变焦。
4. 设置 z 堆栈的上限和下限。为了确保整个星形胶质细胞被捕获，z-stack的第一个和最后一个图像不应包含细胞的任何荧光标记。为了获得充分的采样，请使用0.5μm的步长。

5. 图像分析

注意:该协议描述了使用市售图像分析软件（即Imaris，参见 材料表）执行图像分析的步骤。该软件的其他版本可用于对工作流程进行细微修改。此协议还要求 MATLAB 运行凸壳 XTension 文件（补充文件）。

1. 在开始分析之前，通过将凸壳 XT 结构文件粘贴到 XT 文件夹的 rtmatlab 子文件夹中来安装该文件。
2. 使用伊玛里斯文件转换器将图像转换为".ims"格式。在图像分析软件中打开图像文件，然后通过选择 3D 视图按钮以 3D 查看模式查看图像 。
3. 在分析之前，检查单元格以确保其符合包含条件。
   1. 确保整个单元格都存在于图像中（即，不应从图像中剪切出单元格的任何部分）。旋转图像以检查前边缘和后边缘。
   2. 确保细胞只有一个细胞体。单击 切片按钮， 拖动屏幕左侧的光标以在 z 堆栈中移动，并验证标记的单元格是否只包含一个单元格正文。
   3. 确保有一个单独的星形胶质细胞可以与任何标记具有相同颜色的相邻星形胶质细胞区分开来。
4. 创建曲面
   1. 再次选中 "3D 视图 "按钮后，通过单击蓝色的" 添加新曲面"图标来创建新曲面 。
      1. 在软件窗口左下角显示的"创建"选项卡中，确保仅选中"算法设置"的"仅分割感兴趣区域"和"对象-对象统计信息"框，并且未选中"创建首选项"的"使用切片器视图开始创建"框。单击蓝色箭头继续。
         注意:如果目标细胞以外的图像中没有额外的荧光信号，则可能不需要感兴趣区域。在这种情况下，请保持仅 对感兴趣区域 进行未选中状态，然后继续执行步骤 5.4.3。
   2. 通过在"曲面创建"工具的"大小"下的框中输入尺寸，或拖动黄色框的边缘，在单元格周围创建感兴趣的区域（图 2A）。单击蓝色箭头继续。
   3. 从下拉列表中选择正确的 源通道 进行分析（例如，通道1或包含荧光细胞填充的通道）。" 曲面详细信息 "框中的值由软件根据图像采集参数确定。确保此值对于实验中的所有样品保持恒定。单击 蓝色箭头 继续。
   4. 通过拖动黄色条或在框中输入值来调整 阈值（绝对强度）， 以便灰色表面填充尽可能多的单元格信号，而不会超出单元格的边界。在表面边缘可以看到少量荧光信号（图2B）。单击 蓝色箭头 继续。
   5. "曲面创建"工具的最后一个面板设置最小质量值，即软件的默认阈值下限值。在下拉列表中，确保选中"体素数 Img=1"。检查是否只有"下限阈值"的左侧电源按钮为绿色（活动）;右侧电源按钮应为红色（非活动）。软件将"阈值下限"默认为 10。保持此值不变，然后单击绿色箭头以完成曲面的生成。
   6. 仔细检查新生成的表面。删除不属于单元格的任何曲面块，方法是选择它们，单击铅笔 编辑 工具，然后单击" 删除 "选项。
   7. 通过单击漏斗过滤器图标以全选，单击铅笔"编辑"图标，然后单击"统一"选项（图2C），统一剩余的表面部分。
      注意:对于较大的映像文件，软件可能会在此协议的后续步骤中偶尔崩溃。此时保存文件是个好主意。
5. 在靠近表面的地方生成斑点
   1. 单击橙色的"添加新广告点"图标。选中新 Spot（例如，"Spot 1"）后，在"创建"选项卡中，确保仅选中"算法设置"的"对象-对象统计信息"框，而未选中"创建首选项"的"使用切片器视图开始创建"框。单击蓝色箭头继续。
   2. 从下拉列表中选择正确的 源通道 （例如，通道 1），然后在框中输入 估计 XY 直径 值 0.400 μm。确保仅选中" 背景减法 "框。单击 蓝色箭头 继续。
      注:0.400 μm 适用于使用 63x、60x 或 40x 物镜的 1024 x 1024 或 512 x 512 图像。对于其他成像条件，必须根据成像条件确定直径，并在所有分析过程中保持恒定。适当的值将创建足够的斑点来覆盖所有正信号，但不会在背景信号上添加斑点。
   3. "创建点"工具的最后一个面板设置最小质量值，这是软件的默认阈值下限值;确保该值保持不变，除非斑点的位置/分布存在明显差异（例如，由于染色质量较差）。单击绿色箭头以完成点的创建。
   4. 若要更好地查看斑点，请通过选择"曲面"并单击"多色颜色"工具来更改曲面的透明度。在"材料"下，选择使表面足够透明的材料，以查看整个单元格中的斑点（列表中倒数第四种材料）（图 2D，E）。
   5. 重新选择 "点"，单击" 过滤器 "图标，然后从下拉列表中选择" 到曲面的最短距离"曲面=曲面 X，其中"曲面 X"是要分析的曲面（例如曲面 1）。确保 "阈值下限" 和 "阈值上限" 电源按钮均为绿色（活动）。
      1. 在下阈值框中输入-1.0μm的 最小距离 （斑点与表面内部的距离）， 在上限阈值 框中输入0.1μm（与外部的距离） 的最大距离 。 单击" 复制所选内容以新建点 "按钮以完成生成靠近曲面的点。
         注:最小和最大距离值可能因不同的图像采集参数（如物镜、变焦和分辨率）而异。这些数字必须根据经验来确定。透明表面有助于判断这些值是否捕获了准确表示表面形状的所有点。
6. 生成凸面船体并收集区域测量值
   1. 确保在软件窗口的左上角面板中选择了新创建的 点 （例如，"点 1 选择 ['最短距离...]"）。单击齿轮 工具 图标，然后单击 凸壳 插件。仅单击插件一次，然后等待MATLAB窗口出现然后消失（这可能需要几秒钟）。实体船体将出现在 3D 视图中。
   2. 在左上图面板中，选择 "点 X 选择凸船体"["最短距离..."），其中"点 X 选择"是新创建的点（例如，"点 1 选择"），然后单击 船体 进行选择（图 2F）。
   3. 单击图形 "统计信息" 图标，选择" 选择 "选项卡，确保从顶部下拉列表中选择" 特定值 "，然后从底部下拉列表中选择"音量"。记录船体的体积。 保存 文件并继续下一个图像。
7. 测量具有不同荧光标记的相邻细胞的区域重叠体积
   注意:如果样品含有表达不同荧光标记的相邻星形胶质细胞（例如，星形胶质细胞1仅表达GFP，星形胶质细胞2仅表达RFP），则可以使用该方案的这一部分。该标记是使用病毒或遗传策略实现的，如前所述^9，10 （图3A）。
   1. 使用步骤5.4-5.6中详述的步骤，为每个星形胶质细胞创建表面，靠近表面的斑点和凸壳（图3B）。
   2. 选择 "点 1 个选区的凸壳... "后，单击铅笔" 编辑" 图标，然后单击" 蒙版选择"。在" 掩码通道 "窗口中，确保已选中 通道 1 （或表示星形胶质细胞 1 的通道），并确保已选中 应用掩码选项之前重复通道 旁边的框。单击 "确定" 以创建 通道"蒙版 CH1"。
   3. 与 凸壳的斑点2选择... 选择后，单击铅笔 编辑 图标，然后单击 蒙版选择。在 "掩码通道 "窗口中，从下拉菜单中选择通道 2 （或表示星形胶质细胞 2 的通道），并确保已选中 应用掩码选项之前重复通道 旁边的框。单击 "确定" 以创建 通道"屏蔽CH2 "（图3C）。
   4. 单击屏幕顶部的 Coloc 按钮，然后使用 Coloc 工具创建两个屏蔽通道的协同本地化通道。将 通道A 设置为 通道3 - 屏蔽CH1 和 通道B 至 通道4 - 屏蔽CH2 （图3D）。
   5. 将两个通道的黄色 直方图条 向左拖动。使用下面的 切片视图 观察共定位信号，该信号将以灰色显示。请注意，由于两个细胞的荧光信号实际上不是共定位的，因此 需要将阈值 向左移动，以便错误的共定位开始出现在细胞 - 细胞接触点。
   6. 单击右侧的 "构建 Coloc 通道 "以完成该过程。单击 3D 视图 以返回到标准 3D 视图。 共置结果 通道现在将以灰色显示，并显示在显示调整框中。
   7. 使用5.4-5.7中描述的步骤创建曲面，靠近表面的点以及 共定位结果 通道的凸壳（图3E，F）。
   8. 记录凸起船体的体积。这是区域重叠体积。将此数字除以其中一个星形胶质胶质细胞的面积体积，以计算领土重叠的百分比。选择对照型或野生型星形胶质细胞，如果其中一个星形胶质细胞相对于另一个星形胶质细胞进行遗传操纵。

结果

图1给出了该协议的主要步骤和工作流程的示意图。 图2 显示了使用图像分析软件生成表面，生成靠近表面的斑点并生成凸起船体的关键步骤的屏幕截图。 图3 演示了该技术在确定星形胶质胶质细胞区域重叠/平铺中的应用。在 图4中，先前发表的手稿⁹ 的代表性结果证明了该协议的应用。在 ...

讨论

该协议描述了一种用于分析小鼠皮层中星形胶质细胞区域体积和星形胶质细胞平铺的既定方法，详细介绍了从灌注开始并以图像分析结束的所有主要步骤。该协议要求在稀疏或马赛克的星形胶质细胞群中表达荧光蛋白的小鼠的大脑。除此要求外，任何年龄的小鼠都可以用于该方案，只需对灌注设置和添加到包埋模具中的冷冻介质体积进行微小的调整。虽然已经发表了用于分析脑组织切片

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Roboz	RS-5045
1 mL TB Syringe	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS (tris-buffered saline)			30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin			28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate	Genesee Scientific	25-107MP
30% Sucrose in TBS			15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS			40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin			0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice	Charles River	022
Collection vial for brains	Fisher Scientific	03-337-20
Confocal acquisition software	Olympous	FV31S-SW
Confocal microscope	Olympus	FV3000RS
Coverslips	Fisher Scientific	12544E
Cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX50
Cryostat blade	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
Embedding mold	Polysciences	18646A-1
Freezing Medium			2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody	Aves Labs	GFP1010
Glycerol	Thermo Scientific	158920010
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A-11039
Goat anti-rabbit 594	Invitrogen	A11037
Goat Serum	Gibco	16210064
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	Version 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
Metal lunch tin	AQUARIUS	N/A	From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol	Sigma-Aldrich	152463
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5921
Mouting medium			20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish	VWR	100491-940
N-propyl gallate	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC	Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6"	Roboz	RS-6820
Orbital platform shaker	Fisher Scientific	88861043	Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush	Bogrinuo	N/A	From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes"
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pasteur pipet (5.75")	VWR	14672-608
Pasteur pipet (9")	VWR	14672-380
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541-500G
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RFP antibody	Rockland	600-401-379
Sectioning medium			1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides	VWR	48311-703
Sodium chrloide	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
TBST (TBS + Triton X-100)			0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet	VWR	414004-002
Tri-bromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100 (high-quality)	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS			xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin			add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST			0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium