ניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף בקטעי רקמה עבים שצפים בחופשיות

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטות לחתך, צביעה והדמיה של מקטעי רקמה צפים בחופשיות במוח העכבר, ולאחר מכן תיאור מפורט של ניתוח נפח טריטוריית האסטרוציטים וחפיפת שטח האסטרוציטים או הריצוף.

Abstract

לאסטרוציטים יש מידה מדהימה של מורכבות מורפולוגית המאפשרת להם לתקשר כמעט עם כל סוג של תא ומבנה במוח. באמצעות אינטראקציות אלה, אסטרוציטים מווסתים באופן פעיל תפקודי מוח קריטיים רבים, כולל היווצרות סינפסות, העברה עצבית והומאוסטזיס של יונים. במוח המכרסמים, אסטרוציטים גדלים בגודלם ובמורכבותם במהלך שלושת השבועות הראשונים שלאחר הלידה ויוצרים טריטוריות נפרדות ולא חופפות כדי לרחף את המוח. פרוטוקול זה מספק שיטה מבוססת לניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף אסטרוציטים באמצעות מקטעי רקמה צפים בחופשיות ממוח העכבר. ראשית, פרוטוקול זה מתאר את השלבים לאיסוף רקמות, קריו-אקטציה ושמירה חיסונית של מקטעי רקמה צפים בחופשיות. שנית, פרוטוקול זה מתאר רכישת תמונות וניתוח של נפח שטח אסטרוציטים ונפח חפיפת שטח, באמצעות תוכנת ניתוח תמונות הזמינה מסחרית. לבסוף, כתב יד זה דן ביתרונות, בשיקולים החשובים, במלכודות הנפוצות ובמגבלות של שיטות אלה. פרוטוקול זה דורש רקמת מוח עם תיוג פלואורסצנטי דליל או פסיפס של אסטרוציטים, והוא מיועד לשימוש עם ציוד מעבדה משותף, מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנת ניתוח תמונות הזמינה מסחרית.

Introduction

אסטרוציטים הם תאים מסועפים בצורה משוכללת המבצעים תפקודים חשובים רבים במוח¹. בקליפת המוח של העכבר, תאי גזע גליאליים רדיאליים מעוררים אסטרוציטים בשלב העוברי המאוחר ובשלבים המוקדמים שלאחר הלידה². במהלך שלושת השבועות הראשונים שלאחר הלידה, האסטרוציטים גדלים בגודלם ובמורכבותם, ומפתחים אלפי ענפים עדינים המתקשרים ישירות עם סינפסות¹. במקביל, אסטרוציטים מקיימים אינטראקציה עם אסטרוציטים שכנים כדי ליצור טריטוריות נפרדות ולא חופפות כדי לרחוץ את המוח³, תוך שמירה על תקשורת באמצעות ערוצי צומת פער⁴. המורפולוגיה והארגון של אסטרוציטים משתבשים במצבי מחלה רבים בעקבות עלבון או פציעה⁵, מה שמעיד על חשיבותם של תהליכים אלה לתפקוד תקין של המוח. ניתוח תכונות מורפולוגיות של אסטרוציטים במהלך התפתחות תקינה, הזדקנות ומחלות יכול לספק תובנות חשובות על ביולוגיה ופיזיולוגיה של אסטרוציטים. יתר על כן, ניתוח מורפולוגיה של אסטרוציטים בעקבות מניפולציה גנטית הוא כלי רב ערך להבחנה במנגנונים התאיים והמולקולריים השולטים בהקמה ובתחזוקה של מורכבות מורפולוגית של אסטרוציטים.

ניתוח המורפולוגיה של אסטרוציטים במוח העכבר מסובך הן על ידי מורכבות הסתעפות האסטרוציטים והן על ידי ריצוף האסטרוציטים. צביעת נוגדנים באמצעות החלבון החומצי של נגיף גליה (GFAP) כסמן ספציפי לאסטרוציטים לוכדת רק את הענפים העיקריים, וממעיטה במידה ניכרת במורכבות המורפולוגית^{של האסטרוציטים 1}. סמנים ספציפיים לתאים אחרים כגון גלוטמט טרנספורטר 1 (GLT-1; slc1a2), גלוטמין סינטאז או S100β עושים עבודה טובה יותר בתיוג ענפי אסטרוציטים⁶, אך מציגים בעיה חדשה. שטחי אסטרוציטים אינם חופפים ברובם, אך קיימת מידה קטנה של חפיפה בקצוות ההיקפיים. בגלל המורכבות של הסתעפות, כאשר אסטרוציטים שכנים מסומנים באותו צבע, אי אפשר להבחין היכן מסתיים אסטרוציט אחד והשני מתחיל. תיוג דליל או פסיפס של אסטרוציטים עם חלבונים פלואורסצנטיים אנדוגניים פותר את שתי הבעיות: הסמן הפלואורסצנטי ממלא את התא כדי ללכוד את כל הענפים ומאפשר הדמיה של אסטרוציטים בודדים שניתן להבחין ביניהם לבין שכניהם. מספר אסטרטגיות שונות שימשו להשגת תיוג פלואורסצנטי דליל של אסטרוציטים, עם או בלי מניפולציה גנטית, כולל הזרקה נגיפית, אלקטרופורציה של פלסמיד או קווי עכברים מהונדסים. פרטים על ביצוע אסטרטגיות אלה מתוארים במחקרים ופרוטוקולים שפורסמו בעבר 1,7,8,9,9,10,11,12,13.

מאמר זה מתאר שיטה למדידת נפח טריטוריית אסטרוציטים ממוחות של עכברים באמצעות תיוג פלואורסצנטי באוכלוסייה דלילה של אסטרוציטים (איור 1). מאחר שהקוטר הממוצע של אסטרוציט בקליפת המוח של העכבר הוא כ-60 מיקרומטר, חלקים בעובי של 100 מיקרומטר משמשים לשיפור היעילות בלכידת אסטרוציטים בודדים בשלמותם. חיסון אינו נדרש, אך מומלץ לשפר את האות הפלואורסצנטי האנדוגני להדמיה וניתוח קונפוקליים. חיסון עשוי גם לאפשר זיהוי טוב יותר של ענפי אסטרוציטים עדינים ולהפחית את ההלבנה הפוטו-אקונומית של חלבונים אנדוגניים במהלך רכישת התמונה. כדי לשפר את חדירת הנוגדנים למקטעים העבים, וכדי לשמור על נפח הרקמה מחתך דרך הדמיה, נעשה שימוש בקטעי רקמות צפים בחופשיות. ניתוח נפח שטח אסטרוציטים מבוצע באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה מסחרית. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח ריצוף אסטרוציטים בקטעי רקמות עם תיוג פסיפס, שבו אסטרוציטים שכנים מבטאים תוויות פלואורסצנטיות שונות. פרוטוקול זה שימש בהצלחה במספר מחקרים אחרונים ^1,8,9 כדי לאפיין את צמיחת ^{האסטרוציטים} במהלך התפתחות המוח התקינה, כמו גם את ההשפעה של מניפולציה גנטית על התפתחות אסטרוציטים.

Protocol

כל העכברים שימשו בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל והמחלקה לרפואה השוואתית (פרוטוקול IACUC מספר 21-116.0). עכברים משני המינים ביום 21 שלאחר הלידה (P21) שימשו לניסויים אלה. עכברי CD1 הושגו באופן מסחרי (טבלת חומרים), ועכברי MADM9 WT:WT:WT ו-MADM9 WT:KO תוארו קודם לכן⁹.

הערה: פרוטוקול זה דורש מוחות עם ביטוי חלבונים פלואורסצנטי באוכלוסייה דלילה של אסטרוציטים. ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים יכול להיות מוצג גנטית, ויראלית או על ידי אלקטרופורציה. פרטים על שיטות לתיוג דליל של אסטרוציטים מתוארים במחקרים ובפרוטוקולים שפורסמו בעבר ^{1,7,8,9,10,11,12,13}.

1. איסוף והכנת רקמות

אזהרה: Paraformaldehyde (PFA) הוא כימיקל מסוכן. בצע את כל השלבים עם PFA במכסה אדים כימי.

1. מרדימים עכברים עם חומר הרדמה בהזרקה (למשל, אברטין; 0.8 מ"ג/ק"ג) ומבטיחים עומק הרדמה עם צביטה בבוהן. השתמש במשאבה פריסטלטית כדי לבצע זלוף תוך-לבבי עם מי מלח מסוג Tris-buffered-buffered כקרח (TBS) + הפרין בקצב של ~ 3 מ"ל לדקה עד שהכבד צלול (בדרך כלל 3-5 דקות), ואחריו קר כקרח 4% PFA בשחפת בקצב של ~ 3 מ"ל לדקה למשך 5 דקות.
   הערה: קצב הזרימה והזמנים ממוטבים לעכברים לאחר הלידה 21 (P21). ייתכן שיהיה צורך בהתאמות לקצב הזרימה ולזמן הזלוף עבור עכברים בגילאים שונים.
2. לאחר הזלפה, השתמשו בזוג מספריים פעילים כדי לנתק את הראש ולהסיר את העור כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן, השתמש בזוג מספריים מיקרו-ניתוחיים כדי להסיר את החלק העליון של הגולגולת כדי לחשוף את המוח. השתמש בזוג מלקחיים או במרית קטנה כדי להסיר את המוח ולהעביר אותו לצינור המכיל קר כקרח 4% PFA ולדגום לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: הקפד להשתמש בצינור עם תחתית שטוחה, כגון בקבוקון 7 מ"ל scintillation, כך המוח לא הופך להיות טריז בתחתית הצינור, אשר יכול לדחוס את הרקמה ולשנות את נפח האסטרוציטים.
3. למחרת, שפכו את ה-PFA מהצינור. הוסיפו 5 מ"ל של 1x TBS לצינור כדי לשטוף את המוח ולהסיר שאריות PFA. יוצקים את ה-TBS וחוזרים על התהליך הזה פעמיים נוספות בסך הכל, ובסך הכל שלוש שטיפות.
4. מוסיפים 4-5 מ"ל של 30% סוכרוז בשחפת ומדגרים את המוח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים, או עד שהמוח שוקע לתחתית הצינור.
   הערה: המוחות מוכנים להקפאה לאחר ששקעו, אך ניתן לאחסן אותם בתמיסת סוכרוז בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
5. הכינו מדיום הקפאה בצינור של 50 מ"ל על ידי ערבוב של 15 מ"ל של 100% תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) עם 30 מ"ל של 30% סוכרוז ב- TBS. יש לערבב על מחטיף או שייקר מסלולי למשך שעה אחת לפחות כדי להבטיח שהתמיסה מעורבבת במלואה. שמור על הצינור זקוף למשך שעה נוספת כדי לאפשר לכל בועות לעלות אל פני השטח.
   הערה: ניתן להכין מראש את מדיום ההקפאה ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר למשך מספר שבועות.
6. השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להוסיף מדיום הקפאה לתבנית הטבעה מרובעת (טבלת חומרים). הקפידו להימנע מהכנסת בועות למדיום. עבור מוח עכבר P21, 3 מ"ל מספיק. התאימו את הנפח לפי הצורך לגילאים שונים, כך שהמוח יהיה שקוע לחלוטין.
7. הוסיפו את המוח למדיום והשתמשו בזוג מלקחיים מספר 5 כדי להסיר כל גזע מוח שעשוי למנוע מהמוח לשבת שטוח בתבנית. יישרו את החלק הקדמי של המוח עם קצה אחד של התבנית.
8. מעבירים את התבנית למשטח שטוח מקורר בקרח יבש. פח ארוחת צהריים ממתכת מלא בקרח יבש עובד היטב למטרה זו. הקיפו את התבנית בכדורי קרח יבשים כדי להבטיח קפיאה איטית ואף קפואה.
9. לאחר שהמדיום המקפיא לבן ומוצק לחלוטין, אחסן את התבנית בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
   הערה: ניתן לאחסן מוחות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך מספר שנים.

2. סירוזקציה

הערה: שיטת חתך זו נועדה לעבוד עם קריוסטטים רבים ושונים הזמינים מסחרית. עם הקריוסטט המשמש כאן (טבלת חומרים), טמפרטורת חיתוך ראש הדגימה האופטימלית היא -23 מעלות צלזיוס, עם טמפרטורת תא סביבה בין -23 מעלות צלזיוס ל -25 מעלות צלזיוס.

אזהרה: להב הקריוסטט חד ביותר. יש לנקוט משנה זהירות בעת מניפולציה של הלהב והפעלת הקריוסטאט.

1. הכן את מדיום החתך על ידי ערבוב של 25 מ"ל של 1x TBS ו-25 מ"ל של גליצרול בצינור של 50 מ"ל. הכי קל להוסיף את הגליצרול על ידי שפיכתו ישירות לתוך הצינור ושימוש בסמנים שעל הצינור למדידה. לנער/לסובב את הצינור כדי לערבב. פתרון זה ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר שבועות.
2. התכוננו לאיסוף חלקי רקמות על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום חתך לכל באר לצלחת של 12 בארות. סמן את החלק העליון והתחתון של הצלחת במידע לדוגמה. מניחים את הצלחת, יחד עם אספקה אחרת (להב קריוסטאט, סכין גילוח, צ'אקים ומכחולים), ישירות לתוך הקריוסטט, ומאפשרים להם להתאקלם לטמפרטורה למשך כ-5 דקות.
3. הזיזו את המוחות לתוך תא הקריוסטט ואפשרו להם להתאקלם לטמפרטורה יחד עם האספקה.
4. הסר את בלוק הרקמה הקפואה מהתבנית על ידי חיתוך שתי פינות של התבנית עם סכין גילוח וקילוף התבנית הרחק מהרקמה. כיוון את הבלוק כך שחזית המוח תפנה כלפי מעלה.
5. הוסף OCT לצ'אק כך ש~ 2/3 מהצ'אק מכוסה ב- OCT ומיד הניח את בלוק הרקמה על הצ'אק, תוך שמירה על הכיוון שתואר לעיל. לחץ על הבלוק כלפי מטה לתוך ה- OCT כך שהוא יהיה שטוח על פני השטח של הצ'אק.
6. לאחר שה-OCT קפוא לחלוטין וגוש הרקמה נמצא במקומו בבטחה, מהדקים את הצ'אק לראש הדגימה. הכנס את להב ה- cryostat והקרב את הלהב לדגימה.
7. חותכים דרך המוח במרווחים של 100 מיקרומטר עד רגע לפני שמגיעים לאזור העניין במוח. כדי להפחית את כמות ה-OCT שמתמוססת במדיית החתך, השתמשו בלהב גילוח כדי לקצץ את עודפי מדיום ההקפאה מהצדדים של בלוק הרקמה.
8. ברגע שמגיעים לאזור העניין, התחילו לאסוף קטעים בעובי 100 מיקרומטר. אספו חלקים באמצעות צלחת האנטי-גלגול או על ידי קידום איטי של הקריוסטט ביד אחת תוך שימוש במברשת ביד השנייה כדי להנחות את הקטע מהגוש כשהוא פוגש את הלהב. אם למודל הקריוסטט יש דוושה, השתמש בדוושה כדי לקדם את הקריוסטט כך שניתן יהיה להשתמש בשתי הידיים כדי להנחות את הקטע מחוץ לבלוק.
9. העבר את החלקים ללוחית בעלת 12 הבארות באמצעות מכחול או מלקחיים. כל באר יכולה להכיל לפחות 10-12 סעיפים. כאשר מוסיפים את הקטע למדיום, בדרך כלל מספיק לגעת בקצה התחתון של הקטע למדיום החתך ולאפשר לקטע להתמוסס לתוך המדיום מבלי להרטיב את המברשת או המלקחיים. אם המברשת נוגעת במדיום, הקפידו לייבש אותו עם מגבת נייר או טישו, שכן מברשת רטובה מדי תקשה על העברת חלקי הרקמות.
10. אבטח את הצלחת על ידי עטיפתה בנייר כסף או בסרט פרפין. הקפד לתייג אותו בבירור, ולאחר מכן לאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: עבור רוב פרוטוקולי ההכתמה, ניתן לאחסן מקטעים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שנים לפחות ללא אובדן משמעותי של האות.

3. חיסון

הערה: בצעו את כל השטיפות והדגירות בשייקר פלטפורמה מסלולית שנקבע לכ-100 סל"ד. כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר, למעט הדגירה הנוגדנית העיקרית, אשר מבוצעת ב 4 °C (66 °F). מכינים מראש את מדיית ההרכבה על ידי שילוב המרכיבים בצינור של 50 מ"ל וערבוב על מחטיף למשך הלילה. יש להגן מפני אור ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודשיים. אם האות הפלואורסצנטי האנדוגני מספיק להדמיה ולניתוח ללא צורך בשמירה חיסונית, ניתן לדלג על שלבים 3.1-3.9. אם אתם מדלגים על חיסון, בצעו שלוש שטיפות של 10 דקות בשחפת והמשיכו לשלב 3.10.

1. הכינו תמיסה טרייה של TBST (0.2% טריטון בשחפת) על ידי הוספת 1 מ"ל של 10% טריטון-X לצינור של 50 מ"ל ומילוי הצינור ל-50 מ"ל ב-1x TBS. הכינו 2 מ"ל של פתרונות חסימה ונוגדנים (10% סרום עזים ב-TBST) לכל מוח.
   הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הכינו TBST טרי עבור כל ניסוי צביעה חדש והשתמשו במקור באיכות גבוהה של 10% Triton-X מימי (טבלת חומרים).
2. תייג לוחית של 24 בארות לפי הסכימה (איור 1). מקם דוגמאות שונות בשורות שונות ופתרונות שונים בעמודות שונות. הוסף 1 מ"ל של TBST לשלושת העמודות הראשונות ('Wash 1', 'Wash 2' ו-'Wash 3'). הוסף 1 מ"ל של פתרון חסימה לעמודה הרביעית.
3. הכינו קטיף זכוכית על ידי המסת הקצה של צינור פסטר 5.75 לתוך וו קטן באמצעות מבער בונזן. השתמש בבחירה זו כדי להעביר מקטעי רקמות מהצלחת בת 12 הבארות לעמודת Wash 1 של צלחת 24 הקידוחים.
   הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, סנן את המקטעים לפני תחילת הכתמה. כדי לסנן את המקטעים, העבירו את החלקים בזה אחר זה לצלחת פטרי מלאה ב-1x TBS ובחנו את החלקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי שמטרתו פי 5 או פי 10 כדי להבטיח מספר הולם של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי. מומלץ להכתים ארבעה עד שישה חלקים לכל באר, אם כי עד שמונה לכל באר עשויים להיות מוכתמים במידת הצורך.
4. שטפו את המקטעים למשך 10 דקות כל אחד ב-Wash 1, 2 ו-3 בארות, ולאחר מכן דגירו את המקטעים במשך שעה אחת בתמיסת החסימה. השתמש בבחירת הזכוכית כדי להעביר את החלקים מבאר אחת לאחרת. ניתן להשתמש בבחירה כדי להעביר מספר מקטעי מוח בו-זמנית.
5. הכן 1 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית עבור כל דגימה (למשל, ארנב RFP 1:2000 או עוף GFP 1:2000). הוסף את הנוגדן לתמיסת הנוגדן, מערבולת לזמן קצר, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- ≥ 4,000 x g ב- 4 °C (75 °F). דגירה של החלקים בנוגדן ראשוני למשך שניים עד שלושה לילות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידות.
6. לאחר דגירה ראשונית של נוגדנים, שאפו את יום 1 TBST מבארות הכביסה, הוסיפו 1 מ"ל של TBST חדש לכל באר שטיפה, והעבירו את החלקים לבאר הכביסה הראשונה. לשטוף את החלקים 3x במשך 10 דקות כל אחד.
   הערה: לשאיפה, השתמש בצינור 9 בפסטר המחובר לצינורות לבקבוק ואקום. קווי ואקום ביתיים או משאבת ואקום חשמלית יכולים לשמש כמקור ואקום.
7. בזמן שהמקטעים נשטפים, הכינו תמיסות נוגדנים משניות בריכוז של 1:200 על ידי הוספת נוגדנים לתמיסת הנוגדנים (למשל, אנטי-ארנב עז 594, או אנטי-עוף עז 488). וורטקס לזמן קצר, ולאחר מכן סובב במשך 5 דקות בשעה ≥ 4,000 x g ב 4 °C (64 °F).
8. מקטעי דגירה בנוגדן משני למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. הגן על החלקים מפני אור במהלך שלב זה וכל השלבים הבאים כדי למתן את ההלבנה של הנוגדנים המשניים.
9. לאחר דגירה של נוגדנים משניים, שאפו את יום 2 TBST מבארות הכביסה, הוסיפו 1 מ"ל של TBST חדש לכל באר שטיפה, והעבירו את החלקים לבאר הכביסה הראשונה. שטפו את החלקים 3x ב- TBST למשך 10 דקות כל אחד.
10. במהלך הכביסה הסופית, הוציאו את מדיית ההרכבה מ-4 מעלות צלזיוס ואפשרו לה להתחמם לטמפרטורת החדר. מכינים תערובת 2:1 של 1x TBS:dH₂O ומוסיפים אותה לצלחת פטרי. הכן שקופית מיקרוסקופ על ידי הוספת 800 μL של 2:1 TBS:dH₂O לפני השטח.
    הערה: מומלץ מאוד להשתמש במדיית הרכבה שאינה מרפאת. התקשות אמצעי הרכבה יכולה לשנות את נפח הרקמה מה שעלול לבלבל את הניתוח של נפח שטח האסטרוציטים. מתכון למדיית הרכבה ביתית פשוטה וזולה מסופק בטבלת החומרים.
11. בעזרת מכחול דק, העבירו את החלקים בזה אחר זה מבאר ה-Wash 3 לצלחת הפטרי. שלב זה מסיר את הטריטון ומסייע למקטעים להשתטח. לאחר מכן העבירו את החלקים מצלחת הפטרי לנוזל שבשקופית.
12. השתמש במכחול כדי לסייע בסידור המקטעים כך שיהיו שטוחים בשקופית. יש להסיר בזהירות את עודפי הנוזלים מהמגלשה באמצעות צינור P1000, ולאחר מכן את שאיפת הוואקום.
    הערה: הוסף קצה צינור P200 לקצה צינור הפסטר לשליטה עדינה יותר בשאיפת הוואקום.
13. לאחר הסרת כל הנוזל העודף מהמגלשה, השתמש בצינור העברה כדי להוסיף מיד טיפה אחת של מדיית הרכבה לכל מקטע ולהניח בעדינות כיסוי מעל השקופית. אפשרו למדיית ההרכבה להתפשט למשך מספר דקות, ולאחר מכן הסירו את כל מדיית ההרכבה העודפת שיוצאת מתחת לכיסוי על ידי שאיפת ואקום.
    הערה: אין לאפשר למקטעים להתייבש לפני הוספת מדיית ההרכבה. אם המקטעים מתחילים להתייבש לפני הוספת מדיה להרכבה, הדבר עלול להשפיע על נפח הרקמה ולעכב איסוף נתונים מדויק.
14. אטמו את כל ארבעת הקצוות של הכיסוי בלק שקוף. תנו לשקופיות להתייבש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן אחסנו אותן שטוחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. המתן לפחות שעתיים לפני ההדמיה, או, התמונה למחרת.
    הערה: ניתן לאחסן מקטעים המוכתמים בנוגדנים נגד GFP ו-RFP עד שבועיים לפני ההדמיה, בתנאי שהם אטומים לחלוטין עם לק.

4. הדמיה קונפוקלית

הערה: פרוטוקול זה נותן הנחיות כלליות לרכישת תמונות החלות באופן נרחב על מיקרוסקופים קונפוקליים שונים, ולא פרטים ספציפיים עבור ממשק קונפוקלי ותוכנה מסוים.

1. השתמש במטרה של פי 10 לאתר תאים בודדים להדמיה, תוך שימת לב לאזור המוח או לתת-האזור הספציפי (למשל, שכבה 5 של קליפת המוח הראייתית) כפי שרלוונטי לניסוי. השתמש בידית המיקוד כדי לנסות ולקבוע אם האסטרוציט כולו כלול בתוך הקטע.
2. עברו ליעד שמן בהגדלה גבוהה יותר (למשל, 40x, 60x או 63x) והביאו את התא למיקוד. תוך כדי התבוננות דרך העינית, השתמשו בידית המיקוד כדי לנוע מהחלק העליון לתחתון של התא.
   1. בדוק חזותית את התא כדי לוודא שהתא כולו מוכל בתוך המקטע. אם התא יוצא בפתאומיות מהפוקוס ונחתך בקצה המקטע, אל תכלול תא זה ואתר תא אחר.
3. באמצעות תוכנת הרכישה המשויכת של המיקרוסקופ הקונפוקלי, התאם את פרמטרי הרכישה כדי לקבל יחס אות לרעש ורמת פירוט מתאימים (רזולוציה של 512 x 512 x 512 תספק מספיק פרטים לניתוח שטח ותקצר את זמן רכישת התמונה). השתמש בזום של 2x אם אתה משתמש במטרה של 40x, וללא זום אם אתה משתמש ביעד של 60x או 63x.
4. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של מחסנית z. כדי להבטיח שכל האסטרוציט נלכד, התמונות הראשונות והאחרונות של ערימת z לא צריכות להכיל שום תיוג פלואורסצנטי של התא. לדגימה נאותה, השתמש בגודל צעד של 0.5 מיקרומטר.

5. ניתוח תמונות

הערה: פרוטוקול זה מתאר את השלבים לביצוע ניתוח תמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות הזמינה מסחרית (כלומר, Imaris; ראה טבלת חומרים). ניתן להשתמש בגירסאות אחרות של תוכנה זו עם שינויים קלים בזרימת העבודה. פרוטוקול זה גם דורש מ- MATLAB להפעיל את קובץ ה- XTension הקמור של האל (קובץ משלים).

1. לפני תחילת הניתוח, התקן את הקובץ קמור גוף XTension XTSpotsConvexHull.m על ידי הדבקת הקובץ בתיקיית המשנה rtmatlab של תיקיית XT.
2. השתמש בממיר הקבצים של אימריס כדי להמיר תמונות לפורמט '.ims'. פתח קובץ תמונה בתוכנת ניתוח התמונות וצפה בתמונה במצב צפייה בתלת-ממד על-ידי בחירה בלחצן תצוגה תלת-ממדית .
3. לפני הניתוח, בדוק את התא כדי לוודא שהוא עומד בקריטריוני ההכללה.
   1. ודא שהתא כולו נמצא בתוך התמונה (כלומר, אין לגזור שום חלק של התא מהתמונה). סובב את התמונה כדי לבדוק את הקצוות הקדמיים והאחוריים.
   2. ודא שלתא יש גוף תא אחד בלבד. לחץ על לחצן פרוסה , גרור את הסמן בצד שמאל של המסך כדי לעבור דרך מחסנית z, וודא שהתא המסומן מכיל גוף תא אחד בלבד.
   3. ודא שיש אסטרוציט בודד שניתן להבחין בו מכל אסטרוציטים שכנים המסומנים באותו צבע.
4. יצירת משטח
   1. כאשר לחצן התצוגה התלת-ממדית נבחר שוב, צור משטח חדש על-ידי לחיצה על הסמל הכחול הוסף משטחים חדשים .
      1. בכרטיסיה יצירה המופיעה בפינה השמאלית התחתונה של חלון התוכנה, ודא שרק התיבות 'פלח אזור עניין ' ו'סטטיסטיקה של אובייקט-אובייקט ' מסומנות עבור הגדרות אלגוריתם, והתיבה התחלת יצירה עם תצוגת Slicer עבור העדפות יצירה אינה מסומנת. לחץ על החץ הכחול כדי להמשיך.
         הערה: ייתכן שלא יהיה צורך באזור עניין אם אין אות פלואורסצנטי נוסף בתמונה מחוץ לתא המעניין. במקרה זה, השאר את מקטע רק אזור עניין ללא סימון והמשך לשלב 5.4.3.
   2. צור אזור מעניין סביב התא על-ידי הזנת ממדים לתוך הקופסאות תחת הכלי 'גודל יצירת פני השטח', או גרירת הקצוות של הקופסה הצהובה (איור 2A). לחץ על החץ הכחול כדי להמשיך.
   3. בחר את ערוץ המקור הנכון מהרשימה הנפתחת לניתוח (לדוגמה, ערוץ 1, או הערוץ המכיל את מילוי התא הפלואורסצנטי). הערך בתיבה Surfaces Detail נקבע על-ידי התוכנה ומבוסס על פרמטרים של רכישת תמונה. ודא שערך זה נשאר קבוע עבור כל הדגימות בניסוי. לחץ על החץ הכחול כדי להמשיך.
   4. התאם את הסף (עוצמה מוחלטת) על-ידי גרירת הסרגל הצהוב או על-ידי הזנת ערכים בתיבה כך שהמשטח האפור ימלא כמה שיותר מאותות התא מבלי לחרוג מגבול התא. כמות קטנה של אות פלואורסצנטי תיראה בשולי המשטח (איור 2B). לחץ על החץ הכחול כדי להמשיך.
   5. החלונית האחרונה של הכלי Surface Creation מגדירה את ערך האיכות המינימלי, שהוא ערך הסף התחתון המוגדר כברירת מחדל של התוכנה. ברשימה הנפתחת, ודא כי מספר Voxels Img=1 נבחר. בדוק שרק לחצן ההפעלה השמאלי עבור סף תחתון הוא ירוק (פעיל); לחצן ההפעלה הימני צריך להיות אדום (לא פעיל). ברירת המחדל של התוכנה היא ערך הסף התחתון ל - 10. השאר זאת ללא שינוי ולחץ על החץ הירוק כדי לסיים את יצירת המשטח.
   6. בדוק היטב את המשטח החדש שנוצר. מחק את כל חלקי השטח שאינם חלק מהתא על-ידי בחירתם, לחיצה על הכלי עריכת עיפרון ולחיצה על האפשרות מחק .
   7. אחדו את חלקי המשטח הנותרים על ידי לחיצה על סמל מסנן המשפך כדי לבחור הכל, לחיצה על סמל עריכת העיפרון ולחיצה על האפשרות איחוד (איור 2C).
      הערה: עם קובץ תמונה גדול, התוכנה עלולה לקרוס מדי פעם במהלך השלבים הבאים של פרוטוקול זה. מומלץ לשמור את הקובץ בשלב זה.
5. יצירת כתמים קרובים לפני השטח
   1. לחץ על הסמל כתום הוסף ספוטים חדשים . כאשר הכתמים החדשים (לדוגמה, "ספוטים 1") נבחרו, בכרטיסיה יצירה , ודא שרק התיבה סטטיסטיקה של אובייקט-אובייקט מסומנת עבור הגדרות אלגוריתם, והתיבה התחל יצירה עם תצוגת Slicer עבור העדפות יצירה אינה מסומנת. לחץ על החץ הכחול כדי להמשיך.
   2. בחר את ערוץ המקור הנכון מהרשימה הנפתחת (לדוגמה, ערוץ 1), ולאחר מכן הזן ערך קוטר XY משוער של 0.400 מיקרומטר בתיבה. ודא שרק התיבה 'חיסור רקע ' נבחרה. לחץ על החץ הכחול כדי להמשיך.
      הערה: 0.400 μm מתאים לתמונות 1024 x 1024 x 1024 או 512 x 512 באמצעות 63x, 60x או 40x מטרה. עבור תנאי הדמיה אחרים, הקוטר חייב להיקבע על סמך תנאי ההדמיה ולהישאר קבוע לאורך כל הניתוח. הערך המתאים ייצור מספיק כתמים כדי לכסות את כל האותות החיוביים אך לא יוסיף כתמים על אות הרקע.
   3. החלונית האחרונה של הכלי Spots Creation מגדירה את ערך האיכות המינימלי, שהוא ערך הסף התחתון המוגדר כברירת מחדל של התוכנה; ודא שערך זה יישאר ללא שינוי, אלא אם כן יש הבדל ניכר במיקום/התפלגות של הכתמים (לדוגמה, עקב צביעה באיכות ירודה יותר). לחץ על החץ הירוק כדי לסיים את יצירת הכתמים.
   4. כדי להציג את הכתמים בצורה טובה יותר, שנה את שקיפות המשטח על-ידי בחירה במשטח ולחיצה על הכלי צבע צבעוני. תחת Material, בחר את החומר שהופך את המשטח לשקוף מספיק כדי לראות כתמים לאורך התא (החומר הרביעי עד האחרון ברשימה) (איור 2D,E).
   5. בחר מחדש את הכתמים, לחץ על סמל המסנן ובחר את המרחק הקצר ביותר למשטחים משטחים = משטחים X, כאשר 'משטחים X' הוא המשטח המנותח (לדוגמה, משטחים 1), מהרשימה הנפתחת. ודא שגם לחצני ההפעלה 'סף תחתון' וגם ' סף עליון' ירוקים (פעילים).
      1. הזן מרחק מינימלי של -1.0 מיקרומטר (מרחק הנקודות מהחלק הפנימי של המשטח) בתיבה סף תחתון , ומרחק מרבי של 0.1 מיקרומטר (מרחק מבחוץ) בתיבה סף עליון . לחץ על הלחצן 'בחירה כפולה' ל'ספוטים' חדשים כדי לסיים ליצור נקודות קרובות לפני השטח.
         הערה: ערכי המרחק המינימלי והמקסימום עשויים להשתנות בהתאם לפרמטרים שונים של רכישת תמונה, כגון מטרה, זום ורזולוציה. מספרים אלה חייבים להיקבע באופן אמפירי. המשטח השקוף עוזר לשפוט אם הערכים לוכדים את כל הכתמים שמייצגים במדויק את צורת המשטח.
6. ליצור גוף קמור ולאסוף מדידת שטחים
   1. ודא שהכתמים החדשים שנוצרו נבחרו בחלונית השמאלית העליונה של חלון התוכנה (לדוגמה, "בחירת כתמים 1 ['המרחק הקצר ביותר...]"). לחץ על סמל כלי ההילוכים ולאחר מכן על תוסף הגוף הקמור . לחץ על התוסף רק פעם אחת והמתן עד שחלון MATLAB יופיע ואז ייעלם (פעולה זו עשויה להימשך מספר שניות). גוף מוצק יופיע בתצוגה התלת-ממדית.
   2. בחלונית השמאלית העליונה, בחר גוף קמור של ספוטים X בחירה ['המרחק הקצר ביותר...], כאשר 'בחירת כתמים X' היא הכתמים החדשים שנוצרו (לדוגמה, בחירת כתמים 1), ולאחר מכן לחץ על הגוף כדי לבחור אותו (איור 2F).
   3. לחץ על סמל הגרף סטטיסטיקה , בחר את הכרטיסיה בחירה , ודא שערכים ספציפיים נבחרים מהרשימה הנפתחת העליונה ולאחר מכן בחר אמצעי אחסון מהרשימה הנפתחת התחתונה. תעד את עוצמת הקול של הגוף. שמור את הקובץ והמשך לתמונה הבאה.
7. מדידת נפח חפיפת שטח עבור תאים שכנים עם תוויות פלואורסצנטיות שונות
   הערה: ניתן להשתמש בחלק זה של הפרוטוקול אם הדגימות מכילות אסטרוציטים שכנים המבטאים תוויות פלואורסצנטיות שונות (לדוגמה, אסטרוציט 1 מבטא GFP בלבד ואסטרוציט 2 מבטא RFP בלבד). תיוג זה הושג באמצעות אסטרטגיות ויראליות או גנטיות כפי שתואר קודם לכן ^9,10 (איור 3A).
   1. באמצעות השלבים המפורטים בשלבים 5.4-5.6, צור את המשטח, את הכתמים הקרובים לפני השטח ואת הגוף הקמור עבור כל אסטרוציט (איור 3B).
   2. עם גוף קמור של כתמים 1 בחירה... נבחר, לחץ על העיפרון ערוך סמל ולחץ על בחירת מסיכה. בחלון ערוץ מסיכה , ודא שערוץ 1 (או הערוץ המייצג אסטרוציט 1) נבחר וודא שהתיבה שליד הערוץ הכפול לפני החלת אפשרות המסכה מסומנת. לחץ על אישור כדי ליצור את הערוץ מסיכה CH1.
   3. עם גוף קמור של כתמים 2 מבחר... נבחר, לחץ על העיפרון ערוך סמל ולחץ על בחירת מסיכה. בחלון ערוץ מסיכה , בחר ערוץ 2 (או הערוץ המייצג אסטרוציט 2) מהתפריט הנפתח וודא שהתיבה שליד הערוץ הכפול לפני החלת אפשרות המסכה מסומנת. לחץ על אישור כדי ליצור את הערוץ במסכה CH2 (איור 3C).
   4. לחץ על כפתור Coloc בחלק העליון של המסך והשתמש בכלי Coloc כדי ליצור ערוץ לוקליזציה משותף של שני הערוצים עם מסיכות. הגדר את ערוץ A לערוץ 3 - CH1 במסכה ואת ערוץ B לערוץ 4 - Ch2 במסכה (איור 3D).
   5. גרור את פס ההיסטוגרמה הצהוב שמאלה עבור שני הערוצים. השתמש בתצוגת הפרוסה שלהלן כדי לצפות באות הלוקליזציה המשותפת, אשר יהיה גלוי באפור. שים לב שמכיוון שהאותות הפלואורסצנטיים של שני התאים אינם מתואמים למעשה יחד, יהיה צורך להזיז את הסף שמאלה, כך שהלוקליזציות המשותפות הכוזבות יתחילו להופיע בנקודות של מגע בין התא לתא.
   6. לחץ על בניית ערוץ Coloc בצד ימין כדי להשלים את התהליך. לחץ על התצוגה התלת-ממדית כדי לחזור לתצוגה התלת-ממדית הסטנדרטית. ערוץ תוצאת Colocalization יהיה גלוי כעת באפור ומופיע בתיבת התאמת התצוגה.
   7. צור את המשטח, את הכתמים הקרובים לפני השטח ואת הגוף הקמור של תעלת תוצאת הקולוקליזציה באמצעות השלבים המתוארים ב-5.4-5.7 (איור 3E,F).
   8. רשום את עוצמת הקול של הגוף הקמור. זהו נפח החפיפה של השטח. חלק מספר זה בנפח השטח של אחד האסטרוציטים כדי לחשב את אחוז החפיפה בטריטוריה. בחר את האסטרוציט מסוג שליטה או פרא אם אחד האסטרוציטים עובר מניפולציה גנטית ביחס לשני.

תוצאות

איור 1 מציג חלוקה סכמטית של השלבים העיקריים וזרימת העבודה עבור פרוטוקול זה. איור 2 מציג צילומי מסך של שלבים מרכזיים באמצעות תוכנת ניתוח התמונה כדי ליצור משטח, ליצור כתמים קרובים לפני השטח וליצור גוף קמור. איור 3 מדגים את היישום של טכניקה זו כד...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת לניתוח נפח שטח אסטרוציטים וריצוף אסטרוציטים בקליפת המוח של העכבר, המפרט את כל השלבים העיקריים המתחילים בזלוף ומסתיימים בניתוח תמונה. פרוטוקול זה דורש מוחות מעכברים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים באוכלוסייה דלילה או פסיפס של אסטרוציטים. מחוץ לדרישה זו, ניתן ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Roboz	RS-5045
1 mL TB Syringe	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS (tris-buffered saline)			30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin			28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate	Genesee Scientific	25-107MP
30% Sucrose in TBS			15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS			40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin			0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice	Charles River	022
Collection vial for brains	Fisher Scientific	03-337-20
Confocal acquisition software	Olympous	FV31S-SW
Confocal microscope	Olympus	FV3000RS
Coverslips	Fisher Scientific	12544E
Cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX50
Cryostat blade	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
Embedding mold	Polysciences	18646A-1
Freezing Medium			2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody	Aves Labs	GFP1010
Glycerol	Thermo Scientific	158920010
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A-11039
Goat anti-rabbit 594	Invitrogen	A11037
Goat Serum	Gibco	16210064
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	Version 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
Metal lunch tin	AQUARIUS	N/A	From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol	Sigma-Aldrich	152463
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5921
Mouting medium			20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish	VWR	100491-940
N-propyl gallate	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC	Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6"	Roboz	RS-6820
Orbital platform shaker	Fisher Scientific	88861043	Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush	Bogrinuo	N/A	From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes"
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pasteur pipet (5.75")	VWR	14672-608
Pasteur pipet (9")	VWR	14672-380
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541-500G
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RFP antibody	Rockland	600-401-379
Sectioning medium			1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides	VWR	48311-703
Sodium chrloide	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
TBST (TBS + Triton X-100)			0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet	VWR	414004-002
Tri-bromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100 (high-quality)	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS			xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin			add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST			0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium