Análise do volume do território de astutação e revestimento em seções de tecido livre grossa

Resumo

Este protocolo descreve métodos de seção, coloração e seções de tecido flutuante de imagem do cérebro do camundongo, seguido por uma descrição detalhada da análise do volume de território de astrócito e da sobreposição de território de astrócito.

Resumo

Os astrócitos possuem um grau surpreendente de complexidade morfológica que lhes permite interagir com quase todos os tipos de células e estruturas dentro do cérebro. Através dessas interações, os astrócitos regulam ativamente muitas funções cerebrais críticas, incluindo formação de sinapse, neurotransmissão e homeostase de íon. No cérebro dos roedores, os astrócitos crescem em tamanho e complexidade durante as três primeiras semanas pós-natal e estabelecem territórios distintos e não sobrepostos para ladrilhos cerebrais. Este protocolo fornece um método estabelecido para analisar o volume do território de astrócito e astuta usando seções de tecido flutuante livre do cérebro do camundongo. Primeiro, este protocolo descreve os passos para a coleta de tecidos, criosectioning e imunostaining de seções de tecido flutuante livre. Em segundo lugar, este protocolo descreve a aquisição e análise de imagens do volume de território de astrócito e do volume de sobreposição de território, utilizando software de análise de imagem comercialmente disponível. Por fim, este manuscrito discute as vantagens, considerações importantes, armadilhas comuns e limitações desses métodos. Este protocolo requer tecido cerebral com rotulagem fluorescente esparsa ou mosaico de astrócitos, e foi projetado para ser usado com equipamentos de laboratório comuns, microscopia confocal e software de análise de imagem comercialmente disponível.

Introdução

Os astrócitos são células elaboradas que desempenham muitas funções importantes no cérebro¹. No córtex do camundongo, as células-tronco gliais radiais dão origem a astrócitos durante os estágios pós-natal^tardios e iniciais 2. Durante as três primeiras semanas pós-natal, os astrócitos crescem em tamanho e complexidade, desenvolvendo milhares de ramos finos que interagem diretamente com as sinapses¹. Simultaneamente, os astrócitos interagem com os astrócitos vizinhos para estabelecer territórios discretos e não sobrepostos para ladrilhos cerebrais³, mantendo a comunicação através dos canais de junção⁴. Morfologia e organização de astrócitos são interrompidas em muitos estados da doença após insulto ou lesão⁵, indicando a importância desses processos para a função cerebral adequada. A análise das propriedades morfológicas de astrócitos durante o desenvolvimento normal, o envelhecimento e a doença podem fornecer insights valiosos sobre biologia astrócito e fisiologia. Além disso, a análise da morfologia astrócito após a manipulação genética é uma ferramenta valiosa para discernir os mecanismos celulares e moleculares que regem o estabelecimento e a manutenção da complexidade morfológica de astrócito.

A análise da morfologia de astrócitos no cérebro do camundongo é complicada tanto pela complexidade de ramificação de astrócito quanto por tiling de astrócito. A coloração de anticorpos usando a proteína ácida fibrilara fibrilara glicial (GFAP) de filamento intermediário como marcador específico de astrócito captura apenas os principais ramos, e subestima vastamente a complexidade morfológica de astrócito¹. Outros marcadores específicos de células como o transportador de glutamato 1 (GLT-1; slc1a2), a sisíntese de glutamina ou S100β fazem um trabalho melhor de rotulagem de ramos de astrócito⁶, mas introduzem um novo problema. Os territórios de astrócitos não são em grande parte sobrepostos, mas um pequeno grau de sobreposição existe nas bordas periféricas. Devido à complexidade do ramo, quando os astrócitos vizinhos são rotulados da mesma cor, é impossível distinguir onde um astrócito termina e o outro começa. A rotulagem esparsa ou mosaico de astrócitos com proteínas fluorescentes endógenas resolve ambos os problemas: o marcador fluorescente enche a célula para capturar todos os ramos e permite imagens de astrócitos individuais que podem ser distinguidos de seus vizinhos. Várias estratégias diferentes têm sido usadas para alcançar rotulagem fluorescente esparsa de astrócitos, com ou sem manipulação genética, incluindo injeção viral, eletroporação plasmida ou linhas de camundongos transgênicos. Detalhes sobre a execução dessas estratégias estão descritos em estudos e protocolos publicados anteriormente 1,7,8,9,10,11,12,13.

Este artigo descreve um método para medir o volume de território de astrócito a partir de cérebros de camundongos com rotulagem fluorescente em uma população esparsa de astrócitos (Figura 1). Como o diâmetro médio de um astrócito no córtex do rato é de aproximadamente 60 μm, seções de 100 μm de espessura são usadas para melhorar a eficiência na captura de astrócitos individuais em sua totalidade. A imunostaining não é necessária, mas é recomendado para melhorar o sinal fluorescente endógeno para imagens e análises confocal. A imunostaining também pode permitir uma melhor detecção de ramos de astrócitos finos e reduzir o fotobleaching de proteínas endógenas durante a aquisição de imagens. Para melhorar a penetração de anticorpos nas seções grossas e para preservar o volume de tecido da seção através da imagem, são utilizadas seções de tecido flutuante livre. A análise do volume de território de astrócito é realizada utilizando-se software de análise de imagem comercialmente disponível. Além disso, este protocolo descreve um método de análise de revestimento de astrócito em seções de tecido com rotulagem de mosaico, onde os astrócitos vizinhos expressam diferentes rótulos fluorescentes. Este protocolo tem sido usado com sucesso em vários estudos recentes ^1,8,9 para caracterizar o crescimento de astrócitos durante o desenvolvimento cerebral normal, bem como o impacto da manipulação genética no desenvolvimento de astrócitos.

Protocolo

Todos os camundongos foram utilizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill e a Divisão de Medicina Comparada (protocolo IACUC número 21-116.0). Camundongos de ambos os sexos no pós-natal dia 21 (P21) foram usados para esses experimentos. Os camundongos CD1 foram obtidos comercialmente (Tabela de Materiais), e os ratos MADM9 WT:WT e MADM9 WT:KO foram descritos anteriormente⁹.

NOTA: Este protocolo requer cérebros com expressão de proteína fluorescente em uma população esparsa de astrócitos. A expressão de proteína fluorescente pode ser introduzida geneticamente, viralmente ou por eletroporação. Detalhes dos métodos para rotular astrócitos são descritos em estudos e protocolos publicados anteriormente 1,7,8,9,10,11,12,13.

1. Coleta e preparação de tecidos

ATENÇÃO: Paraformaldeído (PFA) é um produto químico perigoso. Realize todas as etapas com PFA em um capô de fumaça química.

1. Anestesiar camundongos com um anestésico injetável (por exemplo, Avertin; 0,8 mg/kg) e garantir a profundidade da anestesia com uma pitada de dedo do dedo do dedo. Use uma bomba peristáltica para realizar perfusão intracardiac com soro fisiológico tris-tamponado (TBS) + Heparina a uma taxa de ~3 mL/min até que o fígado esteja claro (tipicamente 3-5 min), seguido por PFA de 4% em TBS a uma taxa de ~3 mL/min por 5 min.
   NOTA: A taxa de fluxo e os tempos são otimizados para ratos pós-natal dia 21 (P21). Ajustes na taxa de fluxo e tempo de perfusão podem ser necessários para ratos de diferentes idades.
2. Após a perfusão, use um par de tesouras operacionais para desprender a cabeça e remover a pele para expor o crânio. Em seguida, use um par de tesouras de micro dissecação para remover a parte superior do crânio para expor o cérebro. Use um par de fórceps ou uma pequena espátula para remover o cérebro e transfira-o para um tubo contendo 4% de PFA gelado e incubar durante a noite a 4 °C.
   NOTA: Certifique-se de usar um tubo com um fundo plano, como um frasco de cintilação de 7 mL, para que o cérebro não fique preso na parte inferior do tubo, o que poderia comprimir o tecido e alterar o volume de astutação.
3. No dia seguinte, despeje o PFA do tubo. Adicione 5 mL de 1x TBS ao tubo para enxaguar o cérebro e remover pfa residual. Despeje o TBS e repita este processo mais duas vezes para um total de três enxágues.
4. Adicione 4-5 mL de 30% de sacarose em TBS e incubar o cérebro a 4 °C por 1-2 dias, ou até que o cérebro afunde na parte inferior do tubo.
   NOTA: Os cérebros estão prontos para congelar uma vez que tenham afundado, mas podem ser armazenados em solução de sacarose a 4 °C por várias semanas.
5. Prepare o meio de congelamento em um tubo de 50 mL misturando 15 mL de composto de temperatura de corte (OCT) 100% ideal com 30 mL de 30% de sacarose em TBS. Misture em um nutador ou um agitador orbital por pelo menos 1h para garantir que a solução esteja totalmente misturada. Mantenha o tubo ereto por mais uma hora para permitir que quaisquer bolhas subam à superfície.
   NOTA: O meio de congelamento pode ser preparado com antecedência e armazenado à temperatura ambiente por várias semanas.
6. Use um pipet sorológico para adicionar meio de congelamento a um molde de incorporação quadrada (Tabela de Materiais). Tome cuidado para evitar a introdução de bolhas no meio. Para um cérebro de rato P21, 3 mL é suficiente. Ajuste o volume conforme necessário para diferentes idades para que o cérebro fique completamente submerso.
7. Adicione o cérebro ao meio e use um par de fórceps #5 para remover qualquer tronco cerebral que possa estar impedindo o cérebro de ficar no molde. Alinhe a frente do cérebro com uma borda do molde.
8. Transfira o molde para uma superfície plana resfriada com gelo seco. Uma lata de almoço de metal cheia de gelo seco funciona bem para este fim. Cerque o molde com pelotas de gelo secas para garantir o congelamento lento e até mesmo.
9. Uma vez que o meio de congelamento esteja completamente branco e sólido, armazene o molde a -80 °C.
   NOTA: Os cérebros podem ser armazenados a -80 °C por vários anos.

2. Cyrosectioning

NOTA: Este método de secção destina-se a trabalhar com muitos criostatos disponíveis comercialmente. Com o criostat usado aqui (Tabela de Materiais), a temperatura ideal de corte da cabeça da amostra é de -23 °C, com uma temperatura de câmara ambiente entre -23 °C e -25 °C.

ATENÇÃO: A lâmina criostat é extremamente afiada. Tenha cuidado ao manipular a lâmina e operar o criostat.

1. Prepare o meio de secção misturando 25 mL de 1x TBS e 25 mL de glicerol em um tubo de 50 mL. É mais fácil adicionar o glicerol despejando-o diretamente no tubo e usando os marcadores no tubo para medição. Agite/vórtice o tubo para misturar. Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente por várias semanas.
2. Prepare-se para coletar seções de tecido adicionando 2 mL de meio de secção por poço a uma placa de 12 poços. Rotule a parte superior e inferior da placa com informações de amostra. Coloque a placa, juntamente com outros suprimentos (lâmina criostat, lâmina de barbear, mandris e pincéis), diretamente no criostat, e permita que eles se aclimatem à temperatura por ~5 min.
3. Mova os cérebros para a câmara criostat e permita que eles se aclimatam à temperatura junto com os suprimentos.
4. Remova o bloco de tecido congelado do molde cortando dois cantos do molde com uma lâmina de barbear e descascando o molde do tecido. Oriente o bloco para que a frente do cérebro esteja voltada para cima.
5. Adicione OCT ao mandril de tal forma que ~2/3 do mandril esteja coberto com OCT e coloque imediatamente o bloco de tecido no mandril, mantendo a orientação descrita acima. Pressione o bloco para baixo no OCT para que ele fique plano na superfície do mandril.
6. Uma vez que o OCT esteja completamente congelado e o bloco de tecido esteja firmemente no lugar, aperte o mandril na cabeça da amostra. Insira a lâmina criostat e aproxime a lâmina da amostra.
7. Corte através do cérebro em intervalos de 100 μm até pouco antes da região do cérebro de interesse ser atingida. Para reduzir a quantidade de OCT que se dissolve na mídia de secção, use uma lâmina de barbear para cortar o excesso de meio de congelamento das laterais do bloco de tecido.
8. Uma vez alcançada a região de interesse, comece a coletar seções de 100 μm de espessura. Colete seções usando a placa anti-rolo ou avançando lentamente o criostat com uma mão enquanto usa um pincel na outra mão para guiar a seção para fora do bloco à medida que encontra a lâmina. Se o modelo criostat tem um pedal, use o pedal para avançar o criostat para que ambas as mãos possam ser usadas para guiar a seção para fora do bloco.
9. Transfira as seções para a placa de 12 poços usando um pincel ou fórceps. Cada poço pode conter pelo menos 10-12 seções. Ao adicionar a seção ao meio, geralmente é suficiente para tocar a borda inferior da seção para o meio de secção e permitir que a seção derreta no meio sem molhar a escova ou fórceps. Se a escova tocar no meio, certifique-se de secá-lo com uma toalha de papel ou tecido, pois uma escova excessivamente molhada dificultará a transferência de seções de tecido.
10. Segure a placa embrulhando-a com papel alumínio ou filme de parafina. Certifique-se de rotulá-lo claramente, em seguida, armazená-lo a -20 °C.
    NOTA: Para a maioria dos protocolos de coloração, as seções podem ser armazenadas a -20 °C por pelo menos 1-2 anos sem perda substancial de sinal.

3. Imunostaining

NOTA: Realize todas as lavagens e incubações em um agitador de plataforma orbital a aproximadamente 100 rpm. Todas as etapas são realizadas em temperatura ambiente, exceto a incubação primária de anticorpos, que é realizada a 4 °C. Prepare a mídia de montagem com antecedência, combinando os ingredientes em um tubo de 50 mL e misturando em um nutador durante a noite. Proteja-se contra a luz e armazene a 4 °C por até 2 meses. Se o sinal fluorescente endógeno for suficiente para imagens e análises sem a necessidade de imunossuagem, as etapas 3.1-3.9 podem ser ignoradas. Se faltar à imunostaining, realize três lavagens de 10 min em TBS e prossiga para a etapa 3.10.

1. Prepare uma nova solução de TBST (0,2% Triton em TBS) adicionando 1 mL de Triton-X de 10% a um tubo de 50 mL e preenchendo o tubo a 50 mL com 1x TBS. Prepare 2 mL de soluções de bloqueio e anticorpos (10% de soro de cabra em TBST) para cada cérebro.
   NOTA: Para obter melhores resultados, faça tbst fresco para cada novo experimento de coloração e use uma fonte de alta qualidade de Triton-X 10% aquoso (Tabela de Materiais).
2. Rotule uma placa de 24 poços de acordo com o esquema (Figura 1). Coloque diferentes amostras em diferentes linhas e soluções diferentes em diferentes colunas. Adicione 1 mL de TBST às três primeiras colunas ('Wash 1', 'Wash 2' e 'Wash 3'). Adicione 1 mL de solução de bloqueio à quarta coluna.
3. Prepare uma picareta de vidro derretendo a extremidade de um tubo de 5,75 em Pasteur pipet em um pequeno gancho usando um queimador Bunsen. Use esta picareta para transferir seções de tecido da placa de 12 poços para a coluna Wash 1 da placa de 24 poços.
   NOTA: Para obter melhores resultados, trie as seções antes de iniciar a coloração. Para selecionar seções, transfira as seções uma a uma para uma placa de Petri cheia de 1x TBS e examine as seções usando um microscópio fluorescente com um objetivo de 5x ou 10x para garantir que um número adequado de células fluorescentes rotuladas esteja presente. A coloração de quatro a seis seções por poço é recomendada, embora até oito por poço possam ser manchados, se necessário.
4. Lave as seções por 10 minutos cada na Lavagem 1, 2 e 3 poços, seguidas de incubação das seções por 1h na solução de bloqueio. Use a picareta de vidro para transferir as seções de um poço para o outro. A escolha pode ser usada para transferir várias seções cerebrais ao mesmo tempo.
5. Prepare 1 mL de solução de anticorpos primários para cada amostra (por exemplo, Rabbit RFP 1:2000 ou Chicken GFP 1:2000). Adicione o anticorpo à solução de anticorpos, vórtice brevemente, e depois centrífuga por 5 minutos a ≥ 4.000 x g a 4 °C. Incubar as seções em anticorpos primários por duas a três noites a 4 °C enquanto treme.
6. Após a incubação de anticorpos primários, aspire o Dia 1 TBST dos poços de lavagem, adicione 1 mL de novo TBST a cada poço de lavagem e mova as seções para o primeiro poço de lavagem. Lave as seções 3x por 10 minutos cada.
   NOTA: Para aspiração, use um tubo 9 em Pasteur conectado com tubos a um frasco de vácuo. Linhas de vácuo da casa ou uma bomba de vácuo elétrica podem ser usadas como fonte de vácuo.
7. Enquanto as seções estão sendo lavadas, prepare soluções secundárias de anticorpos em uma concentração de 1:200 adicionando anticorpos à solução de anticorpos (por exemplo, anti-coelho de cabra 594, ou anti-frango de cabra 488). Vórtice brevemente, e depois gire por 5 min a ≥ 4.000 x g a 4 °C.
8. Incubar seções em anticorpos secundários por 3h à temperatura ambiente. Proteja as seções da luz durante esta etapa e todas as etapas a seguir para mitigar o branqueamento dos anticorpos secundários.
9. Após a incubação de anticorpos secundários, aspire o Dia 2 TBST dos poços de lavagem, adicione 1 mL de novo TBST a cada lavagem bem, e mova as seções para o primeiro poço de lavagem. Lave as seções 3x em TBST por 10 minutos cada.
10. Durante a lavagem final, retire a mídia de montagem a partir de 4 °C e deixe aquecer até a temperatura ambiente. Prepare uma mistura 2:1 de 1x TBS:dH₂O e adicione isso a uma placa de Petri. Prepare um slide de microscópio adicionando 800 μL de 2:1 TBS:dH₂O à superfície.
    NOTA: O uso de mídia de montagem não curada é fortemente recomendado. O endurecimento da mídia de montagem pode alterar o volume do tecido que pode confundir a análise do volume do território de astrócito. Uma receita para uma mídia caseira simples e barata é fornecida na Tabela de Materiais.
11. Usando um pincel fino, transfira as seções uma de cada vez da Lavagem 3 bem para a placa de Petri. Esta etapa remove o triton e ajuda as seções a se achatar. Em seguida, transfira as seções da placa de Petri para o líquido no slide.
12. Use um pincel para ajudar a organizar as seções para que fiquem planas no escorregador. Remova cuidadosamente o excesso de líquido do slide com uma tubulação P1000, seguida de aspiração de vácuo.
    NOTA: Adicione uma ponta de tubulação P200 ao final da tubulação Pasteur para um controle mais fino da aspiração do vácuo.
13. Uma vez que todo o excesso de líquido seja removido do slide, use um pipet de transferência para adicionar imediatamente uma gota de mídia de montagem a cada seção e coloque suavemente uma mancha de cobertura sobre o slide. Permita que a mídia de montagem se espalhe por alguns minutos e, em seguida, remova qualquer excesso de mídia de montagem que sai sob o deslizamento de cobertura por aspiração de vácuo.
    NOTA: Não permita que as seções sequem antes de adicionar a mídia de montagem. Se as seções começarem a secar antes da montagem da mídia, isso pode afetar o volume do tecido e impedir a coleta precisa de dados.
14. Sele todas as quatro bordas do deslizamento com esmalte claro. Deixe os slides secarem por 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, armazene-os a 4 °C. Aguarde pelo menos 2h antes de imagem, ou, imagem no dia seguinte.
    NOTA: Seções manchadas com anticorpos contra GFP e RFP podem ser armazenadas por até 2 semanas antes da imagem, desde que estejam completamente seladas com esmalte.

4. Imagem confocal

NOTA: Este protocolo fornece diretrizes gerais de aquisição de imagens que são amplamente aplicáveis a diferentes microscópios confocal, em vez de detalhes específicos para uma interface de software e confocal particular.

1. Use um objetivo de 10x para localizar células individuais para imagens, tomando nota da região cerebral específica ou sub-região (por exemplo, camada 5 do córtex visual) como é relevante para o experimento. Use o botão de foco para tentar determinar se todo o astrócito está contido dentro da seção.
2. Mude para um objetivo de óleo de ampliação mais elevado (por exemplo, 40x, 60x ou 63x) e leve a célula ao foco. Ao olhar através da ocular, use o botão de foco para mover-se de cima para a parte inferior da célula.
   1. Inspecione visualmente a célula para garantir que toda a célula esteja contida dentro da seção. Se a célula sair abruptamente do foco e for cortada na borda da seção, exclua esta célula e localize outra.
3. Usando o software de aquisição associado do microscópio confocal, ajuste os parâmetros de aquisição para obter uma relação sinal-ruído adequada e nível de detalhe (a resolução 512 x 512 fornecerá detalhes suficientes para análise do território e reduzirá o tempo de aquisição de imagens). Use zoom de 2x se usar um objetivo de 40x e sem zoom se usar um objetivo de 60x ou 63x.
4. Defina os limites superiores e inferiores da pilha z. Para garantir que todo o astrócito esteja sendo capturado, as primeiras e últimas imagens da pilha z não devem conter qualquer rotulagem fluorescente da célula. Para amostragem adequada, utilize um tamanho de etapa de 0,5 μm.

5. Análise de imagem

NOTA: Este protocolo descreve as etapas para a realização da análise de imagens utilizando software de análise de imagem comercialmente disponível (ou seja, Imaris; ver Tabela de Materiais). Outras versões deste software podem ser usadas com pequenas modificações no fluxo de trabalho. Este protocolo também requer que o MATLAB execute o arquivo Convex Hull XTension (Arquivo Suplementar).

1. Antes de iniciar a análise, instale o arquivo Convex Hull XTension XTSpotsConvexHull.m colando o arquivo na subpassa rtmatlab da pasta XT.
2. Use o Conversor de Arquivos Imaris para converter imagens em formato '.ims'. Abra um arquivo de imagem no software de análise de imagens e visualize a imagem no modo de visualização 3D selecionando o botão 3D View .
3. Antes da análise, inspecione a célula para garantir que ela atenda aos critérios de inclusão.
   1. Certifique-se de que toda a célula esteja presente dentro da imagem (ou seja, nenhuma parte da célula deve ser cortada da imagem). Gire a imagem para inspecionar as bordas dianteira e traseira.
   2. Certifique-se de que a célula tem apenas um corpo celular. Clique no botão Cortar , arraste o cursor à esquerda da tela para mover-se através da pilha z e verifique se a célula rotulada contém apenas um corpo celular.
   3. Certifique-se de que há um astrócito individual que pode ser distinguido de qualquer astrócito vizinho que são rotulados com a mesma cor.
4. Criar uma superfície
   1. Com o botão 3D View selecionado novamente, crie uma nova superfície clicando no ícone azul Adicionar novas superfícies .
      1. Na guia Criar que aparece no canto inferior esquerdo da janela de software, certifique-se de que apenas as caixas De Região de Interesse e Estatísticas de Objeto-Objeto sejam verificadas para Configurações de Algoritmo, e a criação iniciar com a caixa de exibição Slicer para Preferências de Criação não é verificada. Clique na seta azul para prosseguir.
         NOTA: Uma região de interesse pode não ser necessária se não houver sinal fluorescente adicional na imagem fora da célula de interesse. Neste caso, deixe o Segmento apenas uma Região de Interesse sem controle e prossiga para a etapa 5.4.3.
   2. Crie uma região de interesse ao redor da célula inserindo dimensões nas caixas sob o tamanho da ferramenta Criação de Superfície , ou arrastando as bordas da caixa amarela (Figura 2A). Clique na seta azul para prosseguir.
   3. Selecione o canal de origem correto da lista de retirada para análise (por exemplo, Canal 1 ou o canal que contém o preenchimento de célula fluorescente). O valor na caixa Surfaces Detail é determinado pelo software e baseado em parâmetros de aquisição de imagens. Certifique-se de que esse valor permanece constante para todas as amostras do experimento. Clique na seta azul para prosseguir.
   4. Ajuste o limiar (intensidade absoluta) arrastando a barra amarela ou inserindo valores na caixa para que a superfície cinza preencha o máximo possível de sinal da célula sem ultrapassar o limite da célula. Uma pequena quantidade de sinal fluorescente será visível nas bordas da superfície (Figura 2B). Clique na seta azul para prosseguir.
   5. O último painel da ferramenta Criação de Superfície define o valor mínimo de qualidade, que é o valor padrão do software de Limite Inferior. Na lista de drop-down, certifique-se de que o número de Voxels Img=1 seja selecionado. Verifique se apenas o botão de alimentação esquerda para Limiar Inferior é verde (ativo); o botão de alimentação direito deve ser vermelho (inativo). O software padrão o valor limite inferior para 10. Deixe isso inalterado e clique no arqueiro verde para terminar de gerar a superfície.
   6. Inspecione cuidadosamente a superfície recém-gerada. Exclua todas as peças de superfície que não fazem parte do celular selecionando-as, clicando na ferramenta Editar lápis e clicando na opção Excluir .
   7. Unifique as peças de superfície restantes clicando no ícone do filtro do funil para selecionar todas, clicando no ícone editar lápis e clicando na opção Unificar (Figura 2C).
      NOTA: Com um grande arquivo de imagem, o software pode ocasionalmente travar durante as etapas subsequentes deste protocolo. É uma boa ideia salvar o arquivo neste momento.
5. Gerar manchas perto da superfície
   1. Clique no ícone laranja Adicionar novos pontos . Com as novas vagas (por exemplo, "Spots 1") selecionadas, na guia Criar , certifique-se de que apenas a caixa Estatísticas objeto-objeto seja verificada para Configurações de algoritmos, e a criação iniciar com a caixa de exibição Slicer para Preferências de Criação não é verificada. Clique na seta azul para prosseguir.
   2. Selecione o canal de origem correto da lista de drop-down (por exemplo, Canal 1) e, em seguida, insira um valor estimado de diâmetro XY de 0,400 μm na caixa. Certifique-se de que apenas a caixa de subtração de fundo está selecionada. Clique na seta azul para prosseguir.
      NOTA: 0,400 μm é apropriado para 1024 x 1024 ou 512 x 512 imagens usando 63x, 60x ou 40x objetivo. Para outras condições de imagem, o diâmetro deve ser determinado com base em condições de imagem e permanecer constante durante toda a análise. O valor apropriado criará pontos suficientes para cobrir todos os sinais positivos, mas não adicionará manchas no sinal de fundo.
   3. O último painel da ferramenta Criação de Pontos define o valor mínimo de qualidade, que é o valor padrão do limite inferior do software; garantir que esse valor permaneça inalterado, a menos que haja uma diferença notável na colocação/distribuição das manchas (por exemplo, devido a uma coloração de pior qualidade). Clique no arqueiro verde para terminar de criar as manchas.
   4. Para ver melhor os pontos, altere a transparência da superfície selecionando a superfície e clicando na ferramenta Cores multicoloridas. Em Material, selecione o material que torna a superfície transparente o suficiente para visualizar manchas em toda a célula (o quarto ao último material da lista) (Figura 2D,E).
   5. Selecione as manchas, clique no ícone Filtro e selecione Distância mais curta para superfícies/superfícies X, onde 'Superfícies X' é a superfície que está sendo analisada (por exemplo, Superfícies 1), da lista de quedas. Certifique-se de que os botões de alimentação do Limiar Inferior e do Limite Superior estejam verdes (ativos).
      1. Insira uma distância mínima de -1,0 μm (distância das manchas do interior da superfície) na caixa Limiar Inferior e uma distância máxima de 0,1 μm (distância do exterior) na caixa limiar superior . Clique na Seleção Duplicada para novo botão Pontos para terminar de gerar pontos perto da superfície.
         NOTA: Os valores de distância mínima e máxima podem variar com diferentes parâmetros de aquisição de imagens, como objetivo, zoom e resolução. Esses números devem ser determinados empiricamente. A superfície transparente ajuda a julgar se os valores capturam todas as manchas que representam com precisão a forma da superfície.
6. Gerar casco convexo e coletar medição do território
   1. Certifique-se de que as manchas recém-criadas estão selecionadas no painel superior esquerdo da janela de software (por exemplo, "Spots 1 Selection ['Shortest Distance...]"). Clique no ícone ferramentas de engrenagem e, em seguida, o plugin Convex Hull . Clique no plugin apenas uma vez e aguarde que a janela MATLAB apareça e depois desapareça (isso pode levar vários segundos). Um casco sólido aparecerá na vista 3D.
   2. No painel superior esquerdo, selecione Convex Hull of Spots X Selection ['Shortest Distance...], onde 'Spots X Selection' é o local recém-criado (por exemplo, Seleção de Pontos 1) e, em seguida, clique no casco para selecioná-lo (Figura 2F).
   3. Clique no ícone Estatísticas do gráfico, escolha a guia Seleção , garanta que valores específicos seja selecionado na lista de quedas mais importantes e, em seguida, escolha Volume na lista de quedas inferiores. Regisso o volume do casco. Salve o arquivo e prossiga para a próxima imagem.
7. Medição do volume de sobreposição de território para células vizinhas com diferentes rótulos fluorescentes
   NOTA: Esta seção do protocolo pode ser usada se as amostras conterem astrócitos vizinhos que expressam rótulos fluorescentes distintos (por exemplo, o Astrocyte 1 expressa apenas GFP e o Astrocyte 2 expressa apenas RFP). Essa rotulagem foi alcançada utilizando estratégias virais ou genéticas como descrito anteriormente ^9,10 (Figura 3A).
   1. Utilizando as etapas detalhadas nas etapas 5.4-5.6, crie a superfície, as manchas próximas à superfície e o casco convexo para cada astrócito (Figura 3B).
   2. Com o Casco Convexo de Pontos 1 Seleção... selecionado, clique no ícone editar lápis e clique em Seleção de máscaras. Na janela Canal do Máscara , certifique-se de que o Canal 1 (ou o canal que representa o astrócito 1) seja selecionado e certifique-se de que a caixa ao lado do canal duplicado antes de aplicar a opção de máscara seja verificada. Clique em OK para criar o canal Mascarado CH1.
   3. Com casco convexo de pontos 2 seleção... selecionado, clique no ícone editar lápis e clique em Seleção de máscaras. Na janela Canal do Máscara , selecione o Canal 2 (ou o canal que representa o astrócito 2) no menu suspenso e certifique-se de que a caixa ao lado do canal duplicado antes de aplicar a opção de máscara seja verificada. Clique em OK para criar o canal Mascarado CH2 (Figura 3C).
   4. Clique no botão Coloc na parte superior da tela e use a ferramenta Coloc para criar um canal de co-localização dos dois canais mascarados. Defina o Canal A para o Canal 3 - Mascarado CH1 e Canal B para o Canal 4 - Ch2 Mascarado (Figura 3D).
   5. Arraste a barra de histograma amarelo para a esquerda para ambos os canais. Use a vista da fatia abaixo para observar o sinal de co-localização, que será visível em cinza. Observe que, uma vez que os sinais fluorescentes das duas células não são realmente co-localizados, o limiar precisará ser movido para a esquerda para que falsas co-localizações comecem a aparecer em pontos de contato célula-célula.
   6. Clique no Canal Construir Coloc no lado direito para concluir o processo. Clique na exibição 3D para retornar à exibição 3D padrão. Um canal De Resultado de Colocalização agora será visível em cinza e aparecerá na caixa de ajuste do display.
   7. Crie a superfície, as manchas próximas à superfície e o casco convexo do canal Colocalization Result usando as etapas descritas em 5.4-5.7 (Figura 3E,F).
   8. Regisso volume do casco convexo. Este é o território sobreposto volume. Divida esse número pelo volume territorial de um dos astrócitos para calcular a porcentagem de sobreposição de território. Escolha o controle ou o astrócito selvagem se um dos astrócitos for geneticamente manipulado em relação ao outro.

Resultados

A Figura 1 apresenta um esboço esquemático das principais etapas e fluxo de trabalho para este protocolo. A Figura 2 mostra capturas de tela de etapas-chave usando o software de análise de imagem para gerar uma superfície, gerar manchas próximas à superfície e gerar um casco convexo. A Figura 3 demonstra a aplicação desta técnica para determinar a sobreposição/inclinação do território astrócito. Na

Discussão

Este protocolo descreve um método estabelecido para analisar o volume do território de astrócito e astúcia no córtex do rato, detalhando todos os principais passos que começam com a perfusão e terminam com a análise de imagem. Este protocolo requer cérebros de camundongos que expressam proteínas fluorescentes em uma população esparsa ou mosaico de astrócitos. Fora este requisito, ratos de qualquer idade podem ser usados para este protocolo, com apenas pequenos ajustes nas configurações de perfusão e o vol...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Roboz	RS-5045
1 mL TB Syringe	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS (tris-buffered saline)			30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin			28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate	Genesee Scientific	25-107MP
30% Sucrose in TBS			15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS			40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin			0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice	Charles River	022
Collection vial for brains	Fisher Scientific	03-337-20
Confocal acquisition software	Olympous	FV31S-SW
Confocal microscope	Olympus	FV3000RS
Coverslips	Fisher Scientific	12544E
Cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX50
Cryostat blade	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
Embedding mold	Polysciences	18646A-1
Freezing Medium			2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody	Aves Labs	GFP1010
Glycerol	Thermo Scientific	158920010
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A-11039
Goat anti-rabbit 594	Invitrogen	A11037
Goat Serum	Gibco	16210064
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	Version 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
Metal lunch tin	AQUARIUS	N/A	From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol	Sigma-Aldrich	152463
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5921
Mouting medium			20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish	VWR	100491-940
N-propyl gallate	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC	Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6"	Roboz	RS-6820
Orbital platform shaker	Fisher Scientific	88861043	Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush	Bogrinuo	N/A	From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes"
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pasteur pipet (5.75")	VWR	14672-608
Pasteur pipet (9")	VWR	14672-380
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541-500G
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RFP antibody	Rockland	600-401-379
Sectioning medium			1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides	VWR	48311-703
Sodium chrloide	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
TBST (TBS + Triton X-100)			0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet	VWR	414004-002
Tri-bromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100 (high-quality)	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS			xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin			add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST			0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium