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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum Schneiden, Färben und Abbilden von frei schwebenden Gewebeabschnitten des Mäusegehirns, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung der Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Überlappung oder Kachelung des Astrozytenterritoriums.

Zusammenfassung

Astrozyten besitzen einen erstaunlichen Grad an morphologischer Komplexität, der es ihnen ermöglicht, mit fast jeder Art von Zelle und Struktur im Gehirn zu interagieren. Durch diese Wechselwirkungen regulieren Astrozyten aktiv viele kritische Gehirnfunktionen, einschließlich Synapsenbildung, Neurotransmission und Ionenhomöostase. Im Nagetiergehirn wachsen Astrozyten in den ersten drei postnatalen Wochen an Größe und Komplexität und bilden verschiedene, nicht überlappende Gebiete, um das Gehirn zu kacheln. Dieses Protokoll bietet eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung unter Verwendung von frei schwebenden Gewebeschnitten aus dem Mäusegehirn. Zunächst beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur Gewebeentnahme, Kryosektion und Immunfärbung von frei schwebenden Gewebeschnitten. Zweitens beschreibt dieses Protokoll die Bildaufnahme und Analyse des Astrozytengebietsvolumens und des Gebietsüberlappungsvolumens unter Verwendung kommerziell verfügbarer Bildanalysesoftware. Schließlich diskutiert dieses Manuskript die Vorteile, wichtige Überlegungen, häufige Fallstricke und Einschränkungen dieser Methoden. Dieses Protokoll erfordert Hirngewebe mit spärlicher oder mosaikfluoreszierender Markierung von Astrozyten und ist für die Verwendung mit gängigen Laborgeräten, konfokaler Mikroskopie und kommerziell erhältlicher Bildanalysesoftware konzipiert.

Einleitung

Astrozyten sind aufwendig verzweigte Zellen, die viele wichtige Funktionen im Gehirn erfüllen1. In der Mausrinde entstehen radiale Gliastammzellen Astrozyten während der späten embryonalen und frühen postnatalen Stadien2. Während der ersten drei postnatalen Wochen wachsen Astrozyten an Größe und Komplexität und entwickeln Tausende von feinen Zweigen, die direkt mit Synapsen interagieren1. Gleichzeitig interagieren Astrozyten mit benachbarten Astrozyten, um diskrete, nicht überlappende Territorien zu schaffen, um das Gehirn zu kacheln3, während die Kommunikation über

Protokoll

Alle Mäuse wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina in Chapel Hill und der Division of Comparative Medicine (IACUC-Protokollnummer 21-116.0) verwendet. Für diese Experimente wurden Mäuse beiderlei Geschlechts am postnatalen Tag 21 (P21) verwendet. CD1-Mäuse wurden kommerziell gewonnen (Table of Materials), und MADM9 WT:WT und MADM9 WT:KO Mäuse wurden zuvor9 beschrieben.

HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert Gehirne mit fluoreszierender Proteinexpression in einer spärlichen Population von Astrozyten. Die Expression fluoresz....

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über die wichtigsten Schritte und den Workflow für dieses Protokoll. Abbildung 2 zeigt Screenshots der wichtigsten Schritte mit der Bildanalysesoftware zum Generieren einer Oberfläche, zum Generieren von Punkten in der Nähe der Oberfläche und zum Generieren einer konvexen Hülle. Abbildung 3 zeigt die Anwendung dieser Technik zur Bestimmung der Überlappung/Kachelung des Astrozyt.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung im Mauskortex und beschreibt alle wichtigen Schritte, beginnend mit der Perfusion und endend mit der Bildanalyse. Dieses Protokoll erfordert Gehirne von Mäusen, die fluoreszierende Proteine in einer spärlichen oder mosaischen Population von Astrozyten exprimieren. Außerhalb dieser Anforderung können Mäuse jeden Alters für dieses Protokoll verwendet werden, wobei nur geringfügige Anpassungen an .......

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Mikroskopie wurde am UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID:SCR_019060) durchgeführt, teilweise unterstützt durch Mittel aus dem NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 und dem NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt. Die Bilder und Daten in Abbildung 4 werden mit Genehmigung des Herausgebers aus einer früheren Publikation 9 nachgedruckt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
#5 forcepsRobozRS-5045
1 mL TB SyringeBecton Dickinson (BD)309623
10x TBS (tris-buffered saline)30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plateGenesee Scientific25-106MP
1x TBS100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plateGenesee Scientific25-107MP
30% Sucrose in TBS15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 miceCharles River022
Collection vial for brainsFisher Scientific03-337-20
Confocal acquisition softwareOlympousFV31S-SW
Confocal microscopeOlympusFV3000RS
CoverslipsFisher Scientific12544E
CryostatThermo ScientificCryoStar NX50
Cryostat bladeThermo Scientific3052835
DAPIInvitrogenD1306
Embedding moldPolysciences18646A-1
Freezing Medium2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibodyAves LabsGFP1010
GlycerolThermo Scientific158920010
Goat anti-chicken 488InvitrogenA-11039
Goat anti-rabbit 594InvitrogenA11037
Goat SerumGibco16210064
HeparinSigma-AldrichH3149
Hydrochloric acidSigma-Aldrich258148
ImarisBitplaneN/AVersion 9.8.0
MATLABMathWorksN/A
Metal lunch tinAQUARIUSN/AFrom Amazon, "DIY Large Fun Box"
MethylbutanolSigma-Aldrich152463
Micro Dissecting ScissorsRobozRS-5921
Mouting medium20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
NailpolishVWR100491-940
N-propyl gallateSigma-Aldrich02370-100G
O.C.T.Fisher Scientific23-730-571
OilOlympusIMMOIL-F30CCSpecific to microscope/objective
Operating Scissors 6"RobozRS-6820
Orbital platform shakerFisher Scientific88861043Minimum speed needed: 25 rpm
PaintbrushBogrinuoN/AFrom Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes"
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Pasteur pipet (5.75")VWR14672-608
Pasteur pipet (9")VWR14672-380
Potassium chlorideSigma-AldrichP9541-500G
Razor bladeFisher Scientific12-640
RFP antibodyRockland600-401-379
Sectioning medium1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
SlidesVWR48311-703
Sodium chrloideFisher ScientificBP358-212
Sodium hydroxideSigma-AldrichS5881
SucroseSigma-AldrichS0389
TBST (TBS + Triton X-100)0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer PipetVWR414004-002
Tri-bromoethanolSigma-AldrichT48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneThermo Scientific424570025
Triton X-100Sigma-Aldrich93443
Triton X-100 (high-quality)Fisher Scientific50-489-120
XTSpotsConvexHullN/AN/Acustom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBSxx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparinadd xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium

Referenzen

  1. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  2. Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how.

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NeuroscienceAusgabe 182

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