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Ce protocole décrit des méthodes de sectionnement, de coloration et d’imagerie de sections de tissu flottant librement du cerveau de la souris, suivies d’une description détaillée de l’analyse du volume du territoire des astrocytes et du chevauchement ou du carrelage du territoire des astrocytes.
Les astrocytes possèdent un degré étonnant de complexité morphologique qui leur permet d’interagir avec presque tous les types de cellules et de structures dans le cerveau. Grâce à ces interactions, les astrocytes régulent activement de nombreuses fonctions cérébrales critiques, y compris la formation de synapses, la neurotransmission et l’homéostasie ionique. Dans le cerveau des rongeurs, les astrocytes grossissent et se complexifient au cours des trois premières semaines postnatales et établissent des territoires distincts et qui ne se chevauchent pas pour carreler le cerveau. Ce protocole fournit une méthode établie pour analyser le volume du territoire des astrocytes et le carrelage des astrocytes à l’aide de coupes de tissu flottant librement du cerveau de la souris. Tout d’abord, ce protocole décrit les étapes de la collecte de tissus, de la cryosection et de l’immunocoloration des coupes de tissus flottant librement. Deuxièmement, ce protocole décrit l’acquisition d’images et l’analyse du volume du territoire des astrocytes et du volume de chevauchement des territoires, à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images disponible dans le commerce. Enfin, ce manuscrit traite des avantages, des considérations importantes, des pièges courants et des limites de ces méthodes. Ce protocole nécessite des tissus cérébraux avec un marquage fluorescent clairsemé ou en mosaïque des astrocytes, et est conçu pour être utilisé avec l’équipement de laboratoire commun, la microscopie confocale et les logiciels d’analyse d’images disponibles dans le commerce.
Les astrocytes sont des cellules richement ramifiées qui remplissent de nombreuses fonctions importantes dans le cerveau1. Dans le cortex de la souris, les cellules souches gliales radiales donnent naissance à des astrocytes à la fin de l’embryon et au début du stade postnatal2. Au cours des trois premières semaines postnatales, les astrocytes grossissent en taille et en complexité, développant des milliers de branches fines qui interagissent directement avec les synapses1. Simultanément, les astrocytes interagissent avec les astrocytes voisins pour établir des territoires discrets et non superpos....
Toutes les souris ont été utilisées conformément à l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill et à la Division de médecine comparée (numéro de protocole 21-116.0 de l’IACUC). Des souris des deux sexes au jour postnatal 21 (P21) ont été utilisées pour ces expériences. Des souris CD1 ont été obtenues commercialement (Table des matériaux), et les souris MADM9 WT:WT et MADM9 WT:KO ont été décrites précédemment9.
REMARQUE: Ce protocole nécessite des cerveaux avec une expression de protéines fluorescentes dans une population clairsemée d’astrocyt....
La figure 1 présente un schéma des principales étapes et du flux de travail de ce protocole. La figure 2 montre des captures d’écran des étapes clés à l’aide du logiciel d’analyse d’images pour générer une surface, générer des taches proches de la surface et générer une coque convexe. La figure 3 illustre l’application de cette technique pour déterminer le chevauchement/carrelage du territoire des astrocytes........
Ce protocole décrit une méthode établie pour analyser le volume du territoire des astrocytes et le carrelage des astrocytes dans le cortex de la souris, détaillant toutes les étapes majeures commençant par la perfusion et se terminant par l’analyse d’images. Ce protocole nécessite des cerveaux de souris qui expriment des protéines fluorescentes dans une population clairsemée ou en mosaïque d’astrocytes. En dehors de cette exigence, des souris de tout âge peuvent être utilisées pour ce protocole, avec s.......
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
La microscopie a été réalisée au NOYAU DE MICROSCOPIE DES NEUROSCIENCES DE L’UNC (RRID: SCR_019060), soutenue en partie par le financement de la subvention de soutien du NIH-NINDS Neuroscience Center P30 NS045892 et de la subvention de soutien du centre de recherche sur les déficiences intellectuelles et développementales du NIH-NICHD U54 HD079124. La figure 1 a été créée avec BioRender.com. Les images et les données de la figure 4 sont réimprimées à partir d’une publication précédente9 avec l’autorisation de l’éditeur.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
#5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
CD1 mice | Charles River | 022 | |
Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
MATLAB | MathWorks | N/A | |
Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
Slides | VWR | 48311-703 | |
Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
Buffers and Solutions | |||
10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
1x TBS | |||
1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
4% PFA | |||
30% Sucrose in TBS | |||
Freezing Medium | |||
Sectioning medium | |||
TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
Mouting medium |
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