Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Kachelung in dicken frei schwebenden Gewebeabschnitten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum Schneiden, Färben und Abbilden von frei schwebenden Gewebeabschnitten des Mäusegehirns, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung der Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Überlappung oder Kachelung des Astrozytenterritoriums.

Zusammenfassung

Astrozyten besitzen einen erstaunlichen Grad an morphologischer Komplexität, der es ihnen ermöglicht, mit fast jeder Art von Zelle und Struktur im Gehirn zu interagieren. Durch diese Wechselwirkungen regulieren Astrozyten aktiv viele kritische Gehirnfunktionen, einschließlich Synapsenbildung, Neurotransmission und Ionenhomöostase. Im Nagetiergehirn wachsen Astrozyten in den ersten drei postnatalen Wochen an Größe und Komplexität und bilden verschiedene, nicht überlappende Gebiete, um das Gehirn zu kacheln. Dieses Protokoll bietet eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung unter Verwendung von frei schwebenden Gewebeschnitten aus dem Mäusegehirn. Zunächst beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur Gewebeentnahme, Kryosektion und Immunfärbung von frei schwebenden Gewebeschnitten. Zweitens beschreibt dieses Protokoll die Bildaufnahme und Analyse des Astrozytengebietsvolumens und des Gebietsüberlappungsvolumens unter Verwendung kommerziell verfügbarer Bildanalysesoftware. Schließlich diskutiert dieses Manuskript die Vorteile, wichtige Überlegungen, häufige Fallstricke und Einschränkungen dieser Methoden. Dieses Protokoll erfordert Hirngewebe mit spärlicher oder mosaikfluoreszierender Markierung von Astrozyten und ist für die Verwendung mit gängigen Laborgeräten, konfokaler Mikroskopie und kommerziell erhältlicher Bildanalysesoftware konzipiert.

Einleitung

Astrozyten sind aufwendig verzweigte Zellen, die viele wichtige Funktionen im Gehirn erfüllen¹. In der Mausrinde entstehen radiale Gliastammzellen Astrozyten während der späten embryonalen und frühen postnatalen Stadien². Während der ersten drei postnatalen Wochen wachsen Astrozyten an Größe und Komplexität und entwickeln Tausende von feinen Zweigen, die direkt mit Synapsen interagieren¹. Gleichzeitig interagieren Astrozyten mit benachbarten Astrozyten, um diskrete, nicht überlappende Territorien zu schaffen, um das Gehirn zu kacheln³, während die Kommunikation über Gap-Junction-Kanäle^{4 aufrechterhalten wird}. Astrozytenmorphologie und -organisation sind in vielen Krankheitszuständen nach Beleidigung oder Verletzung^{gestört 5}, was auf die Bedeutung dieser Prozesse für die ordnungsgemäße Gehirnfunktion hinweist. Die Analyse der morphologischen Eigenschaften von Astrozyten während normaler Entwicklung, Alterung und Krankheit kann wertvolle Einblicke in die Biologie und Physiologie der Astrozyten liefern. Darüber hinaus ist die Analyse der Astrozytenmorphologie nach genetischer Manipulation ein wertvolles Werkzeug, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu erkennen, die die Etablierung und Aufrechterhaltung der morphologischen Komplexität der Astrozyten steuern.

Die Analyse der Astrozytenmorphologie im Gehirn der Maus wird sowohl durch die Komplexität der Astrozytenverzweigung als auch durch die Astrozytenkachelung erschwert. Die Antikörperfärbung unter Verwendung des intermediären Filament-Glia-Fibrillensäureproteins (GFAP) als astrozytenspezifischer Marker erfasst nur die Hauptzweige und unterschätzt die morphologische Komplexität der Astrozyten^{erheblich 1}. Andere zellspezifische Marker wie Glutamattransporter 1 (GLT-1; slc1a2), Glutaminsynthetase oder S100β ermöglichen eine bessere Markierung von Astrozytenzweigen⁶, führen jedoch zu einem neuen Problem. Astrozyten-Territorien sind weitgehend nicht überlappend, aber ein kleiner Grad an Überlappung existiert an den peripheren Kanten. Aufgrund der Komplexität der Verzweigung, wenn benachbarte Astrozyten mit der gleichen Farbe beschriftet werden, ist es unmöglich zu unterscheiden, wo ein Astrozyt endet und der andere beginnt. Die spärliche oder mosaikartige Markierung von Astrozyten mit endogenen fluoreszierenden Proteinen löst beide Probleme: Der fluoreszierende Marker füllt die Zelle, um alle Zweige zu erfassen, und ermöglicht die Abbildung einzelner Astrozyten, die von ihren Nachbarn unterschieden werden können. Verschiedene Strategien wurden verwendet, um eine spärliche fluoreszierende Markierung von Astrozyten mit oder ohne genetische Manipulation zu erreichen, einschließlich viraler Injektion, Plasmidelektroporation oder transgener Mauslinien. Details zur Umsetzung dieser Strategien sind in bereits veröffentlichten Studien und Protokollen 1,7,8,9,10,11,12,13 beschrieben.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Messung des Astrozytengebietsvolumens von Mäusegehirnen mit fluoreszierender Markierung in einer spärlichen Population von Astrozyten (Abbildung 1). Da der durchschnittliche Durchmesser eines Astrozyten im Mauskortex etwa 60 μm beträgt, werden 100 μm dicke Abschnitte verwendet, um die Effizienz bei der Erfassung einzelner Astrozyten in ihrer Gesamtheit zu verbessern. Eine Immunfärbung ist nicht erforderlich, wird jedoch empfohlen, um das endogene Fluoreszenzsignal für die konfokale Bildgebung und Analyse zu verstärken. Die Immunfärbung kann auch einen besseren Nachweis von feinen Astrozytenzweigen ermöglichen und die Photobleiche von endogenen Proteinen während der Bildaufnahme reduzieren. Um das Eindringen von Antikörpern in die dicken Abschnitte zu verbessern und das Gewebevolumen vom Schneiden durch Bildgebung zu erhalten, werden frei schwebende Gewebeabschnitte verwendet. Die Analyse des Astrozytengebietsvolumens wird mit handelsüblicher Bildanalysesoftware durchgeführt. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine Methode zur Analyse von Astrozytenkacheln in Gewebeabschnitten mit Mosaikmarkierung, bei der benachbarte Astrozyten unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungen exprimieren. Dieses Protokoll wurde in mehreren neueren Studien ^1,8,9 erfolgreich verwendet^, um das Astrozytenwachstum während der normalen Gehirnentwicklung sowie die Auswirkungen der genetischen Manipulation auf die Astrozytenentwicklung zu charakterisieren.

Protokoll

Alle Mäuse wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina in Chapel Hill und der Division of Comparative Medicine (IACUC-Protokollnummer 21-116.0) verwendet. Für diese Experimente wurden Mäuse beiderlei Geschlechts am postnatalen Tag 21 (P21) verwendet. CD1-Mäuse wurden kommerziell gewonnen (Table of Materials), und MADM9 WT:WT und MADM9 WT:KO Mäuse wurden zuvor⁹ beschrieben.

HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert Gehirne mit fluoreszierender Proteinexpression in einer spärlichen Population von Astrozyten. Die Expression fluoreszierender Proteine kann genetisch, viral oder durch Elektroporation eingeführt werden. Details zu Methoden zur spärlichen Markierung von Astrozyten sind in zuvor veröffentlichten Studien und Protokollen 1,7,8,9,10,11,12,13 beschrieben.

1. Gewebeentnahme und -aufbereitung

ACHTUNG: Paraformaldehyd (PFA) ist eine gefährliche Chemikalie. Führen Sie alle Schritte mit PFA in einem chemischen Rauch durch.

1. Betäuben Sie Mäuse mit einem injizierbaren Anästhetikum (z. B. Avertin; 0,8 mg / kg) und gewährleisten Sie die Tiefe der Anästhesie mit einer Zehennot. Verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um eine intrakardiale Perfusion mit eiskalter Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) + Heparin mit einer Rate von ~ 3 ml / min durchzuführen, bis die Leber klar ist (typischerweise 3-5 min), gefolgt von eiskaltem 4% PFA bei TBS mit einer Rate von ~ 3 ml / min für 5 min.
   HINWEIS: Durchflussrate und -zeiten sind für Mäuse am postnatalen Tag 21 (P21) optimiert. Anpassungen der Durchflussrate und der Perfusionszeit können für Mäuse unterschiedlichen Alters erforderlich sein.
2. Verwenden Sie nach der Perfusion eine Operationsschere, um den Kopf zu lösen und die Haut zu entfernen, um den Schädel freizulegen. Als nächstes verwenden Sie eine Mikro-Sezierschere, um die Oberseite des Schädels zu entfernen, um das Gehirn freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette oder einen kleinen Spatel, um das Gehirn zu entfernen und es in eine Röhre mit eiskaltem 4% PFA zu übertragen und über Nacht bei 4 ° C zu inkubieren.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, einen Schlauch mit einem flachen Boden zu verwenden, z. B. eine 7-ml-Szintillationsfläschchen, damit sich das Gehirn nicht im Boden der Röhre verkeilt, was das Gewebe komprimieren und das Astrozytenvolumen verändern könnte.
3. Am nächsten Tag gießen Sie die PFA aus der Röhre aus. Fügen Sie 5 ml 1x TBS in die Röhre hinzu, um das Gehirn zu spülen und die verbleibenden PFA zu entfernen. Gießen Sie die TBS aus und wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male für insgesamt drei Spülungen.
4. Fügen Sie 4-5 ml 30% Saccharose in TBS hinzu und inkubieren Sie das Gehirn bei 4 ° C für 1-2 Tage oder bis das Gehirn auf den Boden der Röhre sinkt.
   HINWEIS: Gehirne sind bereit für das Einfrieren, sobald sie gesunken sind, können aber in Saccharoselösung bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.
5. Bereiten Sie das Gefriermedium in einem 50-ml-Rohr vor, indem Sie 15 ml 100% optimale Schnitttemperaturverbindung (OCT) mit 30 ml 30% Saccharose in TBS mischen. Mischen Sie mindestens 1 Stunde lang auf einem Nutator oder einem Orbitalschüttler, um sicherzustellen, dass die Lösung vollständig gemischt ist. Halten Sie das Rohr für eine weitere Stunde aufrecht, damit Blasen an die Oberfläche steigen können.
   HINWEIS: Das Gefriermedium kann im Voraus vorbereitet und mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
6. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um Gefriermedium zu einer quadratischen Einbettungsform hinzuzufügen (Tabelle der Materialien). Achten Sie darauf, dass keine Blasen in das Medium eingebracht werden. Für ein P21-Mausgehirn sind 3 ml ausreichend. Stellen Sie die Lautstärke nach Bedarf für verschiedene Altersgruppen ein, so dass das Gehirn vollständig untergetaucht ist.
7. Fügen Sie das Gehirn dem Medium hinzu und verwenden Sie ein Paar # 5-Pinzetten, um jeden Hirnstamm zu entfernen, der das Gehirn daran hindert, flach in der Form zu sitzen. Richten Sie die Vorderseite des Gehirns mit einer Kante der Form aus.
8. Übertragen Sie die Form auf eine flache Oberfläche, die mit Trockeneis gekühlt wird. Eine mit Trockeneis gefüllte Lunchdose aus Metall eignet sich gut für diesen Zweck. Umgeben Sie die Form mit Trockeneispellets, um ein langsames und gleichmäßiges Einfrieren zu gewährleisten.
9. Sobald das Gefriermedium vollständig weiß und fest ist, lagern Sie das Werkzeug bei -80 °C.
   HINWEIS: Gehirne können mehrere Jahre bei -80 °C gelagert werden.

2. Cyrosektion

HINWEIS: Diese Schnittmethode soll mit vielen verschiedenen kommerziell erhältlichen Kryostaten arbeiten. Mit dem hier verwendeten Kryostaten (Table of Materials) beträgt die optimale Schnitttemperatur des Probenkopfes -23 °C, mit einer Umgebungstemperatur zwischen -23 °C und -25 °C.

ACHTUNG: Die Kryostatenklinge ist extrem scharf. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Klinge manipulieren und den Kryostaten bedienen.

1. Bereiten Sie das Schnittmedium vor, indem Sie 25 ml 1x TBS und 25 ml Glycerin in einem 50 ml Schlauch mischen. Es ist am einfachsten, das Glycerin hinzuzufügen, indem Sie es direkt in das Röhrchen gießen und die Marker auf dem Röhrchen zur Messung verwenden. Schütteln / wirbeln Sie das Rohr zum Mischen. Diese Lösung kann bei Raumtemperatur mehrere Wochen gelagert werden.
2. Bereiten Sie sich darauf vor, Gewebeabschnitte zu sammeln, indem Sie 2 ml Schnittmedium pro Vertiefung zu einer 12-Well-Platte hinzufügen. Beschriften Sie die Ober- und Unterseite der Platte mit Probeninformationen. Legen Sie die Platte zusammen mit anderen Vorräten (Kryostatenklinge, Rasierklinge, Spannfutter und Pinsel) direkt in den Kryostaten und lassen Sie sie sich für ~ 5 Minuten an die Temperatur gewöhnen.
3. Bewegen Sie die Gehirne in die Kryostatenkammer und erlauben Sie ihnen, sich zusammen mit den Vorräten an die Temperatur zu gewöhnen.
4. Entfernen Sie den gefrorenen Gewebeblock aus der Form, indem Sie zwei Ecken der Form mit einer Rasierklinge schneiden und die Form vom Gewebe abziehen. Richten Sie den Block so aus, dass die Vorderseite des Gehirns nach oben zeigt.
5. Fügen Sie dem Spannfutter OCT hinzu, so dass ~ 2/3 des Futters mit OCT bedeckt ist, und legen Sie den Gewebeblock sofort auf das Futter, wobei Sie die oben beschriebene Ausrichtung beibehalten. Drücken Sie den Block nach unten in das OAT, so dass er auf der Oberfläche des Futters flach ist.
6. Sobald das OCT vollständig eingefroren ist und der Gewebeblock sicher an Ort und Stelle ist, klemmen Sie das Futter an den Probenkopf. Setzen Sie die Kryostatenklinge ein und bringen Sie die Klinge in die Nähe der Probe.
7. Schneiden Sie in Abständen von 100 μm durch das Gehirn, bis kurz bevor die interessierende Gehirnregion erreicht ist. Um die Menge an OCT zu reduzieren, die sich in den Schnittmedien auflöst, verwenden Sie eine Rasierklinge, um überschüssiges Gefriermedium von den Seiten des Gewebeblocks zu entfernen.
8. Sobald die Region von Interesse erreicht ist, beginnen Sie mit dem Sammeln von 100 μm dicken Abschnitten. Sammeln Sie Abschnitte entweder mit der Anti-Roll-Platte oder indem Sie den Kryostaten mit einer Hand langsam vorwärts bewegen, während Sie in der anderen Hand einen Pinsel verwenden, um den Abschnitt vom Block zu führen, wenn er auf die Klinge trifft. Wenn das Kryostat-Modell ein Pedal hat, verwenden Sie das Pedal, um den Kryostaten zu bewegen, so dass beide Hände verwendet werden können, um den Abschnitt vom Block zu führen.
9. Übertragen Sie die Abschnitte mit einem Pinsel oder einer Pinzette auf die 12-Well-Platte. Jeder Brunnen kann mindestens 10-12 Abschnitte aufnehmen. Beim Hinzufügen des Abschnitts zum Medium reicht es normalerweise aus, den unteren Rand des Abschnitts mit dem Schnittmedium zu berühren und den Abschnitt in das Medium schmelzen zu lassen, ohne dass die Bürste oder die Pinzette nass werden. Wenn die Bürste das Medium berührt, achten Sie darauf, es mit einem Papiertuch oder Taschentuch zu trocknen, da eine zu nasse Bürste es schwierig macht, Gewebeabschnitte zu übertragen.
10. Sichern Sie die Platte, indem Sie sie mit Folie oder Paraffinfolie umwickeln. Achten Sie darauf, es deutlich zu beschriften, und lagern Sie es dann bei -20 ° C.
    HINWEIS: Bei den meisten Färbeprotokollen können Abschnitte mindestens 1-2 Jahre lang bei -20 °C gelagert werden, ohne dass ein Signal erheblich verloren geht.

3. Immunfärbung

HINWEIS: Führen Sie alle Waschungen und Inkubationen an einem Orbitalplattformschüttler durch, der auf ca. 100 U / min eingestellt ist. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, mit Ausnahme der primären Antikörperinkubation, die bei 4 °C durchgeführt wird. Bereiten Sie die Montagemedien im Voraus vor, indem Sie die Zutaten in einem 50-ml-Rohr kombinieren und über Nacht auf einem Nutator mischen. Vor Licht schützen und bis zu 2 Monate bei 4 °C lagern. Wenn das endogene Fluoreszenzsignal für die Bildgebung und Analyse ausreicht, ohne dass eine Immunfärbung erforderlich ist, können die Schritte 3.1-3.9 übersprungen werden. Wenn Sie die Immunfärbung überspringen, führen Sie drei 10-minütige Waschungen bei TBS durch und fahren Sie mit Schritt 3.10 fort.

1. Bereiten Sie eine frische TBST-Lösung (0,2% Triton in TBS) vor, indem Sie 1 ml 10% Triton-X in ein 50-ml-Röhrchen geben und das Röhrchen auf 50 ml mit 1x TBS füllen. Bereiten Sie 2 ml Blockier- und Antikörperlösungen (10% Ziegenserum in TBST) für jedes Gehirn vor.
   HINWEIS: Für beste Ergebnisse machen Sie frische TBST für jedes neue Färbeexperiment und verwenden Sie eine hochwertige Quelle von 10% wässrigem Triton-X (Tabelle der Materialien).
2. Beschriften Sie eine 24-Well-Platte gemäß dem Schaltplan (Abbildung 1). Platzieren Sie verschiedene Stichproben in verschiedenen Zeilen und unterschiedliche Lösungen in verschiedenen Spalten. Fügen Sie den ersten drei Spalten 1 ml TBST hinzu ("Wash 1", "Wash 2" und "Wash 3"). Fügen Sie der vierten Spalte 1 ml Blockierlösung hinzu.
3. Bereiten Sie einen Glaspickel vor, indem Sie das Ende einer 5,75 in Pasteur-Pipette mit einem Bunsenbrenner in einen kleinen Haken schmelzen. Verwenden Sie diesen Pick, um Gewebeabschnitte von der 12-Well-Platte in die Wash 1-Säule der 24-Well-Platte zu übertragen.
   HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, überprüfen Sie die Abschnitte, bevor Sie mit dem Färben beginnen. Um Abschnitte zu screenen, übertragen Sie die Abschnitte nacheinander auf eine Petrischale, die mit 1x TBS gefüllt ist, und untersuchen Sie die Abschnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 5x oder 10x Objektiv, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anzahl von fluoreszierend markierten Zellen vorhanden ist. Es wird empfohlen, vier bis sechs Abschnitte pro Bohrung zu färben, obwohl bei Bedarf bis zu acht Abschnitte pro Bohrung gefärbt werden können.
4. Waschen Sie die Abschnitte für jeweils 10 Minuten in Wash 1, 2 und 3 Wells, gefolgt von der Inkubation der Abschnitte für 1 h in der Blocklösung. Verwenden Sie den Glaspickel, um die Abschnitte von einem Brunnen zum nächsten zu übertragen. Der Pick kann verwendet werden, um mehrere Gehirnabschnitte gleichzeitig zu übertragen.
5. Bereiten Sie 1 ml primäre Antikörperlösung für jede Probe vor (z. B. Rabbit RFP 1:2000 oder Chicken GFP 1:2000). Fügen Sie den Antikörper der Antikörperlösung hinzu, wirbeln Sie ihn kurz vor und zentrifugieren Sie dann für 5 Minuten bei ≥ 4.000 x g bei 4 ° C. Inkubieren Sie die Abschnitte im primären Antikörper für zwei bis drei Nächte bei 4 °C während des Schüttelns.
6. Nach der primären Antikörperinkubation aspirieren Sie die TBST vom Tag 1 aus den Waschbrunnen, fügen Sie 1 ml neue TBST zu jeder Waschmulde hinzu und bewegen Sie die Abschnitte in die erste Waschquelle. Waschen Sie die Abschnitte 3x für jeweils 10 Minuten.
   HINWEIS: Verwenden Sie für die Aspiration eine 9-in-Pasteur-Pipette, die mit einem Schlauch an einen Vakuumflakon angeschlossen ist. Hausvakuumleitungen oder eine elektrische Vakuumpumpe können als Vakuumquelle verwendet werden.
7. Während die Abschnitte gewaschen werden, bereiten Sie sekundäre Antikörperlösungen in einer Konzentration von 1:200 vor, indem Sie der Antikörperlösung Antikörper hinzufügen (z. B. Goat Anti-Rabbit 594 oder Goat Anti-Chicken 488). Kurz vorwirbeln und dann 5 Minuten bei ≥ 4.000 x g bei 4 °C drehen.
8. Inkubieren Sie Abschnitte im sekundären Antikörper für 3 h bei Raumtemperatur. Schützen Sie die Abschnitte während dieses Schritts und aller folgenden Schritte vor Licht, um das Ausbleichen der sekundären Antikörper zu mildern.
9. Nach der sekundären Antikörperinkubation aspirieren Sie die TBST vom Tag 2 aus den Waschbrunnen, fügen Sie 1 ml neue TBST zu jeder Waschmulde hinzu und bewegen Sie die Abschnitte in die erste Waschquelle. Waschen Sie die Abschnitte 3x in TBST für jeweils 10 Minuten.
10. Während der Endwäsche nehmen Sie das Montagemedium von 4 °C heraus und lassen es auf Raumtemperatur erwärmen. Eine 2:1 Mischung aus 1x TBS:dH₂O zubereiten und zu einer Petrischale geben. Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie der Oberfläche 800 μL 2:1 TBS:dH₂O hinzufügen.
    HINWEIS: Die Verwendung von nicht aushärtenden Montagemedien wird dringend empfohlen. Das Aushärten von Montagemedien kann das Volumen des Gewebes verändern, was die Analyse des Astrozytengebietsvolumens stören kann. Ein Rezept für ein einfaches und kostengünstiges selbstgebautes Befestigungsmedium finden Sie in der Materialtabelle.
11. Übertragen Sie die Abschnitte mit einem feinen Pinsel nacheinander vom Wash 3-Brunnen auf die Petrischale. Dieser Schritt entfernt Triton und hilft dabei, die Abschnitte abzuflachen. Als nächstes die Abschnitte aus der Petrischale in die Flüssigkeit auf dem Objektträger geben.
12. Verwenden Sie einen Pinsel, um die Abschnitte so anzuordnen, dass sie auf der Folie flach sind. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit aus dem Objektträger mit einer P1000-Pipette, gefolgt von einer Vakuumabsaugung.
    HINWEIS: Fügen Sie eine P200-Pipettenspitze am Ende der Pasteur-Pipette hinzu, um die Vakuumabsaugung besser kontrollieren zu können.
13. Sobald die gesamte überschüssige Flüssigkeit aus dem Objektträger entfernt wurde, verwenden Sie eine Transferpipet, um sofort einen Tropfen Montagemedium zu jedem Abschnitt hinzuzufügen, und legen Sie vorsichtig ein Deckglas über das Objektträger. Lassen Sie die Montagemedien einige Minuten lang ausbreiten, und entfernen Sie dann alle überschüssigen Montagemedien, die durch Vakuumabsaugung unter dem Deckglas hervortreten.
    HINWEIS: Lassen Sie die Abschnitte vor dem Hinzufügen des Montagemediums nicht trocknen. Wenn die Abschnitte zu trocknen beginnen, bevor Montagemedien hinzugefügt werden, kann dies das Gewebevolumen beeinträchtigen und eine genaue Datenerfassung behindern.
14. Verschließen Sie alle vier Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack. Lassen Sie die Dias 30 min bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie sie dann flach bei 4 °C. Warten Sie mindestens 2 Stunden, bevor Sie die Bildgebung oder das Bild am nächsten Tag durchführen.
    HINWEIS: Abschnitte, die mit Antikörpern gegen GFP und RFP angefärbt sind, können vor der Bildgebung bis zu 2 Wochen gelagert werden, sofern sie vollständig mit Nagellack verschlossen sind.

4. Konfokale Bildgebung

HINWEIS: Dieses Protokoll enthält allgemeine Bildaufnahmerichtlinien, die auf verschiedene konfokale Mikroskope anwendbar sind, und nicht spezifische Details für eine bestimmte konfokale und Softwareschnittstelle.

1. Verwenden Sie ein 10-faches Objektiv, um einzelne Zellen für die Bildgebung zu lokalisieren, wobei Sie die spezifische Hirnregion oder Subregion (z. B. Schicht 5 des visuellen Kortex) notieren, wie es für das Experiment relevant ist. Verwenden Sie den Fokusknopf, um festzustellen, ob der gesamte Astrozyt in dem Abschnitt enthalten ist.
2. Wechseln Sie zu einem Ölobjektiv mit höherer Vergrößerung (z. B. 40x, 60x oder 63x) und bringen Sie die Zelle in den Fokus. Während Sie durch das Okular schauen, verwenden Sie den Fokusknopf, um sich von oben nach unten in der Zelle zu bewegen.
   1. Überprüfen Sie die Zelle visuell, um sicherzustellen, dass die gesamte Zelle im Abschnitt enthalten ist. Wenn die Zelle abrupt aus dem Fokus gerät und am Rand des Schnitts abgeschnitten wird, schließen Sie diese Zelle aus und suchen Sie eine andere.
3. Passen Sie mit der zugehörigen Erfassungssoftware des konfokalen Mikroskops die Erfassungsparameter an, um ein angemessenes Signal-Rausch-Verhältnis und einen angemessenen Detaillierungsgrad zu erhalten (die Auflösung von 512 x 512 liefert genügend Details für die Gebietsanalyse und reduziert die Bildaufnahmezeit). Verwenden Sie den 2-fachen Zoom, wenn Sie ein 40-faches Objektiv verwenden, und keinen Zoom, wenn Sie ein 60-faches oder 63-faches Objektiv verwenden.
4. Legen Sie die oberen und unteren Grenzen des Z-Stacks fest. Um sicherzustellen, dass der gesamte Astrozyt eingefangen wird, sollten das erste und das letzte Bild des Z-Stacks keine fluoreszierende Markierung der Zelle enthalten. Für eine adäquate Probenahme verwenden Sie eine Schrittweite von 0,5 μm.

5. Bildanalyse

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Durchführung der Bildanalyse mit handelsüblicher Bildanalysesoftware (z. B. Imaris; siehe Materialverzeichnis). Andere Versionen dieser Software können mit geringfügigen Änderungen am Workflow verwendet werden. Dieses Protokoll erfordert auch, dass MATLAB die Convex Hull XTension-Datei (Supplemental File) ausführt.

1. Bevor Sie mit der Analyse beginnen, installieren Sie die Convex Hull XTension-Datei XTSpotsConvexHull.m , indem Sie die Datei in den Unterordner rtmatlab des XT-Ordners einfügen.
2. Verwenden Sie den Imaris File Converter, um Bilder in das '.ims'-Format zu konvertieren. Öffnen Sie eine Bilddatei in der Bildanalysesoftware und zeigen Sie das Bild im 3D-Betrachtungsmodus an, indem Sie die Schaltfläche 3D-Ansicht auswählen.
3. Überprüfen Sie vor der Analyse die Zelle, um sicherzustellen, dass sie die Einschlusskriterien erfüllt.
   1. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Zelle im Bild vorhanden ist (d. h. kein Teil der Zelle sollte aus dem Bild ausgeschnitten werden). Drehen Sie das Bild, um die vorderen und hinteren Kanten zu inspizieren.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Zelle nur einen Zellkörper hat. Klicken Sie auf die Schaltfläche Slice, ziehen Sie den Cursor auf der linken Seite des Bildschirms , um sich durch den Z-Stack zu bewegen, und überprüfen Sie, ob die markierte Zelle nur einen Zellkörper enthält.
   3. Stellen Sie sicher, dass es einen einzelnen Astrozyten gibt, der von benachbarten Astrozyten unterschieden werden kann, die mit der gleichen Farbe gekennzeichnet sind.
4. Erstellen einer Oberfläche
   1. Wenn die Schaltfläche 3D-Ansicht erneut ausgewählt ist, erstellen Sie eine neue Oberfläche, indem Sie auf das blaue Symbol Neue Flächen hinzufügen klicken.
      1. Stellen Sie auf der Registerkarte Erstellen , die unten links im Softwarefenster angezeigt wird, sicher, dass nur die Kontrollkästchen Nur eine Region von Interesse segmentieren und Objekt-Objekt-Statistik für Algorithmuseinstellungen aktiviert sind und das Kontrollkästchen Erstellung mit Datenschnittansicht starten für Erstellungseinstellungen deaktiviert ist. Klicken Sie auf den blauen Pfeil , um fortzufahren.
         HINWEIS: Eine Region von Interesse ist möglicherweise nicht erforderlich, wenn sich im Bild außerhalb der interessierenden Zelle kein zusätzliches Fluoreszenzsignal befindet. Lassen Sie in diesem Fall Segment nur eine Region von Interesse deaktiviert und fahren Sie mit Schritt 5.4.3 fort.
   2. Erzeugen Sie einen Bereich von Interesse um die Zelle, indem Sie Bemaßungen in die Felder unter Größe des Flächenerstellungswerkzeugs eingeben oder die Kanten des gelben Felds ziehen (Abbildung 2A). Klicken Sie auf den blauen Pfeil , um fortzufahren.
   3. Wählen Sie den richtigen Quellkanal aus der Dropdown-Liste für die Analyse aus (z. B. Kanal 1 oder der Kanal, der die fluoreszierende Zellfüllung enthält). Der Wert im Feld Oberflächendetails wird von der Software bestimmt und basiert auf Bildaufnahmeparametern. Stellen Sie sicher, dass dieser Wert für alle Proben im Experiment konstant bleibt. Klicken Sie auf den blauen Pfeil , um fortzufahren.
   4. Passen Sie den Schwellenwert (absolute Intensität) an, indem Sie den gelben Balken ziehen oder Werte in das Feld eingeben, so dass die graue Oberfläche so viel wie möglich vom Signal der Zelle ausfüllt, ohne die Grenze der Zelle zu überschreiten. An den Rändern der Oberfläche ist eine kleine Menge Fluoreszenzsignal sichtbar (Abbildung 2B). Klicken Sie auf den blauen Pfeil , um fortzufahren.
   5. Im letzten Bereich des Werkzeugs "Oberflächenerstellung" wird der Mindestqualitätswert festgelegt, der der standardmäßige untere Schwellenwert der Software ist. Stellen Sie in der Dropdown-Liste sicher, dass Anzahl der Voxel Img=1 ausgewählt ist. Stellen Sie sicher, dass nur der linke Netzschalter für Lower Threshold grün (aktiv) ist. Der rechte Netzschalter sollte rot (inaktiv) sein. Die Software legt den unteren Schwellenwert standardmäßig auf 10 fest. Lassen Sie dies unverändert und klicken Sie auf den grünen Pfeil, um die Generierung der Oberfläche abzuschließen.
   6. Prüfen Sie die neu erzeugte Oberfläche sorgfältig. Löschen Sie alle Oberflächenteile, die nicht Teil der Zelle sind, indem Sie sie auswählen, auf das Stift-Bearbeitungswerkzeug klicken und auf die Option Löschen klicken.
   7. Vereinheitlichen Sie die verbleibenden Oberflächenteile, indem Sie auf das Trichterfiltersymbol klicken, um alle auszuwählen, auf das Stiftsymbol Bearbeiten klicken und auf die Option Unify klicken (Abbildung 2C).
      HINWEIS: Bei einer großen Bilddatei kann die Software während der nachfolgenden Schritte dieses Protokolls gelegentlich abstürzen. Es ist eine gute Idee, die Datei an dieser Stelle zu speichern.
5. Generieren von Punkten in der Nähe der Oberfläche
   1. Klicken Sie auf das orangefarbene Symbol Neue Spots hinzufügen . Wenn Sie die neuen Spots (z. B. " Spots 1") ausgewählt haben, stellen Sie auf der Registerkarte Erstellen sicher, dass nur das Kontrollkästchen Objekt-Objekt-Statistik für Algorithmuseinstellungen aktiviert ist und das Kontrollkästchen Erstellung mit Datenschnittansicht starten für Erstellungseinstellungen deaktiviert ist. Klicken Sie auf den blauen Pfeil , um fortzufahren.
   2. Wählen Sie den richtigen Quellkanal aus der Dropdown-Liste aus (z. B. Kanal 1), und geben Sie dann einen geschätzten XY-Durchmesserwert von 0,400 μm in das Feld ein. Stellen Sie sicher, dass nur das Feld Hintergrundsubtraktion aktiviert ist. Klicken Sie auf den blauen Pfeil , um fortzufahren.
      HINWEIS: 0,400 μm sind für 1024 x 1024 oder 512 x 512 Bilder mit 63x, 60x oder 40x Objektiv geeignet. Bei anderen bildgebenden Bedingungen muss der Durchmesser anhand der bildgebenden Bedingungen bestimmt werden und während der gesamten Analyse konstant bleiben. Der entsprechende Wert erzeugt genügend Flecken, um alle positiven Signale abzudecken, fügt jedoch keine Flecken auf dem Hintergrundsignal hinzu.
   3. Das letzte Bedienfeld des Spot-Erstellungswerkzeugs legt den Mindestqualitätswert fest, der der standardmäßige untere Schwellenwert der Software ist. Stellen Sie sicher, dass dieser Wert unverändert bleibt, es sei denn, es gibt einen spürbaren Unterschied in der Platzierung / Verteilung der Spots (z. B. aufgrund einer schlechteren Qualität der Färbung). Klicken Sie auf den grünen Pfeil , um die Erstellung der Spots abzuschließen.
   4. Um die Flecken besser anzuzeigen, ändern Sie die Transparenz der Fläche, indem Sie die Fläche auswählen und auf das mehrfarbige Farbwerkzeug klicken. Wählen Sie unter Material das Material aus, das die Oberfläche transparent genug macht, um Punkte in der Zelle anzuzeigen (das vorletzte Material in der Liste) (Abbildung 2D,E).
   5. Wählen Sie die Spots erneut aus, klicken Sie auf das Filtersymbol und wählen Sie Kürzeste Entfernung zu Flächen = Flächen X, wobei "Flächen X" die zu analysierende Fläche ist (z. B. Flächen 1), aus der Dropdown-Liste. Stellen Sie sicher, dass sowohl der untere Schwellenwert als auch der obere Schwellenwert grün (aktiv) sind.
      1. Geben Sie einen Mindestabstand von -1,0 μm (Abstand der Spots von der Innenseite der Oberfläche) in das Feld Unterer Schwellenwert und einen maximalen Abstand von 0,1 μm (Abstand von außen) in das Feld Oberer Schwellenwert ein . Klicken Sie auf die Schaltfläche Auswahl zu neuen Punkten duplizieren, um die Generierung von Punkten in der Nähe der Oberfläche abzuschließen.
         HINWEIS: Die minimalen und maximalen Entfernungswerte können mit unterschiedlichen Bildaufnahmeparametern wie Ziel, Zoom und Auflösung variieren. Diese Zahlen müssen empirisch ermittelt werden. Die transparente Oberfläche hilft zu beurteilen, ob die Werte alle Punkte erfassen, die die Form der Oberfläche genau darstellen.
6. Generieren Sie einen konvexen Rumpf und sammeln Sie Gebietsmessungen
   1. Stellen Sie sicher, dass die neu erstellten Spots im oberen linken Bereich des Softwarefensters ausgewählt sind (z. B. " Spots 1 Selection ['Shortest Distance...]). Klicken Sie auf das Zahnradwerkzeugsymbol und dann auf das Convex Hull-Plugin . Klicken Sie nur einmal auf das Plugin und warten Sie, bis das MATLAB-Fenster erscheint und dann verschwindet (dies kann einige Sekunden dauern). Ein solider Rumpf wird in der 3D-Ansicht angezeigt.
   2. Wählen Sie im oberen linken Bereich Konvexe Hülle der Spots X Auswahl ['Kürzeste Entfernung...], wobei 'Spots X Selection' die neu erstellten Spots sind (z. B. Spots 1 Selection), und klicken Sie dann auf den Rumpf, um ihn auszuwählen (Abbildung 2F).
   3. Klicken Sie auf das Diagrammsymbol Statistik , wählen Sie die Registerkarte Auswahl , stellen Sie sicher, dass Bestimmte Werte aus der oberen Dropdown-Liste ausgewählt ist, und wählen Sie dann Volume aus der unteren Dropdown-Liste aus. Notieren Sie das Volumen des Rumpfes. Speichern Sie die Datei und fahren Sie mit dem nächsten Bild fort.
7. Messung des Gebietsüberlappungsvolumens für benachbarte Zellen mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen
   HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls kann verwendet werden, wenn die Proben benachbarte Astrozyten enthalten, die unterschiedliche fluoreszierende Markierungen exprimieren (z. B. Astrozyte 1 exprimiert nur GFP und Astrozyte 2 exprimiert nur RFP). Diese Markierung wurde unter Verwendung viraler oder genetischer Strategien erreicht, wie zuvor beschrieben ^9,10 (Abbildung 3A).
   1. Erzeugen Sie mit den in den Schritten 5.4-5.6 beschriebenen Schritten die Oberfläche, die Flecken in der Nähe der Oberfläche und die konvexe Hülle für jeden Astrozyten (Abbildung 3B).
   2. Wenn Konvexe Wanne der Flecken 1 Auswahl... ausgewählt ist, klicken Sie auf das Stiftsymbol Bearbeiten und klicken Sie auf Maskenauswahl. Stellen Sie im Fenster Maskenkanal sicher, dass Kanal 1 (oder der Kanal, der Astrozyten 1 darstellt) ausgewählt ist, und stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen neben dem doppelten Kanal vor dem Anwenden der Maskenoption aktiviert ist. Klicken Sie auf OK, um den Kanal Masked CH1 zu erstellen.
   3. Mit konvexem Rumpf von Spots 2 Auswahl... ausgewählt, klicken Sie auf das Stiftsymbol Bearbeiten und klicken Sie auf Maskenauswahl. Wählen Sie im Fenster Maskenkanal die Option Kanal 2 (oder den Kanal, der Astrozyten 2 darstellt) aus dem Dropdown-Menü aus und stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen neben dem doppelten Kanal vor dem Anwenden der Maskenoption aktiviert ist. Klicken Sie auf OK, um den Kanal Masked CH2 zu erstellen (Abbildung 3C).
   4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Coloc oben auf dem Bildschirm und verwenden Sie das Coloc-Tool, um einen Co-Lokalisierungskanal der beiden maskierten Kanäle zu erstellen. Stellen Sie Kanal A auf Kanal 3 - Maskierter CH1 und Kanal B auf Kanal 4 - Maskierter CH2 ein (Abbildung 3D).
   5. Ziehen Sie den gelben Histogrammbalken für beide Kanäle nach links. Verwenden Sie die Segmentansicht unten, um das Co-Lokalisierungssignal zu beobachten, das in Grau sichtbar ist. Beachten Sie, dass, da die fluoreszierenden Signale der beiden Zellen nicht wirklich kolokalisiert sind, der Schwellenwert nach links verschoben werden muss, so dass falsche Kolokalisationen an Punkten des Zell-Zell-Kontakts auftreten.
   6. Klicken Sie auf der rechten Seite auf Kolokkanal erstellen , um den Vorgang abzuschließen. Klicken Sie auf die 3D-Ansicht, um zur Standard-3D-Ansicht zurückzukehren. Ein Kanal für das Kolokalisierungsergebnis wird nun grau angezeigt und im Anzeigeanpassungsfeld angezeigt.
   7. Erstellen Sie die Oberfläche, die Punkte in der Nähe der Oberfläche und die konvexe Hülle des Kolokalisierungsergebniskanals mit den in 5.4-5.7 beschriebenen Schritten (Abbildung 3E,F).
   8. Notieren Sie sich das Volumen des konvexen Rumpfes. Dies ist das Volumen der Gebietsüberlappung. Teilen Sie diese Zahl durch das Gebietsvolumen eines der Astrozyten, um den Prozentsatz der Gebietsüberlappung zu berechnen. Wählen Sie den Kontroll- oder Wildtyp-Astrozyten, wenn einer der Astrozyten in Bezug auf den anderen genetisch manipuliert ist.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über die wichtigsten Schritte und den Workflow für dieses Protokoll. Abbildung 2 zeigt Screenshots der wichtigsten Schritte mit der Bildanalysesoftware zum Generieren einer Oberfläche, zum Generieren von Punkten in der Nähe der Oberfläche und zum Generieren einer konvexen Hülle. Abbildung 3 zeigt die Anwendung dieser Technik zur Bestimmung der Überlappung/Kachelung des Astrozyt...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung im Mauskortex und beschreibt alle wichtigen Schritte, beginnend mit der Perfusion und endend mit der Bildanalyse. Dieses Protokoll erfordert Gehirne von Mäusen, die fluoreszierende Proteine in einer spärlichen oder mosaischen Population von Astrozyten exprimieren. Außerhalb dieser Anforderung können Mäuse jeden Alters für dieses Protokoll verwendet werden, wobei nur geringfügige Anpassungen an ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Roboz	RS-5045
1 mL TB Syringe	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS (tris-buffered saline)			30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin			28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate	Genesee Scientific	25-107MP
30% Sucrose in TBS			15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS			40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin			0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice	Charles River	022
Collection vial for brains	Fisher Scientific	03-337-20
Confocal acquisition software	Olympous	FV31S-SW
Confocal microscope	Olympus	FV3000RS
Coverslips	Fisher Scientific	12544E
Cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX50
Cryostat blade	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
Embedding mold	Polysciences	18646A-1
Freezing Medium			2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody	Aves Labs	GFP1010
Glycerol	Thermo Scientific	158920010
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A-11039
Goat anti-rabbit 594	Invitrogen	A11037
Goat Serum	Gibco	16210064
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	Version 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
Metal lunch tin	AQUARIUS	N/A	From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol	Sigma-Aldrich	152463
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5921
Mouting medium			20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish	VWR	100491-940
N-propyl gallate	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC	Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6"	Roboz	RS-6820
Orbital platform shaker	Fisher Scientific	88861043	Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush	Bogrinuo	N/A	From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes"
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pasteur pipet (5.75")	VWR	14672-608
Pasteur pipet (9")	VWR	14672-380
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541-500G
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RFP antibody	Rockland	600-401-379
Sectioning medium			1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides	VWR	48311-703
Sodium chrloide	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
TBST (TBS + Triton X-100)			0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet	VWR	414004-002
Tri-bromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100 (high-quality)	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS			xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin			add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST			0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium