성상 세포 영토 부피 분석 및 두꺼운 자유 부유 조직 절편의 타일링

요약

이 프로토콜은 마우스 뇌의 자유 부유 조직 절편을 절편화, 염색 및 이미징하는 방법을 설명하고, 이어서 성상세포 영역 부피 및 성상세포 영역 중첩 또는 타일링의 분석에 대한 상세한 설명을 설명한다.

초록

성상세포는 뇌 내의 거의 모든 유형의 세포 및 구조와 상호 작용할 수있게 해주는 놀라운 수준의 형태 학적 복잡성을 가지고 있습니다. 이러한 상호 작용을 통해 성상 세포는 시냅스 형성, 신경 전달 및 이온 항상성을 포함한 많은 중요한 뇌 기능을 적극적으로 조절합니다. 설치류 뇌에서 성상 세포는 출생 후 처음 세 주 동안 크기와 복잡성이 증가하고 뇌를 타일링하기 위해 뚜렷하고 겹치지 않는 영역을 확립합니다. 이 프로토콜은 마우스 뇌에서 자유 부유 조직 절편을 사용하여 성상 세포 영역 부피 및 성상 세포 타일링을 분석하기위한 확립 된 방법을 제공합니다. 먼저, 이 프로토콜은 자유 부유 조직 절편의 조직 수집, 냉동 절제술 및 면역염색을 위한 단계를 기술한다. 둘째,이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 성상 세포 영토 부피 및 영토 중첩 부피의 이미지 획득 및 분석을 설명합니다. 마지막으로,이 원고는 이러한 방법의 장점, 중요한 고려 사항, 일반적인 함정 및 한계에 대해 논의합니다. 이 프로토콜은 성상세포의 희소 또는 모자이크 형광 표지를 가진 뇌 조직을 필요로 하며, 일반적인 실험실 장비, 공초점 현미경 및 상업적으로 이용가능한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 사용하도록 설계되었다.

서문

성상세포는 뇌에서 많은 중요한 기능을 수행하는 정교하게 분지된 세포이다¹. 마우스 피질에서, 방사상 신경교세포 줄기 세포는 후기 배아 및 초기 산후 단계² 동안 성상세포를 발생시킨다. 출생 후 처음 세 주 동안, 성상세포는 크기와 복잡성이 증가하여 시냅스와 직접 상호 작용하는 수천 개의 미세한 가지를 개발합니다¹. 동시에, 성상세포는 이웃하는 성상세포와 상호작용하여 갭 접합 채널(⁴)을 통한 통신을 유지하면서 뇌⁽³)를 타일링하기 위해 이산적이고 겹치지 않는 영역을 구축한다. 성상세포 형태학 및 조직은 모욕 또는 상해⁵ 후 많은 질병 상태에서 붕괴되며, 이는 적절한 뇌 기능을 위한 이러한 과정의 중요성을 나타낸다. 정상적인 발달, 노화 및 질병 동안 성상 세포 형태 학적 특성을 분석하면 성상 세포 생물학 및 생리학에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한, 유전자 조작에 따른 성상세포 형태학의 분석은 성상세포 형태학적 복잡성의 확립 및 유지를 지배하는 세포 및 분자 메커니즘을 식별하기 위한 귀중한 도구이다.

마우스 뇌에서 성상세포 형태학의 분석은 성상세포 분지화 복잡성과 성상세포 타일링 둘 다에 의해 복잡하다. 중간 필라멘트 신경교세포 세동 산성 단백질 (GFAP)을 성상세포 특이적 마커로서 사용한 항체 염색은 주요 분지만을 포획하고, 성상세포 형태학적 복잡성을 크게 과소평가한다¹. 글루타메이트 수송체 1 (GLT-1; slc1a2), 글루타민 신테타제 또는 S100β와 같은 다른 세포 특이적 마커는 성상세포 분지⁶을 표지하는 더 나은 일을 수행하지만, 새로운 문제를 야기한다. 성상 세포 영역은 크게 겹치지 않지만 주변 가장자리에는 약간의 겹침이 존재합니다. 분지화의 복잡성 때문에, 이웃 성상세포가 같은 색으로 라벨링될 때, 한 성상세포가 끝나고 다른 성상세포가 시작되는 곳을 구별하는 것은 불가능하다. 내인성 형광 단백질로 성상세포의 희소 또는 모자이크 표지는 두 가지 문제를 모두 해결합니다: 형광 마커는 세포를 채워 모든 가지를 포착하고 이웃과 구별될 수 있는 개별 성상세포의 이미징을 가능하게 합니다. 바이러스 주입, 플라스미드 전기천공, 또는 트랜스제닉 마우스 라인을 포함하는 유전자 조작의 유무에 관계없이 성상세포의 희소 형광 표지를 달성하기 위해 몇 가지 상이한 전략이 사용되어 왔다. 이러한 전략의 실행에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 연구 및 프로토콜 1,7,8,9,10,11,12,13에 설명되어 있다.

이 기사에서는 희소 한 성상 세포 집단에서 형광 표지로 마우스 뇌에서 성상 세포 영역 부피를 측정하는 방법을 설명합니다 (그림 1). 마우스 피질에서 성상세포의 평균 직경은 대략 60 μm이기 때문에, 100 μm 두께의 절편은 개별 성상세포 전체를 포획하는 효율을 향상시키기 위해 사용된다. 면역 염색은 필요하지 않지만 공초점 이미징 및 분석을 위해 내인성 형광 신호를 향상시키는 것이 좋습니다. 면역 염색은 또한 미세 성상 세포 가지의 더 나은 검출을 가능하게하고 이미지 획득 동안 내인성 단백질의 광표백을 감소시킬 수 있습니다. 두꺼운 절편으로의 항체 침투를 개선하고, 영상화를 통한 절편화로부터 조직 부피를 보존하기 위해, 자유-부유 조직 절편이 사용된다. 성상세포 영역 부피의 분석은 상업적으로 이용가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 추가적으로, 이 프로토콜은 모자이크 표지를 갖는 조직 절편에서 성상세포 타일링을 분석하는 방법을 기술하며, 여기서 이웃 성상세포는 상이한 형광 표지를 발현한다. 이 프로토콜은 최근 여러 연구에서 성공적으로 사용되어 왔으며 ^1,8,9 정상적인 뇌 발달 중 성상 세포 성장뿐만 아니라 유전자 조작이 성상 세포 발달에 미치는 영향을 특성화합니다.

프로토콜

모든 마우스는 채플 힐의 노스 캐롤라이나 대학 (University of North Carolina)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 및 비교 의학 부문 (IACUC 프로토콜 번호 21-116.0)에 따라 사용되었습니다. 출생 후 21일째에 남녀 모두의 마우스(P21)를 이들 실험에 사용하였다. CD1 마우스는 상업적으로 수득되었고(표 물질), MADM9 WT:WT 및 MADM9 WT:KO 마우스는 앞서⁹에 기술하였다.

참고 :이 프로토콜은 성상 세포의 희소 한 집단에서 형광 단백질 발현을 가진 뇌를 필요로합니다. 형광 단백질 발현은 유전적으로 또는 바이러스적으로, 또는 전기천공에 의해 도입될 수 있다. 성상세포를 희소하게 표지하는 방법의 세부사항은 이전에 발표된 연구 및 프로토콜 1,7,8,9,10,11,12,13에 기술되어 있다.

1. 조직 수집 및 준비

주의: 파라포름알데히드(PFA)는 유해 화학물질입니다. 화학 흄 후드에서 PFA로 모든 단계를 수행하십시오.

1. 마우스를 주사 가능한 마취제 (예 : Avertin; 0.8 mg / kg)로 마취시키고 발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 보장하십시오. 연동 펌프를 사용하여 간이 맑아질 때까지 (일반적으로 3-5 분) ~ 3 mL / min의 속도로 얼음처럼 차가운 트리스 완충 식염수 (TBS) + 헤파린으로 심장 내 관류를 수행 한 다음 5 분 동안 ~ 3 mL / min의 속도로 TBS에서 빙냉 4 % PFA를 수행하십시오.
   참고: 유속과 시간은 산후 21일째(P21) 마우스에 최적화되어 있습니다. 유속과 관류 시간에 대한 조정은 다른 나이의 마우스에 필요할 수 있습니다.
2. 관류 후 한 쌍의 작동 가위를 사용하여 머리를 분리하고 피부를 제거하여 두개골을 노출시킵니다. 다음으로, 한 쌍의 마이크로 해부 가위를 사용하여 두개골 상단을 제거하여 뇌를 노출시킵니다. 한 쌍의 포셉 또는 작은 주걱을 사용하여 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 4% PFA를 함유하는 튜브로 옮기고 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
   참고: 7mL 섬광 바이알과 같이 평평한 바닥을 가진 튜브를 사용하여 뇌가 튜브 바닥에 쐐기를 박지 않도록 하여 조직을 압축하고 성상세포 부피를 변화시킬 수 있습니다.
3. 다음날 튜브에서 PFA를 붓습니다. 튜브에 5mL의 1x TBS를 첨가하여 뇌를 헹구고 잔류 PFA를 제거합니다. TBS를 붓고 이 과정을 두 번 더 반복하여 총 세 번 헹구십시오.
4. TBS에 30% 자당 4-5 mL를 첨가하고, 뇌가 튜브의 바닥에 가라앉을 때까지 또는 4°C에서 1-2일 동안 뇌를 인큐베이션한다.
   참고 : 뇌는 침몰 한 후 동결 할 준비가되어 있지만 몇 주 동안 4 ° C의 자당 용액에 보관할 수 있습니다.
5. 100% 최적 절삭 온도(OCT) 화합물 15mL와 TBS의 30% 자당 30mL를 혼합하여 50mL 튜브에서 동결 배지를 준비합니다. 용액이 완전히 혼합되도록 영양기 또는 오비탈 진탕기에 1시간 이상 혼합하십시오. 튜브를 한 시간 더 똑바로 유지하여 거품이 표면으로 올라갈 수 있도록하십시오.
   참고 : 동결 매체는 미리 준비하고 몇 주 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.
6. 혈청 학적 피펫을 사용하여 정사각형 임베딩 몰드에 동결 매체를 추가하십시오 (재료 표). 배지에 거품이 생기지 않도록 주의하십시오. P21 마우스 뇌의 경우 3mL이면 충분합니다. 뇌가 완전히 잠기도록 다양한 연령대에 필요에 따라 볼륨을 조정하십시오.
7. 뇌를 매체에 추가하고 한 쌍의 #5 포셉을 사용하여 뇌가 곰팡이에 평평하게 앉아있는 것을 막을 수있는 뇌 줄기를 제거하십시오. 곰팡이의 한쪽 가장자리로 뇌의 앞쪽을 정렬하십시오.
8. 드라이 아이스로 냉각 된 평평한 표면으로 몰드를 옮깁니다. 드라이 아이스로 가득 찬 금속 점심 양철은이 목적을 위해 잘 작동합니다. 드라이 아이스 펠릿으로 금형을 둘러싸고 느리고 균일 한 동결을 보장합니다.
9. 동결 매체가 완전히 백색이고 고체가 되면, 몰드를 -80°C에서 보관한다.
   참고 : 뇌는 몇 년 동안 -80 ° C에서 저장할 수 있습니다.

2. 사이로절제술

참고: 이 단면화 방법은 상업적으로 이용 가능한 다양한 냉동 스탯과 함께 작동하도록 고안되었습니다. 여기에 사용 된 냉동 장치 (재료 표)를 사용하면 최적의 시편 헤드 절단 온도는 -23 °C이며 주변 챔버 온도는 -23 °C와 -25 °C 사이입니다.

주의: 냉동 노즐은 매우 날카롭습니다. 블레이드를 조작하고 냉동 스탯을 작동시키는 동안주의하십시오.

1. 50 mL 튜브에 25 mL의 1x TBS와 25 mL의 글리세롤을 혼합하여 절편 배지를 제조하였다. 글리세롤을 튜브에 직접 붓고 측정을 위해 튜브의 마커를 사용하여 글리세롤을 첨가하는 것이 가장 쉽습니다. 튜브를 흔들거나 와류하여 혼합하십시오. 이 용액은 실온에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.
2. 웰당 2 mL의 절편 배지를 12-웰 플레이트에 첨가하여 조직 절편을 수집하도록 준비한다. 플레이트의 상단과 하단에 샘플 정보를 표시하십시오. 다른 공급 장치 (cryostat 블레이드, 면도날, 척 및 페인트 브러시)와 함께 플레이트를 냉동 장치에 직접 넣고 ~ 5 분 동안 온도에 적응하도록하십시오.
3. 두뇌를 냉동 챔버로 옮기고 공급품과 함께 온도에 적응할 수있게하십시오.
4. 금형의 두 모서리를 면도날로 자르고 금형을 조직으로부터 떼어내어 몰드에서 동결 조직 블록을 제거하십시오. 뇌의 앞쪽이 위쪽을 향하도록 블록의 방향을 조정하십시오.
5. 척의 ~ 2/3이 OCT로 덮여 있도록 척에 OCT를 추가하고 즉시 척에 조직 블록을 배치하여 위에서 설명한 방향을 유지합니다. 블록을 OCT로 눌러 척 표면에 평평하게 만듭니다.
6. OCT가 완전히 동결되고 조직 블록이 제자리에 단단히 고정되면 척을 시편 헤드에 고정하십시오. 냉동 노즐을 삽입하고 블레이드를 시편에 가깝게 가져옵니다.
7. 관심있는 뇌 영역에 도달하기 직전까지 100 μm 간격으로 뇌를 다듬으십시오. 단면화 매질에 용해되는 OCT의 양을 줄이려면 면도날을 사용하여 조직 블록의 측면에서 과도한 동결 매체를 트리밍하십시오.
8. 관심 영역에 도달하면 100 μm 두께의 섹션을 수집하기 시작하십시오. 안티 롤 플레이트를 사용하거나 한 손으로 냉동 장치를 천천히 전진시키고 다른 손에는 페인트 브러시를 사용하여 블레이드와 만날 때 블록에서 섹션을 안내하여 섹션을 수집하십시오. cryostat 모델에 페달이있는 경우 페달을 사용하여 cryostat을 전진시켜 양손을 사용하여 블록에서 섹션을 안내 할 수 있습니다.
9. 페인트 브러시 또는 포셉을 사용하여 섹션을 12-웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰은 적어도 10-12 개의 섹션을 보유 할 수 있습니다. 매체에 섹션을 추가 할 때 일반적으로 단면의 하단 가장자리를 단면 매체에 터치하고 브러시 또는 포셉을 젖지 않고 섹션이 매체로 녹을 수 있도록하는 것으로 충분합니다. 브러시가 매체에 닿으면 지나치게 젖은 브러시로 인해 조직 섹션을 옮기기가 어려워 지므로 종이 타월이나 티슈로 말리십시오.
10. 플레이트를 호일 또는 파라핀 필름으로 감싸서 고정하십시오. 명확하게 라벨을 붙인 다음 -20 °C에 보관하십시오.
    참고: 대부분의 염색 프로토콜의 경우, 절편은 상당한 신호 손실 없이 최소 1-2년 동안 -20°C에서 저장할 수 있습니다.

3. 면역염색

참고: 약 100rpm으로 설정된 오비탈 플랫폼 쉐이커에서 모든 세척 및 인큐베이션을 수행하십시오. 모든 단계는 일차 항체 인큐베이션을 제외한 실온에서 수행되며, 이는 4°C에서 수행된다. 50 mL 튜브에서 성분을 결합하고 밤새 너트 에이터에서 혼합하여 장착 매체를 미리 준비하십시오. 빛으로부터 보호하고 4°C에서 최대 2개월 동안 보관하십시오. 내인성 형광 신호가 면역염색의 필요 없이 이미징 및 분석에 충분하다면, 단계 3.1-3.9는 생략될 수 있다. 면역염색을 건너뛰는 경우, TBS에서 3개의 10분 세척을 수행하고 단계 3.10으로 진행한다.

1. 50 mL 튜브에 10% Triton-X 1 mL를 첨가하고 튜브를 1x TBS로 50 mL에 채워 TBST (TBS 중 0.2% 트리톤)의 신선한 용액을 준비하십시오. 각 뇌에 대해 블로킹 및 항체 용액 2 mL (TBST의 10 % 염소 혈청)를 준비하십시오.
   참고: 최상의 결과를 얻으려면 각각의 새로운 염색 실험에 대해 신선한 TBST를 만들고 10% 수성 Triton-X의 고품질 공급원을 사용하십시오(재료 표).
2. 도식에 따라 24웰 플레이트에 라벨을 붙입니다(그림 1). 서로 다른 샘플을 다른 행에 배치하고 다른 솔루션을 다른 열에 배치합니다. TBST를 처음 세 개의 열('세척 1', '세척 2' 및 '세척 3')에 첨가합니다. 블로킹 용액 1 mL를 네 번째 컬럼에 첨가한다.
3. 파스퇴르 피펫의 5.75 끝을 Bunsen 버너를 사용하여 작은 후크에 녹여 유리 픽을 준비하십시오. 이 픽을 사용하여 조직 절편을 12웰 플레이트의 워시 1 컬럼으로 옮기십시오.
   참고: 최상의 결과를 얻으려면 염색을 시작하기 전에 절편을 선별하십시오. 섹션을 스크리닝하려면 절편을 1x TBS로 채워진 페트리 접시로 하나씩 옮기고 형광 현미경을 사용하여 5x 또는 10x 목적의 절편을 검사하여 적절한 수의 형광 표지 세포가 존재하는지 확인하십시오. 웰 당 네 개에서 여섯 개의 섹션을 염색하는 것이 좋지만 필요한 경우 웰 당 최대 여덟 개까지 염색 할 수 있습니다.
4. 절편을 세척 1, 2 및 3 웰에서 각각 10분 동안 세척하고, 이어서 절편을 블로킹 용액에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 유리 픽을 사용하여 섹션을 한 우물에서 다음 웰로 옮깁니다. 이 픽은 한 번에 여러 뇌 섹션을 전송하는 데 사용할 수 있습니다.
5. 각 샘플에 대해 1 mL의 1차 항체 용액을 준비한다 (예를 들어, 토끼 RFP 1:2000 또는 치킨 GFP 1:2000). 항체를 항체 용액에 첨가하고, 간단히 와류한 다음, 4°C에서 ≥ 4,000 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 절편을 진탕하면서 4°C에서 이틀 내지 삼박 동안 일차 항체로 인큐베이션한다.
6. 1차 항체 인큐베이션 후, 세척 웰로부터 제1일 TBST를 흡인하고, 각 세척 웰에 1 mL의 새로운 TBST를 첨가하고, 절편을 첫 번째 세척 웰로 이동시킨다. 섹션을 각각 10 분 동안 3x로 씻으십시오.
   참고: 흡인을 위해, 진공 플라스크에 튜빙과 연결된 파스퇴르 피펫의 9를 사용하십시오. 하우스 진공 라인 또는 전기 진공 펌프를 진공 소스로 사용할 수 있습니다.
7. 절편이 세척되는 동안, 항체 용액에 항체를 첨가하여 1:200의 농도로 이차 항체 용액을 준비한다 (예를 들어, 염소 항-토끼 594, 또는 염소 항닭 488). 볼텍스를 간략하게 한 다음, 4°C에서 ≥ 4,000 x g 에서 5분 동안 회전시킨다.
8. 이차 항체 중의 절편을 실온에서 3시간 동안 인큐베이션한다. 이 단계 동안 빛으로부터 절편을 보호하고 이차 항체의 표백을 완화하기 위해 다음 단계를 모두 수행하십시오.
9. 2차 항체 인큐베이션 후, 세척 웰로부터 제2일 TBST를 흡인하고, 각각의 세척 웰에 1 mL의 새로운 TBST를 첨가하고, 절편을 첫 번째 세척 웰로 이동시킨다. TBST에서 섹션을 각각 10 분 동안 3 번 씻으십시오.
10. 최종 세척 중에 장착 매체를 4°C에서 꺼내어 실온으로 따뜻하게 합니다. 1x TBS:dH 2O의₂:1 혼합물을 준비하고 이것을 페트리 접시에 첨가하십시오. 표면에 800 μL의 2:1 TBS:_dH2O를 첨가하여 현미경 슬라이드를 제조하였다.
    참고: 경화되지 않은 장착 매체를 사용하는 것이 좋습니다. 경화 장착 매체는 성상세포 영역 부피의 분석을 혼란스럽게 할 수 있는 조직의 부피를 변화시킬 수 있다. 간단하고 저렴한 수제 장착 매체를위한 조리법이 재료 표에 나와 있습니다.
11. 미세한 페인트 브러시를 사용하여 섹션을 Wash 3 우물에서 Petri 접시로 한 번에 하나씩 옮깁니다. 이 단계는 트리톤을 제거하고 섹션이 평평 해지는 데 도움이됩니다. 그런 다음 페트리 접시의 섹션을 슬라이드의 액체로 옮깁니다.
12. 페인트 브러시를 사용하여 섹션이 슬라이드에서 평평하도록 정렬하는 데 도움이 됩니다. P1000 피펫으로 슬라이드에서 과도한 액체를 조심스럽게 제거한 다음 진공 흡인하십시오.
    참고: 파스퇴르 피펫 끝에 P200 피펫 팁을 추가하여 진공 흡기를 보다 세밀하게 제어할 수 있습니다.
13. 슬라이드에서 여분의 액체가 모두 제거되면 전사 피펫을 사용하여 각 섹션에 장착 미디어 한 방울을 즉시 추가하고 슬라이드 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 장착 매체를 몇 분 동안 퍼뜨린 다음 진공 흡인으로 커버슬립 아래에서 나오는 과도한 장착 매체를 제거하십시오.
    주: 장착 매체를 추가하기 전에 섹션이 건조되지 않도록 하십시오. 장착 매체가 추가되기 전에 절편이 건조되기 시작하면 조직의 부피에 영향을 미치고 정확한 데이터 수집을 방해 할 수 있습니다.
14. 커버슬립의 네 모서리를 모두 투명한 매니큐어로 밀봉합니다. 슬라이드를 실온에서 30분 동안 건조시킨 다음, 4°C에서 평평하게 보관한다. 이미징하기 전에 최소 2시간 정도 기다리거나 다음날 이미지를 촬영합니다.
    참고: GFP 및 RFP에 대한 항체로 염색된 섹션은 매니큐어로 완전히 밀봉된 경우 이미징 전에 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.

4. 공초점 이미징

참고: 이 프로토콜은 특정 공초점 및 소프트웨어 인터페이스에 대한 특정 세부 정보보다는 다른 공초점 현미경에 널리 적용되는 일반적인 이미지 수집 지침을 제공합니다.

1. 10x 목적을 사용하여 영상화를 위한 개별 세포를 위치시키고, 실험과 관련된 바와 같이 특정 뇌 영역 또는 하위 영역(예를 들어, 시각 피질의 층(5))을 기록한다. 초점 노브를 사용하여 전체 성상 세포가 섹션 내에 포함되어 있는지 여부를 결정하십시오.
2. 더 높은 배율의 오일 목표(예를 들어, 40x, 60x 또는 63x)로 전환하고 셀에 초점을 맞춥니다. 아이피스를 들여다보면서 포커스 노브를 사용하여 셀의 위쪽에서 아래쪽으로 이동합니다.
   1. 세포를 육안으로 검사하여 전체 셀이 섹션 내에 포함되어 있는지 확인합니다. 셀이 갑자기 초점을 벗어나 단면의 가장자리에서 잘리면 이 셀을 제외하고 다른 셀을 찾습니다.
3. 공초점 현미경의 관련 수집 소프트웨어를 사용하여 수집 매개 변수를 조정하여 적절한 신호 대 잡음비 및 세부 수준을 얻습니다 (512 x 512 해상도는 영역 분석에 충분한 세부 정보를 제공하고 이미지 수집 시간을 줄입니다). 40x 목표를 사용하는 경우 2x 줌을 사용하고 60x 또는 63x 목표를 사용하는 경우 확대/축소를 사용하지 않습니다.
4. z-스택의 위쪽 및 아래쪽 경계를 설정합니다. 전체 성상세포가 포획되고 있는지 확인하기 위해, z-스택의 첫 번째와 마지막 이미지는 세포의 형광 표지를 포함해서는 안 된다. 적절한 샘플링을 위해서는 0.5μm의 스텝 크기를 사용하십시오.

5. 이미지 분석

참고: 이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 이미지 분석 소프트웨어(즉, Imaris; Table of Materials를 참조)를 사용하여 이미지 분석을 수행하는 단계를 설명합니다. 이 소프트웨어의 다른 버전은 워크플로를 약간 수정하여 사용할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜을 사용하려면 MATLAB에서 볼록한 헐 XTension 파일(보조 파일)을 실행해야 합니다.

1. 분석을 시작하기 전에 XT 폴더의 rtmatlab 하위 폴더에 파일을 붙여 넣어 볼록한 선체 XTension 파일 XTSpotsConvexHull.m 을 설치합니다.
2. Imaris 파일 변환기를 사용하여 이미지를 '.ims'형식으로 변환하십시오. 이미지 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 열고 3D 보기 버튼을 선택하여 3D 보기 모드에서 이미지를 봅니다.
3. 분석하기 전에 세포를 검사하여 포함 기준을 충족하는지 확인하십시오.
   1. 전체 셀이 이미지 내에 있는지 확인하십시오 (즉, 셀의 어떤 부분도 이미지에서 잘라내서는 안됩니다). 이미지를 회전하여 앞면과 뒷면 가장자리를 검사합니다.
   2. 세포에 하나의 세포체만 있는지 확인하십시오. 슬라이스(Slice ) 버튼을 클릭하고 화면 왼쪽의 커서를 드래그하여 z-스택 사이를 이동한 다음 레이블이 지정된 셀에 셀 본문이 하나만 포함되어 있는지 확인합니다.
   3. 동일한 색으로 표지 된 이웃 성상 세포와 구별 될 수있는 개별 성상 세포가 있는지 확인하십시오.
4. 서피스 만들기
   1. 3D 보기 단추를 다시 선택한 상태에서 파란색 새 서피스 추가 아이콘을 클릭하여 새 서피스를 만듭니다.
      1. 소프트웨어 창의 왼쪽 아래에 나타나는 만들기 탭에서 알고리즘 설정에 대해 관심 영역만 세그먼트 및 개체-개체 통계 상자만 선택되어 있고 [생성 기본 설정]에 대한 슬라이서를 사용하여 만들기 시작 보기의 선택 취소되어 있는지 확인합니다. 계속하려면 파란색 화살표를 클릭하십시오.
         참고: 관심 셀 외부의 이미지에 추가 형광 신호가 없는 경우 관심 영역이 필요하지 않을 수 있습니다. 이 경우 세그먼트만 관심 영역만 선택 취소하고 5.4.3단계로 진행합니다.
   2. 서피스 생성 도구의 크기 아래의 상자에 치수를 입력하거나 노란색 상자의 가장자리를 드래그하여 셀 주위에 관심 영역을 만듭니다(그림 2A). 계속하려면 파란색 화살표를 클릭하십시오.
   3. 분석을 위해 드롭다운 목록에서 올바른 소스 채널(예: 채널 1 또는 형광 셀 채우기를 포함하는 채널 )을 선택합니다. 서피스 세부 정보(Surfaces Details ) 상자의 값은 소프트웨어에 의해 결정되며 이미지 수집 매개변수에 따라 결정됩니다. 실험의 모든 샘플에 대해 이 값이 일정하게 유지되는지 확인합니다. 계속하려면 파란색 화살표 를 클릭하십시오.
   4. 노란색 막대를 드래그하거나 상자에 값을 입력하여 회색 표면이 셀 경계를 넘지 않고 가능한 한 많은 셀 신호를 채우도록 하여 임계값(절대 강도) 을 조정합니다. 소량의 형광 신호가 표면의 가장자리에서 볼 수 있습니다 (그림 2B). 계속하려면 파란색 화살표 를 클릭하십시오.
   5. 서피스 생성 도구의 마지막 패널은 소프트웨어의 기본 하한임계값인 최소 품질 값을 설정합니다. 드롭다운 목록에서 Voxels Img=1의 수가 선택되어 있는지 확인합니다. 임계값 낮추기의 왼쪽 전원 단추만 녹색(활성)인지 확인합니다. 오른쪽 전원 단추는 빨간색(비활성)이어야 합니다. 소프트웨어의 기본값은 하한값 10입니다. 이 값을 변경하지 않고 녹색 화살표를 클릭하여 서피스 생성을 마칩니다.
   6. 새로 생성 된 표면을주의 깊게 검사하십시오. 셀에 속하지 않은 서피스 조각을 선택하고 연필 편집 도구를 클릭한 다음 삭제 옵션을 클릭하여 서피스 조각을 삭제 합니다.
   7. 깔때기 필터 아이콘을 클릭하여 모두를 선택하고 연필 편집 아이콘을 클릭한 다음 통합 옵션을 클릭하여 나머지 서피스 조각을 통합합니다 (그림 2C).
      참고: 큰 이미지 파일의 경우 이 프로토콜의 후속 단계에서 소프트웨어가 때때로 충돌할 수 있습니다. 이 시점에서 파일을 저장하는 것이 좋습니다.
5. 표면에 가까운 점 생성
   1. 주황색 새 스팟 추가 아이콘을 클릭합니다. 새 스팟(예: "스팟 1")을 선택한 상태에서 생성 탭에서 알고리즘 설정에 대해 객체-객체 통계 상자만 선택되어 있고 생성 기본 설정에 대한 슬라이서를 사용하여 만들기 시작 보기 상자의 선택을 취소합니다. 계속하려면 파란색 화살표를 클릭하십시오.
   2. 드롭다운 목록에서 올바른 소스 채널(예: 채널 1)을 선택한 다음 상자에 0.400μm의 예상 XY 직경 값을 입력합니다. 배경 빼 기 상자만 선택되어 있는지 확인합니다. 계속하려면 파란색 화살표 를 클릭하십시오.
      참고: 0.400μm는 63x, 60x 또는 40x 목표를 사용하는 1024 x 1024 또는 512 x 512 이미지에 적합합니다. 다른 이미징 조건의 경우, 직경은 이미징 조건에 따라 결정되어야 하며 모든 분석 전반에 걸쳐 일정하게 유지되어야 합니다. 적절한 값은 모든 긍정 신호를 커버하기에 충분한 스폿을 생성하지만 배경 신호에 스폿을 추가하지는 않습니다.
   3. 스팟 생성 도구의 마지막 패널은 소프트웨어의 기본 하한값 임계값인 최소 품질 값을 설정합니다. 반점의 배치 / 분포에 눈에 띄는 차이가 없으면 (예 : 품질이 좋지 않은 염색으로 인해) 이 값이 변경되지 않도록하십시오. 녹색 화살표를 클릭하여 스폿 생성을 마칩니다.
   4. 점을 더 잘 보려면 서피스(Surface)를 선택하고 다색 색상 도구를 클릭하여 서피스의 투명도를 변경합니다. 재질(Material)에서 셀 전체의 스폿을 볼 수 있을 만큼 표면을 투명하게 만드는 재료(목록의 네 번째에서 마지막 재료)를 선택합니다(그림 2D,E).
   5. 스폿을 다시 선택하고 필터 아이콘을 클릭한 다음 드롭다운 목록에서 서피스까지의 최단 서피스 거리=서피스 X를 선택합니다. 여기서 '서피스 X'는 분석 중인 서피스(예: 서피스 1)입니다. 임계값 하한과 상한 임계값 전원 단 추가 모두 녹색(활성)인지 확인합니다.
      1. 하한 임계값 상자에 -1.0μm의 최소 거리(표면 내부로부터의 스팟 거리)를 입력하고 상위 임계값 상자에 0.1μm의 최대 거리(외부로부터의 거리)를 입력합니다. 새 스팟에 중복 선택 버튼을 클릭하여 서피스에 가까운 스폿 생성을 완료합니다.
         참고: 최소 및 최대 거리 값은 목표, 확대/축소 및 해상도와 같은 이미지 수집 매개 변수에 따라 달라질 수 있습니다. 이 숫자는 경험적으로 결정되어야합니다. 투명 서피스는 값이 서피스의 모양을 정확하게 나타내는 모든 점을 캡처하는지 여부를 판단하는 데 도움이 됩니다.
6. 볼록한 선체 생성 및 영토 측정 수집
   1. 새로 생성된 스팟이 소프트웨어 윈도우의 왼쪽 상단 패널에서 선택되었는지 확인하십시오(예: " 스팟 1 선택 ['최단 거리...]"). 기어 도구 아이콘을 클릭 한 다음 볼록한 헐 플러그인을 클릭하십시오. 플러그인을 한 번만 클릭하고 MATLAB 창이 나타날 때까지 기다렸다가 사라질 때까지 기다립니다(몇 초 정도 걸릴 수 있음). 단단한 선체가 3D 뷰에 나타납니다.
   2. 왼쪽 위 패널에서 스팟 X 선택 의 볼록한 선체 ['최단 거리 ...]를 선택합니다. 여기서 '스팟 X 선택'은 새로 생성된 스팟(예: 스팟 1 선택)입니다. 그런 다음 선체 를 클릭하여 선택합니다(그림 2F).
   3. 그래프 통계 아이콘을 클릭하고 선택 탭을 선택하고 위쪽 드롭다운 목록에서 특정 값이 선택되었는지 확인한 다음 아래쪽 드롭다운 목록에서 볼륨을 선택합니다. 선체의 볼륨을 기록하십시오. 파일을 저장하고 다음 이미지로 진행합니다.
7. 다른 형광 라벨을 가진 이웃 세포에 대한 측정 영역 겹침 부피
   참고: 프로토콜의 이 섹션은 샘플이 뚜렷한 형광 표지를 발현하는 이웃하는 성상세포를 포함하는 경우에 사용될 수 있다(예를 들어, 성상세포 1은 GFP만을 발현하고 성상세포 2는 RFP만을 발현한다). 이러한 표지는 앞서 기술된 바와 같은 바이러스 또는 유전자 전략을 사용하여 달성되었다 ^9,10 (도 3A).
   1. 단계 5.4-5.6에 설명된 단계를 사용하여 각 성상세포에 대한 표면, 표면에 가까운 반점 및 볼록한 선체를 만듭니다(그림 3B).
   2. 스팟 1 선택의 볼록한 선체가 선택된 상태에서 연필 편집 아이콘을 클릭하고 마스크 선택을 클릭합니다. 마스크 채널 창에서 채널 1(또는 성상세포 1을 나타내는 채널)이 선택되어 있는지 확인하고 마스크 옵션을 적용하기 전에 중복 채널 옆의 상자가 선택되어 있는지 확인합니다. 확인을 클릭하여 마스크된 채널 CH1을 생성합니다.
   3. 볼록한 선체 스팟 2 선택 과 함께 ... 선택한 다음 연필 편집 아이콘을 클릭하고 마스크 선택을 클릭하십시오. 마스크 채널 창의 드롭다운 메뉴에서 채널 2(또는 성상세포 2를 나타내는 채널)를 선택하고 마스크 옵션을 적용하기 전에 중복 채널 옆의 상자가 선택되어 있는지 확인합니다. 확인을 클릭하여 마스크된 CH2 채널을 생성합니다(그림 3C).
   4. 화면 상단의 Coloc 버튼을 클릭하고 Coloc 도구를 사용하여 마스크된 두 채널의 공동 지역화 채널을 만듭니다. 채널 A를 채널 3 - 마스크된 CH1로, 채널 B를 채널 4 - 마스크된 CH2로 설정합니다(그림 3D).
   5. 노란색 히스토그램 막대 를 두 채널의 왼쪽으로 끕니다. 아래 슬라이스 보기를 사용하여 회색으로 표시되는 공동 지역화 신호를 관찰합니다. 두 세포의 형광 신호가 실제로 공동-국소화되지 않기 때문에, 임계치는 세포-세포 접촉의 지점에서 거짓 공동-국재화가 나타나기 시작할 수 있도록 왼쪽으로 이동될 필요가 있을 것이다.
   6. 오른쪽의 Coloc 채널 빌드 를 클릭하여 프로세스를 완료하십시오. 3D 뷰를 클릭하여 표준 3D 뷰 로 돌아갑니다. 이제 공동 지역화 결과 채널이 회색으로 표시되고 디스플레이 조정 상자에 나타납니다.
   7. 5.4-5.7에 설명된 단계를 사용하여 공동 지역화 결과 채널의 서피스, 서피스에 가까운 스폿 및 볼록한 선체를 생성합니다(그림 3E,F).
   8. 볼록한 선체의 볼륨을 기록하십시오. 이것은 영토 겹침 볼륨입니다. 이 숫자를 성상세포 중 하나의 영토 부피로 나누어 영토 중첩의 백분율을 계산합니다. 대조군 또는 야생형 성상세포 중 하나가 다른 성상세포에 대하여 유전적으로 조작되는 경우 이를 선택하십시오.

결과

그림 1에서는 이 프로토콜의 주요 단계 및 워크플로에 대한 개략적인 개요를 보여 줍니다. 그림 2는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 표면을 생성하고, 표면에 가까운 반점을 생성하고, 볼록한 선체를 생성하는 주요 단계의 스크린샷을 보여줍니다. 그림 3은 성상세포 영역 중첩/타일링을 결정하기 위해 이 기술의 적용을 보여?...

토론

이 프로토콜은 마우스 피질에서 성상세포 영역 부피 및 성상세포 타일링을 분석하기 위한 확립된 방법을 설명하며, 관류로 시작하여 이미지 분석으로 끝나는 모든 주요 단계를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 성상세포의 희소 또는 모자이크 집단에서 형광 단백질을 발현하는 마우스의 뇌를 필요로 한다. 이 요구 사항 외에, 임의의 연령의 마우스가 이 프로토콜에 사용될 수 있으며, 관류 설정?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Roboz	RS-5045
1 mL TB Syringe	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS (tris-buffered saline)			30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin			28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate	Genesee Scientific	25-107MP
30% Sucrose in TBS			15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS			40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin			0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice	Charles River	022
Collection vial for brains	Fisher Scientific	03-337-20
Confocal acquisition software	Olympous	FV31S-SW
Confocal microscope	Olympus	FV3000RS
Coverslips	Fisher Scientific	12544E
Cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX50
Cryostat blade	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
Embedding mold	Polysciences	18646A-1
Freezing Medium			2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody	Aves Labs	GFP1010
Glycerol	Thermo Scientific	158920010
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A-11039
Goat anti-rabbit 594	Invitrogen	A11037
Goat Serum	Gibco	16210064
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	Version 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
Metal lunch tin	AQUARIUS	N/A	From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol	Sigma-Aldrich	152463
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5921
Mouting medium			20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish	VWR	100491-940
N-propyl gallate	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC	Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6"	Roboz	RS-6820
Orbital platform shaker	Fisher Scientific	88861043	Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush	Bogrinuo	N/A	From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes"
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pasteur pipet (5.75")	VWR	14672-608
Pasteur pipet (9")	VWR	14672-380
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541-500G
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RFP antibody	Rockland	600-401-379
Sectioning medium			1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides	VWR	48311-703
Sodium chrloide	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
TBST (TBS + Triton X-100)			0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet	VWR	414004-002
Tri-bromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100 (high-quality)	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS			xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin			add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST			0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium