Analyse du volume et du carrelage du territoire des astrocytes dans des sections de tissus épais flottants

Résumé

Ce protocole décrit des méthodes de sectionnement, de coloration et d’imagerie de sections de tissu flottant librement du cerveau de la souris, suivies d’une description détaillée de l’analyse du volume du territoire des astrocytes et du chevauchement ou du carrelage du territoire des astrocytes.

Résumé

Les astrocytes possèdent un degré étonnant de complexité morphologique qui leur permet d’interagir avec presque tous les types de cellules et de structures dans le cerveau. Grâce à ces interactions, les astrocytes régulent activement de nombreuses fonctions cérébrales critiques, y compris la formation de synapses, la neurotransmission et l’homéostasie ionique. Dans le cerveau des rongeurs, les astrocytes grossissent et se complexifient au cours des trois premières semaines postnatales et établissent des territoires distincts et qui ne se chevauchent pas pour carreler le cerveau. Ce protocole fournit une méthode établie pour analyser le volume du territoire des astrocytes et le carrelage des astrocytes à l’aide de coupes de tissu flottant librement du cerveau de la souris. Tout d’abord, ce protocole décrit les étapes de la collecte de tissus, de la cryosection et de l’immunocoloration des coupes de tissus flottant librement. Deuxièmement, ce protocole décrit l’acquisition d’images et l’analyse du volume du territoire des astrocytes et du volume de chevauchement des territoires, à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images disponible dans le commerce. Enfin, ce manuscrit traite des avantages, des considérations importantes, des pièges courants et des limites de ces méthodes. Ce protocole nécessite des tissus cérébraux avec un marquage fluorescent clairsemé ou en mosaïque des astrocytes, et est conçu pour être utilisé avec l’équipement de laboratoire commun, la microscopie confocale et les logiciels d’analyse d’images disponibles dans le commerce.

Introduction

Les astrocytes sont des cellules richement ramifiées qui remplissent de nombreuses fonctions importantes dans le cerveau¹. Dans le cortex de la souris, les cellules souches gliales radiales donnent naissance à des astrocytes à la fin de l’embryon et au début du stade postnatal². Au cours des trois premières semaines postnatales, les astrocytes grossissent en taille et en complexité, développant des milliers de branches fines qui interagissent directement avec les synapses¹. Simultanément, les astrocytes interagissent avec les astrocytes voisins pour établir des territoires discrets et non superpos....

Protocole

Toutes les souris ont été utilisées conformément à l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill et à la Division de médecine comparée (numéro de protocole 21-116.0 de l’IACUC). Des souris des deux sexes au jour postnatal 21 (P21) ont été utilisées pour ces expériences. Des souris CD1 ont été obtenues commercialement (Table des matériaux), et les souris MADM9 WT:WT et MADM9 WT:KO ont été décrites précédemment⁹.

REMARQUE: Ce protocole nécessite des cerveaux avec une expression de protéines fluorescentes dans une population clairsemée d’astrocyt....

Résultats

La figure 1 présente un schéma des principales étapes et du flux de travail de ce protocole. La figure 2 montre des captures d’écran des étapes clés à l’aide du logiciel d’analyse d’images pour générer une surface, générer des taches proches de la surface et générer une coque convexe. La figure 3 illustre l’application de cette technique pour déterminer le chevauchement/carrelage du territoire des astrocytes........

Discussion

Ce protocole décrit une méthode établie pour analyser le volume du territoire des astrocytes et le carrelage des astrocytes dans le cortex de la souris, détaillant toutes les étapes majeures commençant par la perfusion et se terminant par l’analyse d’images. Ce protocole nécessite des cerveaux de souris qui expriment des protéines fluorescentes dans une population clairsemée ou en mosaïque d’astrocytes. En dehors de cette exigence, des souris de tout âge peuvent être utilisées pour ce protocole, avec s.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Roboz	RS-5045
1 mL TB Syringe	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS (tris-buffered saline)			30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin			28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate	Genesee Scientific	25-107MP
30% Sucrose in TBS			15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS			40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin			0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice	Charles River	022
Collection vial for brains	Fisher Scientific	03-337-20
Confocal acquisition software	Olympous	FV31S-SW
Confocal microscope	Olympus	FV3000RS
Coverslips	Fisher Scientific	12544E
Cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX50
Cryostat blade	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
Embedding mold	Polysciences	18646A-1
Freezing Medium			2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody	Aves Labs	GFP1010
Glycerol	Thermo Scientific	158920010
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A-11039
Goat anti-rabbit 594	Invitrogen	A11037
Goat Serum	Gibco	16210064
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	Version 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
Metal lunch tin	AQUARIUS	N/A	From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol	Sigma-Aldrich	152463
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5921
Mouting medium			20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish	VWR	100491-940
N-propyl gallate	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC	Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6"	Roboz	RS-6820
Orbital platform shaker	Fisher Scientific	88861043	Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush	Bogrinuo	N/A	From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes"
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pasteur pipet (5.75")	VWR	14672-608
Pasteur pipet (9")	VWR	14672-380
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541-500G
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RFP antibody	Rockland	600-401-379
Sectioning medium			1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides	VWR	48311-703
Sodium chrloide	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
TBST (TBS + Triton X-100)			0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet	VWR	414004-002
Tri-bromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100 (high-quality)	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS			xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin			add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST			0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium