Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Kachelung in dicken frei schwebenden Gewebeabschnitten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum Schneiden, Färben und Abbilden von frei schwebenden Gewebeabschnitten des Mäusegehirns, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung der Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Überlappung oder Kachelung des Astrozytenterritoriums.

Zusammenfassung

Astrozyten besitzen einen erstaunlichen Grad an morphologischer Komplexität, der es ihnen ermöglicht, mit fast jeder Art von Zelle und Struktur im Gehirn zu interagieren. Durch diese Wechselwirkungen regulieren Astrozyten aktiv viele kritische Gehirnfunktionen, einschließlich Synapsenbildung, Neurotransmission und Ionenhomöostase. Im Nagetiergehirn wachsen Astrozyten in den ersten drei postnatalen Wochen an Größe und Komplexität und bilden verschiedene, nicht überlappende Gebiete, um das Gehirn zu kacheln. Dieses Protokoll bietet eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung unter Verwendung von frei schwebenden Gewebeschnitten aus dem Mäusegehirn. Zunächst beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur Gewebeentnahme, Kryosektion und Immunfärbung von frei schwebenden Gewebeschnitten. Zweitens beschreibt dieses Protokoll die Bildaufnahme und Analyse des Astrozytengebietsvolumens und des Gebietsüberlappungsvolumens unter Verwendung kommerziell verfügbarer Bildanalysesoftware. Schließlich diskutiert dieses Manuskript die Vorteile, wichtige Überlegungen, häufige Fallstricke und Einschränkungen dieser Methoden. Dieses Protokoll erfordert Hirngewebe mit spärlicher oder mosaikfluoreszierender Markierung von Astrozyten und ist für die Verwendung mit gängigen Laborgeräten, konfokaler Mikroskopie und kommerziell erhältlicher Bildanalysesoftware konzipiert.

Einleitung

Astrozyten sind aufwendig verzweigte Zellen, die viele wichtige Funktionen im Gehirn erfüllen¹. In der Mausrinde entstehen radiale Gliastammzellen Astrozyten während der späten embryonalen und frühen postnatalen Stadien². Während der ersten drei postnatalen Wochen wachsen Astrozyten an Größe und Komplexität und entwickeln Tausende von feinen Zweigen, die direkt mit Synapsen interagieren¹. Gleichzeitig interagieren Astrozyten mit benachbarten Astrozyten, um diskrete, nicht überlappende Territorien zu schaffen, um das Gehirn zu kacheln³, während die Kommunikation über

Protokoll

Alle Mäuse wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina in Chapel Hill und der Division of Comparative Medicine (IACUC-Protokollnummer 21-116.0) verwendet. Für diese Experimente wurden Mäuse beiderlei Geschlechts am postnatalen Tag 21 (P21) verwendet. CD1-Mäuse wurden kommerziell gewonnen (Table of Materials), und MADM9 WT:WT und MADM9 WT:KO Mäuse wurden zuvor⁹ beschrieben.

HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert Gehirne mit fluoreszierender Proteinexpression in einer spärlichen Population von Astrozyten. Die Expression fluoresz....

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über die wichtigsten Schritte und den Workflow für dieses Protokoll. Abbildung 2 zeigt Screenshots der wichtigsten Schritte mit der Bildanalysesoftware zum Generieren einer Oberfläche, zum Generieren von Punkten in der Nähe der Oberfläche und zum Generieren einer konvexen Hülle. Abbildung 3 zeigt die Anwendung dieser Technik zur Bestimmung der Überlappung/Kachelung des Astrozyt.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung im Mauskortex und beschreibt alle wichtigen Schritte, beginnend mit der Perfusion und endend mit der Bildanalyse. Dieses Protokoll erfordert Gehirne von Mäusen, die fluoreszierende Proteine in einer spärlichen oder mosaischen Population von Astrozyten exprimieren. Außerhalb dieser Anforderung können Mäuse jeden Alters für dieses Protokoll verwendet werden, wobei nur geringfügige Anpassungen an .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Roboz	RS-5045
1 mL TB Syringe	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS (tris-buffered saline)			30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin			28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate	Genesee Scientific	25-107MP
30% Sucrose in TBS			15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS			40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin			0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice	Charles River	022
Collection vial for brains	Fisher Scientific	03-337-20
Confocal acquisition software	Olympous	FV31S-SW
Confocal microscope	Olympus	FV3000RS
Coverslips	Fisher Scientific	12544E
Cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX50
Cryostat blade	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
Embedding mold	Polysciences	18646A-1
Freezing Medium			2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody	Aves Labs	GFP1010
Glycerol	Thermo Scientific	158920010
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A-11039
Goat anti-rabbit 594	Invitrogen	A11037
Goat Serum	Gibco	16210064
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	Version 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
Metal lunch tin	AQUARIUS	N/A	From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol	Sigma-Aldrich	152463
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5921
Mouting medium			20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish	VWR	100491-940
N-propyl gallate	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC	Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6"	Roboz	RS-6820
Orbital platform shaker	Fisher Scientific	88861043	Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush	Bogrinuo	N/A	From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes"
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pasteur pipet (5.75")	VWR	14672-608
Pasteur pipet (9")	VWR	14672-380
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541-500G
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RFP antibody	Rockland	600-401-379
Sectioning medium			1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides	VWR	48311-703
Sodium chrloide	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
TBST (TBS + Triton X-100)			0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet	VWR	414004-002
Tri-bromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100 (high-quality)	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS			xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin			add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST			0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium