Analyse du volume et du carrelage du territoire des astrocytes dans des sections de tissus épais flottants

Résumé

Ce protocole décrit des méthodes de sectionnement, de coloration et d’imagerie de sections de tissu flottant librement du cerveau de la souris, suivies d’une description détaillée de l’analyse du volume du territoire des astrocytes et du chevauchement ou du carrelage du territoire des astrocytes.

Résumé

Les astrocytes possèdent un degré étonnant de complexité morphologique qui leur permet d’interagir avec presque tous les types de cellules et de structures dans le cerveau. Grâce à ces interactions, les astrocytes régulent activement de nombreuses fonctions cérébrales critiques, y compris la formation de synapses, la neurotransmission et l’homéostasie ionique. Dans le cerveau des rongeurs, les astrocytes grossissent et se complexifient au cours des trois premières semaines postnatales et établissent des territoires distincts et qui ne se chevauchent pas pour carreler le cerveau. Ce protocole fournit une méthode établie pour analyser le volume du territoire des astrocytes et le carrelage des astrocytes à l’aide de coupes de tissu flottant librement du cerveau de la souris. Tout d’abord, ce protocole décrit les étapes de la collecte de tissus, de la cryosection et de l’immunocoloration des coupes de tissus flottant librement. Deuxièmement, ce protocole décrit l’acquisition d’images et l’analyse du volume du territoire des astrocytes et du volume de chevauchement des territoires, à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images disponible dans le commerce. Enfin, ce manuscrit traite des avantages, des considérations importantes, des pièges courants et des limites de ces méthodes. Ce protocole nécessite des tissus cérébraux avec un marquage fluorescent clairsemé ou en mosaïque des astrocytes, et est conçu pour être utilisé avec l’équipement de laboratoire commun, la microscopie confocale et les logiciels d’analyse d’images disponibles dans le commerce.

Introduction

Les astrocytes sont des cellules richement ramifiées qui remplissent de nombreuses fonctions importantes dans le cerveau¹. Dans le cortex de la souris, les cellules souches gliales radiales donnent naissance à des astrocytes à la fin de l’embryon et au début du stade postnatal². Au cours des trois premières semaines postnatales, les astrocytes grossissent en taille et en complexité, développant des milliers de branches fines qui interagissent directement avec les synapses¹. Simultanément, les astrocytes interagissent avec les astrocytes voisins pour établir des territoires discrets et non superposés pour carreler le cerveau³, tout en maintenant la communication via les canaux^{de jonction 4}. La morphologie et l’organisation des astrocytes sont perturbées dans de nombreux états pathologiques à la suite d’une insulte ou d’une blessure⁵, ce qui indique l’importance de ces processus pour le bon fonctionnement du cerveau. L’analyse des propriétés morphologiques des astrocytes au cours du développement normal, du vieillissement et de la maladie peut fournir des informations précieuses sur la biologie et la physiologie des astrocytes. De plus, l’analyse de la morphologie des astrocytes suite à une manipulation génétique est un outil précieux pour discerner les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent l’établissement et le maintien de la complexité morphologique des astrocytes.

L’analyse de la morphologie des astrocytes dans le cerveau de la souris est compliquée à la fois par la complexité de la ramification des astrocytes et par le carrelage des astrocytes. La coloration des anticorps à l’aide de la protéine acide fibrillaire gliale du filament intermédiaire (GFAP) en tant que marqueur spécifique des astrocytes ne capture que les principales branches et sous-estime considérablement la complexité morphologique des astrocytes¹. D’autres marqueurs spécifiques aux cellules tels que le transporteur de glutamate 1 (GLT-1; slc1a2), la glutamine synthétase ou S100β marquent mieux les branches⁶ des astrocytes, mais introduisent un nouveau problème. Les territoires des astrocytes ne se chevauchent en grande partie pas, mais un faible degré de chevauchement existe aux bords périphériques. En raison de la complexité de la ramification, lorsque les astrocytes voisins sont étiquetés de la même couleur, il est impossible de distinguer où un astrocyte se termine et l’autre commence. Le marquage clairsemé ou en mosaïque des astrocytes avec des protéines fluorescentes endogènes résout les deux problèmes: le marqueur fluorescent remplit la cellule pour capturer toutes les branches et permet l’imagerie d’astrocytes individuels qui peuvent être distingués de leurs voisins. Plusieurs stratégies différentes ont été utilisées pour obtenir un marquage fluorescent clairsemé des astrocytes, avec ou sans manipulation génétique, y compris l’injection virale, l’électroporation plasmidique ou les lignées de souris transgéniques. Les détails sur l’exécution de ces stratégies sont décrits dans des études et des protocoles publiés précédemment ^{1,7,8,9,10,11,12,13}.

Cet article décrit une méthode de mesure du volume du territoire des astrocytes à partir de cerveaux de souris avec marquage fluorescent dans une population clairsemée d’astrocytes (Figure 1). Parce que le diamètre moyen d’un astrocyte dans le cortex de la souris est d’environ 60 μm, des sections de 100 μm d’épaisseur sont utilisées pour améliorer l’efficacité de la capture des astrocytes individuels dans leur intégralité. L’immunocoloration n’est pas nécessaire, mais elle est recommandée pour améliorer le signal fluorescent endogène pour l’imagerie et l’analyse confocales. L’immunocoloration peut également permettre une meilleure détection des fines branches astrocytaires et réduire le photoblanchiment des protéines endogènes lors de l’acquisition de l’image. Pour améliorer la pénétration des anticorps dans les sections épaisses et pour préserver le volume tissulaire de la section par imagerie, des sections de tissu flottant librement sont utilisées. L’analyse du volume du territoire des astrocytes est effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images disponible dans le commerce. En outre, ce protocole décrit une méthode d’analyse du carrelage des astrocytes dans des sections de tissus avec marquage en mosaïque, où les astrocytes voisins expriment différentes étiquettes fluorescentes. Ce protocole a été utilisé avec succès dans plusieurs études récentes ^1,8,9 pour caractériser la croissance des astrocytes au cours du développement normal du cerveau, ainsi que l’impact de la manipulation génétique sur le développement des astrocytes.

Protocole

Toutes les souris ont été utilisées conformément à l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill et à la Division de médecine comparée (numéro de protocole 21-116.0 de l’IACUC). Des souris des deux sexes au jour postnatal 21 (P21) ont été utilisées pour ces expériences. Des souris CD1 ont été obtenues commercialement (Table des matériaux), et les souris MADM9 WT:WT et MADM9 WT:KO ont été décrites précédemment⁹.

REMARQUE: Ce protocole nécessite des cerveaux avec une expression de protéines fluorescentes dans une population clairsemée d’astrocytes. L’expression des protéines fluorescentes peut être introduite génétiquement, viralement ou par électroporation. Les détails des méthodes permettant d’étiqueter de manière éparse les astrocytes sont décrits dans des études et des protocoles publiés précédemment ^{1,7,8,9,10,11,12,13}.

1. Collecte et préparation des tissus

ATTENTION : Le paraformaldéhyde (PFA) est un produit chimique dangereux. Effectuez toutes les étapes avec du PFA dans une hotte à fumée chimique.

1. Anesthésier les souris avec un anesthésique injectable (p. ex., Avertin; 0,8 mg/kg) et assurer la profondeur de l’anesthésie avec un pincement des orteils. Utilisez une pompe péristaltique pour effectuer une perfusion intracardiaque avec une solution saline tamponnée Tris glacée (TBS) + héparine à un taux d’environ 3 mL / min jusqu’à ce que le foie soit clair (généralement 3-5 min), suivie d’un PFA glacé à 4% dans le TBS à un taux d’environ 3 mL / min pendant 5 min.
   REMARQUE: Le débit et les temps sont optimisés pour les souris postnatales du jour 21 (P21). Des ajustements du débit et du temps de perfusion peuvent être nécessaires pour les souris d’âges différents.
2. Après la perfusion, utilisez une paire de ciseaux opératoires pour détacher la tête et enlever la peau pour exposer le crâne. Ensuite, utilisez une paire de ciseaux à micro-dissection pour enlever le haut du crâne afin d’exposer le cerveau. Utilisez une pince ou une petite spatule pour retirer le cerveau et le transférer dans un tube contenant 4% de PFA glacé et incuber pendant la nuit à 4 ° C.
   REMARQUE: Assurez-vous d’utiliser un tube avec un fond plat, tel qu’un flacon de scintillation de 7 mL, afin que le cerveau ne se coince pas dans le fond du tube, ce qui pourrait comprimer le tissu et modifier le volume des astrocytes.
3. Le lendemain, versez le PFA du tube. Ajouter 5 mL de 1x TBS au tube pour rincer le cerveau et éliminer le PFA résiduel. Versez le TBS et répétez ce processus deux fois de plus pour un total de trois rinçages.
4. Ajouter 4-5 mL de saccharose à 30% dans TBS et incuber le cerveau à 4 ° C pendant 1-2 jours, ou jusqu’à ce que le cerveau s’enfonce au fond du tube.
   REMARQUE: Les cerveaux sont prêts à être congelés une fois qu’ils ont coulé, mais peuvent être conservés dans une solution de saccharose à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
5. Préparer le milieu de congélation dans un tube de 50 mL en mélangeant 15 mL de composé à température de coupe optimale (OCT) à 100 % avec 30 mL de saccharose à 30 % dans du TBS. Mélanger sur un nutator ou un agitateur orbital pendant au moins 1 h pour assurer que la solution est complètement mélangée. Gardez le tube droit pendant une heure supplémentaire pour permettre aux bulles de remonter à la surface.
   REMARQUE: Le milieu de congélation peut être préparé à l’avance et conservé à température ambiante pendant plusieurs semaines.
6. Utilisez une pipette sérologique pour ajouter un milieu de congélation à un moule d’encastrement carré (Table des matériaux). Prenez soin d’éviter d’introduire des bulles dans le milieu. Pour un cerveau de souris P21, 3 mL suffisent. Ajustez le volume au besoin pour différents âges afin que le cerveau soit complètement submergé.
7. Ajoutez le cerveau au milieu et utilisez une paire de pinces n ° 5 pour enlever tout tronc cérébral qui pourrait empêcher le cerveau de rester à plat dans le moule. Alignez l’avant du cerveau avec un bord du moule.
8. Transférer le moule sur une surface plane refroidie avec de la glace carbonique. Une boîte à lunch en métal remplie de glace carbonique fonctionne bien à cet effet. Entourez le moule de granulés de glace carbonique pour assurer une congélation lente et uniforme.
9. Une fois que le milieu de congélation est complètement blanc et solide, conservez le moule à -80 °C.
   REMARQUE: Les cerveaux peuvent être stockés à -80 ° C pendant plusieurs années.

2. Cyrosection

REMARQUE: Cette méthode de sectionnement est destinée à fonctionner avec de nombreux cryostats différents disponibles dans le commerce. Avec le cryostat utilisé ici (Table des matériaux), la température optimale de coupe de la tête d’échantillon est de -23 °C, avec une température ambiante de la chambre comprise entre -23 °C et -25 °C.

ATTENTION : La lame du cryostat est extrêmement tranchante. Soyez prudent lorsque vous manipulez la lame et utilisez le cryostat.

1. Préparer le milieu sectionné en mélangeant 25 mL de 1x TBS et 25 mL de glycérol dans un tube de 50 mL. Il est plus facile d’ajouter le glycérol en le versant directement dans le tube et en utilisant les marqueurs sur le tube pour la mesure. Agiter/vortexer le tube pour mélanger. Cette solution peut être conservée à température ambiante pendant plusieurs semaines.
2. Préparez-vous à prélever des coupes de tissu en ajoutant 2 mL de milieu sectionnant par puits à une plaque de 12 puits. Étiquetez le haut et le bas de la plaque avec les informations de l’échantillon. Placez la plaque, ainsi que d’autres fournitures (lame de cryostat, lame de rasoir, mandrins et pinceaux), directement dans le cryostat et laissez-les s’acclimater à la température pendant environ 5 min.
3. Déplacez les cerveaux dans la chambre de cryostat et laissez-les s’acclimater à la température avec les fournitures.
4. Retirez le bloc de tissu congelé du moule en coupant deux coins du moule avec une lame de rasoir et en pelant le moule loin du tissu. Orientez le bloc de sorte que l’avant du cerveau soit tourné vers le haut.
5. Ajoutez l’OCT au mandrin de telle sorte que ~2/3 du mandrin soit recouvert d’OCT et placez immédiatement le bloc de tissu sur le mandrin, en gardant l’orientation décrite ci-dessus. Appuyez sur le bloc vers le bas dans l’OCT afin qu’il soit plat sur la surface du mandrin.
6. Une fois que l’OCT est complètement congelé et que le bloc de tissu est solidement en place, serrez le mandrin à la tête de l’échantillon. Insérez la lame du cryostat et rapprochez-la de l’échantillon.
7. Coupez à travers le cerveau à des intervalles de 100 μm jusqu’à ce que la région d’intérêt du cerveau soit atteinte. Pour réduire la quantité d’OCT qui se dissout dans le milieu de sectionnement, utilisez une lame de rasoir pour couper l’excès de milieu de congélation des côtés du bloc tissulaire.
8. Une fois la région d’intérêt atteinte, commencez à collecter des sections de 100 μm d’épaisseur. Collectez les sections à l’aide de la plaque anti-roulis ou en avançant lentement le cryostat d’une main tout en utilisant un pinceau dans l’autre main pour guider la section hors du bloc lorsqu’elle rencontre la lame. Si le modèle de cryostat a une pédale, utilisez la pédale pour avancer le cryostat afin que les deux mains puissent être utilisées pour guider la section hors du bloc.
9. Transférez les sections sur la plaque à 12 puits à l’aide d’un pinceau ou d’une pince. Chaque puits peut contenir au moins 10 à 12 sections. Lors de l’ajout de la section au milieu, il suffit généralement de toucher le bord inférieur de la section au milieu de sectionnement et de permettre à la section de fondre dans le milieu sans mouiller la brosse ou la pince. Si la brosse touche le milieu, assurez-vous de le sécher avec une serviette en papier ou un mouchoir en papier, car une brosse trop humide rendra difficile le transfert des sections de tissu.
10. Fixez la plaque en l’enveloppant d’une feuille d’aluminium ou d’un film de paraffine. Assurez-vous de l’étiqueter clairement, puis conservez-le à -20 °C.
    REMARQUE: Pour la plupart des protocoles de coloration, les sections peuvent être stockées à -20 ° C pendant au moins 1 à 2 ans sans perte substantielle de signal.

3. Immunocoloration

REMARQUE: Effectuez tous les lavages et incubations sur un agitateur de plate-forme orbitale réglé à environ 100 tr / min. Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante, à l’exception de l’incubation primaire des anticorps, qui est effectuée à 4 °C. Préparez le support de montage à l’avance en combinant les ingrédients dans un tube de 50 mL et en mélangeant sur un nutateur pendant la nuit. Protéger de la lumière et conserver à 4 °C jusqu’à 2 mois. Si le signal fluorescent endogène est suffisant pour l’imagerie et l’analyse sans nécessiter d’immunocoloration, les étapes 3.1 à 3.9 peuvent être ignorées. Si vous sautez l’immunocoloration, effectuez trois lavages de 10 minutes dans TBS et passez à l’étape 3.10.

1. Préparer une nouvelle solution de TBST (0,2 % de Triton dans tbS) en ajoutant 1 mL de Triton-X à 10 % dans un tube de 50 mL et en remplissant le tube à 50 mL avec 1x TBS. Préparez 2 mL de solutions de blocage et d’anticorps (10 % de sérum de chèvre dans TBST) pour chaque cerveau.
   REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, préparez du TBST frais pour chaque nouvelle expérience de coloration et utilisez une source de haute qualité de Triton-X aqueux à 10% (Table des matériaux).
2. Étiquetez une plaque de 24 puits selon le schéma (Figure 1). Placez différents échantillons dans différentes lignes et différentes solutions dans différentes colonnes. Ajouter 1 mL de TBST aux trois premières colonnes (« Laver 1 », « Laver 2 » et « Laver 3 »). Ajoutez 1 mL de solution bloquante à la quatrième colonne.
3. Préparez un pic à verre en faisant fondre l’extrémité d’une pipette Pasteur 5.75 dans un petit crochet à l’aide d’un brûleur Bunsen. Utilisez ce médiator pour transférer des sections de tissu de la plaque de 12 puits dans la colonne Wash 1 de la plaque de 24 puits.
   REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, filtrez les sections avant de commencer à tacher. Pour filtrer les sections, transférez les sections une par une dans une boîte de Petri remplie de 1x TBS et examinez les sections à l’aide d’un microscope fluorescent avec un objectif 5x ou 10x pour vous assurer qu’un nombre adéquat de cellules marquées par fluorescence sont présentes. Il est recommandé de tacher quatre à six sections par puits, bien que jusqu’à huit par puits puissent être tachés si nécessaire.
4. Lavez les sections pendant 10 minutes chacune dans les puits Wash 1, 2 et 3, puis incubez les sections pendant 1 h dans la solution bloquante. Utilisez le pic à verre pour transférer les sections d’un puits à l’autre. Le pic peut être utilisé pour transférer plusieurs sections du cerveau à la fois.
5. Préparer 1 mL de solution d’anticorps primaires pour chaque échantillon (p. ex., DP de lapin 1:2000 ou GFP de poulet 1:2000). Ajouter l’anticorps à la solution d’anticorps, vortex brièvement, puis centrifuger pendant 5 min à ≥ 4 000 x g à 4 °C. Incuber les sections dans un anticorps primaire pendant deux à trois nuits à 4 °C tout en agitant.
6. Après l’incubation des anticorps primaires, aspirer le TBST jour 1 des puits de lavage, ajouter 1 mL de nouveau TBST à chaque puits de lavage et déplacer les sections dans le premier puits de lavage. Lavez les sections 3x pendant 10 min chacune.
   REMARQUE: Pour l’aspiration, utilisez une pipette Pasteur 9 dans reliée avec un tube à une fiole sous vide. Les conduites de vide domestiques ou une pompe à vide électrique peuvent être utilisées comme source de vide.
7. Pendant le lavage des sections, préparer des solutions d’anticorps secondaires à une concentration de 1:200 en ajoutant des anticorps à la solution d’anticorps (p. ex. anti-lapin de chèvre 594 ou anti-poulet de chèvre 488). Vortex brièvement, puis rotation pendant 5 min à ≥ 4 000 x g à 4 °C.
8. Incuber des sections dans un anticorps secondaire pendant 3 h à température ambiante. Protégez les sections de la lumière pendant cette étape et toutes les étapes suivantes pour atténuer le blanchiment des anticorps secondaires.
9. Après l’incubation secondaire des anticorps, aspirer le TBST du jour 2 des puits de lavage, ajouter 1 mL de nouveau TBST à chaque puits de lavage et déplacer les sections dans le premier puits de lavage. Lavez les sections 3x dans TBST pendant 10 minutes chacune.
10. Lors du lavage final, retirez le support de montage de 4 °C et laissez-le chauffer à la température ambiante. Préparez un mélange 2:1 de 1x TBS:dH₂O et ajoutez-le à une boîte de Pétri. Préparez une lame de microscope en ajoutant 800 μL de 2:1 TBS:dH₂O à la surface.
    REMARQUE: L’utilisation d’un support de montage non durcissable est fortement recommandée. Le durcissement des milieux de montage peut altérer le volume du tissu, ce qui peut confondre l’analyse du volume du territoire des astrocytes. Une recette pour un support de montage maison simple et peu coûteux est fournie dans la table des matériaux.
11. À l’aide d’un pinceau fin, transférez les sections une à la fois du puits Wash 3 à la boîte de Pétri. Cette étape supprime le triton et aide les sections à s’aplatir. Ensuite, transférez les sections de la boîte de Petri dans le liquide sur la glissière.
12. Utilisez un pinceau pour aider à organiser les sections de manière à ce qu’elles soient plates sur la diapositive. Retirez soigneusement l’excès de liquide de la glissière avec une pipette P1000, suivie d’une aspiration sous vide.
    REMARQUE: Ajoutez une pointe de pipette P200 à l’extrémité de la pipette Pasteur pour un contrôle plus fin de l’aspiration sous vide.
13. Une fois que tout excès de liquide est retiré de la glissière, utilisez un pipet de transfert pour ajouter immédiatement une goutte de support de montage à chaque section et déposez doucement un couvercle sur la glissière. Laissez le support de montage se propager pendant quelques minutes, puis retirez tout support de montage excédentaire qui sort de sous le couvercle par aspiration sous vide.
    REMARQUE: Ne laissez pas les sections sécher à tout moment avant d’ajouter le support de montage. Si les sections commencent à sécher avant l’ajout d’un support de montage, cela peut avoir un impact sur le volume de tissu et entraver la collecte de données précises.
14. Scellez les quatre bords du couvercle avec du vernis à ongles transparent. Laissez sécher les lames pendant 30 min à température ambiante, puis conservez-les à plat à 4 °C. Attendez au moins 2 h avant d’imager, ou l’image le lendemain.
    REMARQUE: Les sections colorées avec des anticorps contre la GFP et la RFP peuvent être conservées jusqu’à 2 semaines avant l’imagerie, à condition qu’elles soient complètement scellées avec du vernis à ongles.

4. Imagerie confocale

REMARQUE: Ce protocole donne des directives générales d’acquisition d’images qui sont largement applicables à différents microscopes confocaux, plutôt que des détails spécifiques pour une interface confocale et logicielle particulière.

1. Utilisez un objectif 10x pour localiser des cellules individuelles pour l’imagerie, en prenant note de la région ou de la sous-région spécifique du cerveau (par exemple, la couche 5 du cortex visuel) qui est pertinente pour l’expérience. Utilisez le bouton de mise au point pour essayer de déterminer si l’astrocyte entier est contenu dans la section.
2. Passez à un objectif d’huile à grossissement plus élevé (par exemple, 40x, 60x ou 63x) et mettez la cellule au point. Lorsque vous regardez à travers l’oculaire, utilisez le bouton de mise au point pour vous déplacer du haut vers le bas de la cellule.
   1. Inspectez visuellement la cellule pour vous assurer que la cellule entière est contenue dans la section. Si la cellule se déconnecte brusquement et est coupée au bord de la section, excluez cette cellule et localisez-en une autre.
3. À l’aide du logiciel d’acquisition associé au microscope confocal, ajustez les paramètres d’acquisition pour obtenir un rapport signal/bruit et un niveau de détail appropriés (une résolution de 512 x 512 fournira suffisamment de détails pour l’analyse du territoire et réduira le temps d’acquisition de l’image). Utilisez le zoom 2x si vous utilisez un objectif 40x, et pas de zoom si vous utilisez un objectif 60x ou 63x.
4. Définissez les limites supérieure et inférieure de la pile z. Pour s’assurer que l’ensemble de l’astrocyte est capturé, la première et la dernière image de la pile z ne doivent pas contenir de marquage fluorescent de la cellule. Pour un échantillonnage adéquat, utilisez une taille d’étape de 0,5 μm.

5. Analyse d’images

REMARQUE : Ce protocole décrit les étapes à suivre pour effectuer une analyse d’image à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images disponible dans le commerce (c.-à-d. Imaris; voir tableau des matériaux). D’autres versions de ce logiciel peuvent être utilisées avec des modifications mineures du flux de travail. Ce protocole nécessite également que MATLAB exécute le fichier Convex Hull XTension (supplemental File).

1. Avant de commencer l’analyse, installez le fichier Convex Hull XTension XTSpotsConvexHull.m en collant le fichier dans le sous-dossier rtmatlab du dossier XT.
2. Utilisez le convertisseur de fichiers Imaris pour convertir des images au format '.ims'. Ouvrez un fichier image dans le logiciel d’analyse d’image et visualisez l’image en mode de visualisation 3D en sélectionnant le bouton Vue 3D .
3. Avant l’analyse, inspectez la cellule pour vous assurer qu’elle répond aux critères d’inclusion.
   1. Assurez-vous que la cellule entière est présente dans l’image (c.-à-d. qu’aucune partie de la cellule ne doit être découpée de l’image). Faites pivoter l’image pour inspecter les bords avant et arrière.
   2. Assurez-vous que la cellule n’a qu’un seul corps cellulaire. Cliquez sur le bouton Trancher , faites glisser le curseur à gauche de l’écran pour vous déplacer dans la pile z et vérifiez que la cellule étiquetée ne contient qu’un seul corps de cellule.
   3. Assurez-vous qu’il y a un astrocyte individuel qui peut être distingué de tous les astrocytes voisins qui sont étiquetés avec la même couleur.
4. Créer une surface
   1. Avec le bouton Vue 3D sélectionné à nouveau, créez une nouvelle surface en cliquant sur l’icône bleue Ajouter de nouvelles surfaces .
      1. Dans l’onglet Créer qui apparaît en bas à gauche de la fenêtre du logiciel, assurez-vous que seules les cases Segmenter uniquement une région d’intérêt et Statistiques objet-objet sont cochées pour Paramètres d’algorithme et que la zone Démarrer la création avec la vue Slicer pour préférences de création est décochée. Cliquez sur la flèche bleue pour continuer.
         REMARQUE: Une région d’intérêt peut ne pas être nécessaire s’il n’y a pas de signal fluorescent supplémentaire dans l’image en dehors de la cellule d’intérêt. Dans ce cas, laissez segment uniquement une région d’intérêt décoché et passez à l’étape 5.4.3.
   2. Créez une région d’intérêt autour de la cellule en entrant des cotes dans les zones sous Taille de l’outil Création de surface ou en faisant glisser les bords de la zone jaune (Figure 2A). Cliquez sur la flèche bleue pour continuer.
   3. Sélectionnez le canal source approprié dans la liste déroulante pour l’analyse (par exemple, le canal 1 ou le canal qui contient le remplissage de la cellule fluorescente). La valeur de la zone Détails des surfaces est déterminée par le logiciel et basée sur les paramètres d’acquisition d’image. Assurez-vous que cette valeur reste constante pour tous les échantillons de l’expérience. Cliquez sur la flèche bleue pour continuer.
   4. Ajustez le seuil (intensité absolue) en faisant glisser la barre jaune ou en entrant des valeurs dans la zone afin que la surface grise remplisse autant de signal de la cellule que possible sans dépasser les limites de la cellule. Une petite quantité de signal fluorescent sera visible sur les bords de la surface (Figure 2B). Cliquez sur la flèche bleue pour continuer.
   5. Le dernier panneau de l’outil Création de surface définit la valeur de qualité minimale, qui est la valeur de seuil inférieur par défaut du logiciel. Dans la liste déroulante, assurez-vous que l’option Nombre de voxels Img=1 est sélectionnée. Vérifiez que seul le bouton d’alimentation gauche du seuil inférieur est vert (actif) ; le bouton d’alimentation droit doit être rouge (inactif). Le logiciel définit par défaut la valeur Lower Threshold sur 10. Laissez cela inchangé et cliquez sur la flèche verte pour terminer la génération de la surface.
   6. Inspectez soigneusement la surface nouvellement générée. Supprimez toutes les pièces de surface qui ne font pas partie de la cellule en les sélectionnant, en cliquant sur l’outil d’édition du crayon et en cliquant sur l’option Supprimer .
   7. Unifiez les pièces de surface restantes en cliquant sur l’icône Filtre en entonnoir pour tout sélectionner, en cliquant sur l’icône Modifier au crayon et en cliquant sur l’option Unifier (Figure 2C).
      REMARQUE: Avec un fichier image volumineux, le logiciel peut parfois se bloquer au cours des étapes suivantes de ce protocole. C’est une bonne idée d’enregistrer le fichier à ce stade.
5. Générer des taches à proximité de la surface
   1. Cliquez sur l’icône orange Ajouter de nouveaux spots . Lorsque les nouveaux Spots (par exemple, « Spots 1 ») sont sélectionnés, dans l’onglet Créer, assurez-vous que seule la case Statistiques objet-objet est cochée pour Paramètres d’algorithme et que la case Démarrer la création avec la vue Slicer pour préférences de création est décochée. Cliquez sur la flèche bleue pour continuer.
   2. Sélectionnez le canal source approprié dans la liste déroulante (par exemple, canal 1), puis entrez une valeur de diamètre XY estimé de 0,400 μm dans la zone. Assurez-vous que seule la zone Soustraction d’arrière-plan est sélectionnée. Cliquez sur la flèche bleue pour continuer.
      REMARQUE : 0,400 μm est approprié pour les images 1024 x 1024 ou 512 x 512 utilisant un objectif 63x, 60x ou 40x. Pour les autres conditions d’imagerie, le diamètre doit être déterminé en fonction des conditions d’imagerie et rester constant tout au long de l’analyse. La valeur appropriée créera suffisamment de points pour couvrir tous les signaux positifs, mais n’ajoutera pas de points sur le signal d’arrière-plan.
   3. Le dernier panneau de l’outil Création de spots définit la valeur de qualité minimale, qui est la valeur de seuil inférieur par défaut du logiciel ; s’assurer que cette valeur demeure inchangée, à moins qu’il n’y ait une différence notable dans l’emplacement ou la distribution des taches (p. ex., en raison d’une coloration de moins bonne qualité). Cliquez sur la flèche verte pour terminer la création des taches.
   4. Pour mieux afficher les taches, modifiez la transparence de la surface en sélectionnant Surface et en cliquant sur l’outil Couleur multicolore. Sous Matériau, sélectionnez le matériau qui rend la surface suffisamment transparente pour afficher les taches dans toute la cellule (le quatrième ou dernier matériau de la liste) (Figure 2D,E).
   5. Sélectionnez à nouveau les spots, cliquez sur l’icône Filtre et sélectionnez Distance la plus courte par rapport aux surfaces Surfaces = Surfaces X, où « Surfaces X » est la surface analysée (par exemple, Surfaces 1), dans la liste déroulante. Assurez-vous que les boutons d’alimentation Seuil inférieur et Seuil supérieur sont verts (actifs).
      1. Entrez une distance minimale de -1,0 μm (distance des taches par rapport à l’intérieur de la surface) dans la zone Seuil inférieur et une distance maximale de 0,1 μm (distance de l’extérieur) dans la zone Seuil supérieur . Cliquez sur le bouton Dupliquer la sélection vers de nouveaux spots pour terminer la génération de points près de la surface.
         REMARQUE : Les valeurs de distance minimale et maximale peuvent varier en fonction de différents paramètres d’acquisition d’image, tels que l’objectif, le zoom et la résolution. Ces chiffres doivent être déterminés empiriquement. La surface transparente permet de juger si les valeurs capturent tous les points qui représentent avec précision la forme de la surface.
6. Générer une coque convexe et collecter la mesure du territoire
   1. Assurez-vous que les spots nouvellement créés sont sélectionnés dans le panneau supérieur gauche de la fenêtre du logiciel (par exemple, « Sélection spots 1 ['Distance la plus courte...] »). Cliquez sur l’icône Outils d’engrenage , puis sur le plugin Convex Hull . Cliquez sur le plugin une seule fois et attendez que la fenêtre MATLAB apparaisse puis disparaisse (cela peut prendre plusieurs secondes). Une coque solide apparaîtra dans la vue 3D.
   2. Dans le panneau supérieur gauche, sélectionnez Coque convexe de spots X Selection ['Distance la plus courte...], où 'Spots X Selection' est les spots nouvellement créés (par exemple, Spots 1 Selection), puis cliquez sur la coque pour la sélectionner (Figure 2F).
   3. Cliquez sur l’icône Statistiques du graphique, choisissez l’onglet Sélection , assurez-vous que Valeurs spécifiques est sélectionnée dans la liste déroulante supérieure, puis choisissez Volume dans la liste déroulante inférieure. Enregistrez le volume de la coque. Enregistrez le fichier et passez à l’image suivante.
7. Mesure du volume de chevauchement de territoire pour les cellules voisines avec différentes étiquettes fluorescentes
   REMARQUE: Cette section du protocole peut être utilisée si les échantillons contiennent des astrocytes voisins qui expriment des étiquettes fluorescentes distinctes (par exemple, Astrocyte 1 exprime uniquement GFP et Astrocyte 2 exprime RFP uniquement). Ce marquage a été réalisé à l’aide de stratégies virales ou génétiques décrites précédemment ^9,10 (Figure 3A).
   1. À l’aide des étapes détaillées aux étapes 5.4 à 5.6, créez la surface, les taches proches de la surface et la coque convexe pour chaque astrocyte (Figure 3B).
   2. Avec Coque convexe des spots 1 Sélection... sélectionné, cliquez sur l’icône Modifier au crayon et cliquez sur Sélection du masque. Dans la fenêtre Canal de masque , assurez-vous que le canal 1 (ou le canal représentant l’astrocyte 1) est sélectionné et assurez-vous que la case à côté du canal dupliqué avant d’appliquer l’option de masque est cochée. Cliquez sur OK pour créer le canal Masked CH1.
   3. Avec coque convexe de Spots 2 Selection... sélectionné, cliquez sur l’icône modifier au crayon et cliquez sur Sélection du masque. Dans la fenêtre Canal de masque , sélectionnez Canal 2 (ou le canal représentant l’astrocyte 2) dans le menu déroulant et assurez-vous que la case à côté du canal dupliqué avant d’appliquer l’option de masque est cochée. Cliquez sur OK pour créer le canal CH2 masqué (Figure 3C).
   4. Cliquez sur le bouton Coloc en haut de l’écran et utilisez l’outil Coloc pour créer un canal de colocalisation des deux canaux masqués. Définissez le canal A sur canal 3 - CH1 masqué et le canal B sur canal 4 - CH2 masqué (Figure 3D).
   5. Faites glisser la barre d’histogramme jaune vers la gauche pour les deux couches. Utilisez la vue en tranches ci-dessous pour observer le signal de colocalisation, qui sera visible en gris. Notez que puisque les signaux fluorescents des deux cellules ne sont pas réellement co-localisés, le seuil devra être déplacé vers la gauche afin que de fausses co-localisations commencent à apparaître aux points de contact cellule-cellule.
   6. Cliquez sur Build Coloc Channel sur le côté droit pour terminer le processus. Cliquez sur la vue 3D pour revenir à la vue 3D standard. Un canal de résultat de colocalisation sera désormais visible en gris et apparaîtra dans la zone de réglage de l’affichage.
   7. Créez la surface, les taches proches de la surface et la coque convexe du canal Résultat de colocalisation à l’aide des étapes décrites aux points 5.4 à 5.7 (Figure 3E,F).
   8. Enregistrez le volume de la coque convexe. Il s’agit du volume de chevauchement de territoire. Divisez ce nombre par le volume de territoire de l’un des astrocytes pour calculer le pourcentage de chevauchement de territoire. Choisissez l’astrocyte témoin ou de type sauvage si l’un des astrocytes est génétiquement manipulé par rapport à l’autre.

Résultats

La figure 1 présente un schéma des principales étapes et du flux de travail de ce protocole. La figure 2 montre des captures d’écran des étapes clés à l’aide du logiciel d’analyse d’images pour générer une surface, générer des taches proches de la surface et générer une coque convexe. La figure 3 illustre l’application de cette technique pour déterminer le chevauchement/carrelage du territoire des astrocytes....

Discussion

Ce protocole décrit une méthode établie pour analyser le volume du territoire des astrocytes et le carrelage des astrocytes dans le cortex de la souris, détaillant toutes les étapes majeures commençant par la perfusion et se terminant par l’analyse d’images. Ce protocole nécessite des cerveaux de souris qui expriment des protéines fluorescentes dans une population clairsemée ou en mosaïque d’astrocytes. En dehors de cette exigence, des souris de tout âge peuvent être utilisées pour ce protocole, avec s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Roboz	RS-5045
1 mL TB Syringe	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS (tris-buffered saline)			30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin			28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate	Genesee Scientific	25-107MP
30% Sucrose in TBS			15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS			40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin			0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice	Charles River	022
Collection vial for brains	Fisher Scientific	03-337-20
Confocal acquisition software	Olympous	FV31S-SW
Confocal microscope	Olympus	FV3000RS
Coverslips	Fisher Scientific	12544E
Cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX50
Cryostat blade	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
Embedding mold	Polysciences	18646A-1
Freezing Medium			2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody	Aves Labs	GFP1010
Glycerol	Thermo Scientific	158920010
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A-11039
Goat anti-rabbit 594	Invitrogen	A11037
Goat Serum	Gibco	16210064
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	Version 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
Metal lunch tin	AQUARIUS	N/A	From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol	Sigma-Aldrich	152463
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5921
Mouting medium			20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish	VWR	100491-940
N-propyl gallate	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC	Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6"	Roboz	RS-6820
Orbital platform shaker	Fisher Scientific	88861043	Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush	Bogrinuo	N/A	From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes"
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pasteur pipet (5.75")	VWR	14672-608
Pasteur pipet (9")	VWR	14672-380
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541-500G
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RFP antibody	Rockland	600-401-379
Sectioning medium			1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides	VWR	48311-703
Sodium chrloide	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
TBST (TBS + Triton X-100)			0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet	VWR	414004-002
Tri-bromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100 (high-quality)	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS			xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin			add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST			0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium