Analisi del volume e della piastrellatura del territorio degli astrociti in sezioni di tessuto fluttuanti spesse

Riepilogo

Questo protocollo descrive i metodi per il sezionamento, la colorazione e l'imaging di sezioni di tessuto fluttuanti del cervello del topo, seguito da una descrizione dettagliata dell'analisi del volume del territorio degli astrociti e della sovrapposizione o della piastrellatura del territorio degli astrociti.

Abstract

Gli astrociti possiedono un sorprendente grado di complessità morfologica che consente loro di interagire con quasi ogni tipo di cellula e struttura all'interno del cervello. Attraverso queste interazioni, gli astrociti regolano attivamente molte funzioni cerebrali critiche, tra cui la formazione di sinapsi, la neurotrasmissione e l'omeostasi ionica. Nel cervello dei roditori, gli astrociti crescono in dimensioni e complessità durante le prime tre settimane postnatali e stabiliscono territori distinti e non sovrapposti per affiancare il cervello. Questo protocollo fornisce un metodo consolidato per analizzare il volume del territorio degli astrociti e la piastrellatura degli astrociti utilizzando sezioni di tessuto fluttuanti dal cervello del topo. In primo luogo, questo protocollo descrive i passaggi per la raccolta dei tessuti, la criosezione e l'immunocolorazione delle sezioni di tessuto fluttuanti. In secondo luogo, questo protocollo descrive l'acquisizione e l'analisi delle immagini del volume del territorio astrocitario e del volume di sovrapposizione del territorio, utilizzando il software di analisi delle immagini disponibile in commercio. Infine, questo manoscritto discute i vantaggi, le considerazioni importanti, le insidie comuni e i limiti di questi metodi. Questo protocollo richiede tessuto cerebrale con etichettatura fluorescente sparsa o a mosaico di astrociti ed è progettato per essere utilizzato con apparecchiature di laboratorio comuni, microscopia confocale e software di analisi delle immagini disponibile in commercio.

Introduzione

Gli astrociti sono cellule riccamente ramificate che svolgono molte funzioni importanti nel cervello¹. Nella corteccia del topo, le cellule staminali gliali radiali danno origine ad astrociti durante gli stadi embrionale tardivo e postnatale precoce². Durante le prime tre settimane postnatali, gli astrociti crescono in dimensioni e complessità, sviluppando migliaia di rami fini che interagiscono direttamente con le sinapsi¹. Allo stesso tempo, gli astrociti interagiscono con gli astrociti vicini per stabilire territori discreti e non sovrapposti per affiancare il cervello³, pur mantenendo la comunicazione attraverso i canali di giunzione^{del gap 4}. La morfologia e l'organizzazione degli astrociti sono interrotte in molti stati patologici a seguito di insulto o lesione⁵, indicando l'importanza di questi processi per una corretta funzione cerebrale. L'analisi delle proprietà morfologiche degli astrociti durante il normale sviluppo, l'invecchiamento e la malattia può fornire preziose informazioni sulla biologia e la fisiologia degli astrociti. Inoltre, l'analisi della morfologia degli astrociti a seguito di manipolazione genetica è uno strumento prezioso per discernere i meccanismi cellulari e molecolari che governano l'istituzione e il mantenimento della complessità morfologica degli astrociti.

L'analisi della morfologia degli astrociti nel cervello del topo è complicata sia dalla complessità di ramificazione degli astrociti che dalla piastrellatura degli astrociti. La colorazione anticorpale utilizzando la proteina acida fibrillare gliale a filamento intermedio (GFAP) come marcatore specifico per gli astrociti cattura solo i rami principali e sottovaluta enormemente la complessità morfologica degli astrociti¹. Altri marcatori specifici delle cellule come il trasportatore del glutammato 1 (GLT-1; slc1a2), la glutammina sintetasi o S100β fanno un lavoro migliore nell'etichettare i rami degli astrociti⁶, ma introducono un nuovo problema. I territori degli astrociti sono in gran parte non sovrapposti, ma esiste un piccolo grado di sovrapposizione ai bordi periferici. A causa della complessità della ramificazione, quando gli astrociti vicini sono etichettati dello stesso colore, è impossibile distinguere dove finisce un astrocita e inizia l'altro. L'etichettatura sparsa o a mosaico di astrociti con proteine fluorescenti endogene risolve entrambi i problemi: il marcatore fluorescente riempie la cellula per catturare tutti i rami e consente l'imaging di singoli astrociti che possono essere distinti dai loro vicini. Diverse strategie sono state utilizzate per ottenere un'etichettatura fluorescente sparsa degli astrociti, con o senza manipolazione genetica, tra cui iniezione virale, elettroporazione plasmidica o linee di topo transgenico. I dettagli sull'esecuzione di queste strategie sono descritti negli studi e nei protocolli^{precedentemente} pubblicati ^{1,7,8,9,10,11,12,13}.

Questo articolo descrive un metodo per misurare il volume del territorio degli astrociti dal cervello dei topi con etichettatura fluorescente in una popolazione sparsa di astrociti (Figura 1). Poiché il diametro medio di un astrocita nella corteccia del topo è di circa 60 μm, vengono utilizzate sezioni spesse 100 μm per migliorare l'efficienza nella cattura dei singoli astrociti nella loro interezza. L'immunocolorazione non è richiesta, ma è raccomandata per migliorare il segnale fluorescente endogeno per l'imaging e l'analisi confocale. L'immunocolorazione può anche consentire una migliore rilevazione di rami di astrociti fini e ridurre il fotosbiancamento delle proteine endogene durante l'acquisizione dell'immagine. Per migliorare la penetrazione degli anticorpi nelle sezioni spesse e per preservare il volume del tessuto dal sezionamento attraverso l'imaging, vengono utilizzate sezioni di tessuto fluttuanti. L'analisi del volume del territorio astrocitario viene eseguita utilizzando un software di analisi delle immagini disponibile in commercio. Inoltre, questo protocollo descrive un metodo per l'analisi della piastrellatura degli astrociti in sezioni di tessuto con etichettatura a mosaico, in cui gli astrociti vicini esprimono diverse etichette fluorescenti. Questo protocollo è stato utilizzato con successo in diversi studi recenti ^1,8,9 per caratterizzare la crescita degli astrociti durante il normale sviluppo del cervello, così come l'impatto della manipolazione genetica sullo sviluppo degli astrociti.

Protocollo

Tutti i topi sono stati utilizzati in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill e la Divisione di Medicina Comparata (numero di protocollo IACUC 21-116.0). Topi di entrambi i sessi al giorno postnatale 21 (P21) sono stati utilizzati per questi esperimenti. I topi CD1 sono stati ottenuti commercialmente (Tabella dei materiali) e i topi MADM9 WT: WT e MADM9 WT: KO sono stati descritti in precedenza⁹.

NOTA: Questo protocollo richiede cervelli con espressione proteica fluorescente in una popolazione sparsa di astrociti. L'espressione proteica fluorescente può essere introdotta geneticamente, viralmente o per elettroporazione. I dettagli dei metodi per etichettare scarsamente gli astrociti sono descritti in studi e protocolli precedentemente pubblicati 1,7,8,9,10,11,12,13.

1. Raccolta e preparazione dei tessuti

ATTENZIONE: La paraformaldeide (PFA) è una sostanza chimica pericolosa. Eseguire tutti i passaggi con PFA in una cappa aspirante chimica.

1. Anestetizzare i topi con un anestetico iniettabile (ad esempio, Avertin; 0,8 mg / kg) e garantire la profondità dell'anestesia con un pizzico di punta. Utilizzare una pompa peristaltica per eseguire la perfusione intracardiaca con soluzione salina tamponata Tris ghiacciata (TBS) + eparina ad una velocità di ~ 3 ml / min fino a quando il fegato è chiaro (in genere 3-5 minuti), seguito da PFA ghiacciato del 4% in TBS ad una velocità di ~ 3 ml / min per 5 minuti.
   NOTA: la portata e i tempi sono ottimizzati per i topi postnatali del giorno 21 (P21). Aggiustamenti alla portata e al tempo di perfusione possono essere necessari per topi di età diverse.
2. Dopo la perfusione, utilizzare un paio di forbici operative per staccare la testa e rimuovere la pelle per esporre il cranio. Quindi, utilizzare un paio di forbici micro-dissezionanti per rimuovere la parte superiore del cranio per esporre il cervello. Utilizzare un paio di pinze o una piccola spatola per rimuovere il cervello e trasferirlo in un tubo contenente PFA al 4% ghiacciato e incubare durante la notte a 4 °C.
   NOTA: Assicurarsi di utilizzare un tubo con un fondo piatto, come una fiala di scintillazione da 7 ml, in modo che il cervello non si incunei nella parte inferiore del tubo, che potrebbe comprimere il tessuto e alterare il volume degli astrociti.
3. Il giorno seguente, versare il PFA dal tubo. Aggiungere 5 ml di 1 TBS al tubo per risciacquare il cervello e rimuovere il PFA residuo. Versare il TBS e ripetere questo processo altre due volte per un totale di tre risciacqui.
4. Aggiungere 4-5 ml di saccarosio al 30% in TBS e incubare il cervello a 4 ° C per 1-2 giorni, o fino a quando il cervello affonda sul fondo del tubo.
   NOTA: I cervelli sono pronti per il congelamento una volta affondati, ma possono essere conservati in soluzione di saccarosio a 4 °C per diverse settimane.
5. Preparare il mezzo di congelamento in un tubo da 50 ml mescolando 15 mL di composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) al 100% con 30 mL di saccarosio al 30% in TBS. Mescolare su un nutatore o uno shaker orbitale per almeno 1 ora per assicurarsi che la soluzione sia completamente miscelata. Tenere il tubo in posizione verticale per un'ora aggiuntiva per consentire a eventuali bolle di salire in superficie.
   NOTA: Il mezzo di congelamento può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente per diverse settimane.
6. Utilizzare un pipetto sierologico per aggiungere un mezzo di congelamento a uno stampo di incorporamento quadrato (Tabella dei materiali). Fare attenzione ad evitare di introdurre bolle nel mezzo. Per un cervello di topo P21, 3 ml sono sufficienti. Regola il volume secondo necessità per le diverse età in modo che il cervello sia completamente sommerso.
7. Aggiungi il cervello al mezzo e usa un paio di pinze #5 per rimuovere qualsiasi tronco cerebrale che potrebbe impedire al cervello di sedersi piatto nello stampo. Allineare la parte anteriore del cervello con un bordo dello stampo.
8. Trasferire lo stampo su una superficie piana raffreddata con ghiaccio secco. Una scatola da pranzo in metallo piena di ghiaccio secco funziona bene per questo scopo. Circondare lo stampo con pellet di ghiaccio secco per garantire un congelamento lento e uniforme.
9. Una volta che il mezzo di congelamento è completamente bianco e solido, conservare lo stampo a -80 °C.
   NOTA: I cervelli possono essere conservati a -80 °C per diversi anni.

2. Cyrosectioning

NOTA: questo metodo di sezionamento è destinato a funzionare con molti criostati diversi disponibili in commercio. Con il criostato qui utilizzato (Tabella dei materiali), la temperatura ottimale di taglio della testa del campione è -23 °C, con una temperatura della camera ambiente compresa tra -23 °C e -25 °C.

ATTENZIONE: La lama del criostato è estremamente affilata. Prestare attenzione durante la manipolazione della lama e il funzionamento del criostato.

1. Preparare il mezzo di sezionamento mescolando 25 mL di 1x TBS e 25 mL di glicerolo in un tubo da 50 mL. È più facile aggiungere il glicerolo versandolo direttamente nel tubo e utilizzando i marcatori sul tubo per la misurazione. Agitare/vorticare il tubo per mescolare. Questa soluzione può essere conservata a temperatura ambiente per diverse settimane.
2. Prepararsi a raccogliere le sezioni di tessuto aggiungendo 2 ml di mezzo di sezionamento per pozzetto a una piastra a 12 pozzetti. Etichettare la parte superiore e inferiore della piastra con le informazioni sul campione. Posizionare la piastra, insieme ad altri alimentatori (lama criostata, lama di rasoio, mandrini e pennelli), direttamente nel criostato e consentire loro di acclimatarsi alla temperatura per ~ 5 minuti.
3. Sposta i cervelli nella camera criostatica e consenti loro di acclimatarsi alla temperatura insieme alle forniture.
4. Rimuovere il blocco di tessuto congelato dallo stampo tagliando due angoli dello stampo con una lama di rasoio e staccando lo stampo dal tessuto. Orienta il blocco in modo che la parte anteriore del cervello sia rivolta verso l'alto.
5. Aggiungere OCT al mandrino in modo tale che ~ 2/3 del mandrino sia coperto con OCT e posizionare immediatamente il blocco di tessuto sul mandrino, mantenendo l'orientamento sopra descritto. Premere il blocco verso il basso nello Strumento di personalizzazione di Office in modo che sia piatto sulla superficie del mandrino.
6. Una volta che l'OCT è completamente congelato e il blocco di tessuto è saldamente in posizione, bloccare il mandrino alla testa del campione. Inserire la lama criostata e avvicinarla al campione.
7. Tagliare attraverso il cervello a intervalli di 100 μm fino a poco prima che venga raggiunta la regione cerebrale di interesse. Per ridurre la quantità di OCT che si dissolve nel supporto di sezionamento, utilizzare una lama di rasoio per tagliare il mezzo di congelamento in eccesso dai lati del blocco di tessuto.
8. Una volta raggiunta la regione di interesse, iniziare a raccogliere sezioni spesse 100 μm. Raccogli le sezioni usando la piastra antirollio o facendo avanzare lentamente il criostato con una mano mentre usi un pennello nell'altra mano per guidare la sezione fuori dal blocco mentre incontra la lama. Se il modello di criostato ha un pedale, utilizzare il pedale per far avanzare il criostato in modo che entrambe le mani possano essere utilizzate per guidare la sezione fuori dal blocco.
9. Trasferire le sezioni sulla piastra a 12 pozzetti usando un pennello o una pinza. Ogni pozzo può contenere almeno 10-12 sezioni. Quando si aggiunge la sezione al mezzo, di solito è sufficiente toccare il bordo inferiore della sezione al mezzo di sezionamento e consentire alla sezione di fondersi nel mezzo senza bagnare la spazzola o la pinza. Se il pennello tocca il mezzo, assicurati di asciugarlo con un tovagliolo di carta o un fazzoletto, poiché una spazzola eccessivamente bagnata renderà difficile il trasferimento di sezioni di tessuto.
10. Fissare la piastra avvolgendola con un foglio o un film di paraffina. Assicurarsi di etichettarlo chiaramente, quindi conservarlo a -20 °C.
    NOTA: Per la maggior parte dei protocolli di colorazione, le sezioni possono essere conservate a -20 °C per almeno 1-2 anni senza una sostanziale perdita di segnale.

3. Immunocolorazione

NOTA: Eseguire tutti i lavaggi e le incubazioni su uno shaker a piattaforma orbitale impostato a circa 100 giri / min. Tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente, ad eccezione dell'incubazione dell'anticorpo primario, che viene eseguita a 4 °C. Preparare il supporto di montaggio in anticipo combinando gli ingredienti in un tubo da 50 ml e mescolando su un nutatore durante la notte. Proteggere dalla luce e conservare a 4 °C per un massimo di 2 mesi. Se il segnale fluorescente endogeno è sufficiente per l'imaging e l'analisi senza la necessità di immunocolorazione, i passaggi 3.1-3.9 possono essere saltati. Se si salta l'immunocolorazione, eseguire tre lavaggi di 10 minuti in TBS e procedere al passaggio 3.10.

1. Preparare una soluzione fresca di TBST (0,2% Triton in TBS) aggiungendo 1 mL di Triton-X al 10% a un tubo da 50 ml e riempiendo il tubo a 50 mL con 1x TBS. Preparare 2 mL di soluzioni bloccanti e anticorpali (10% siero di capra in TBST) per ciascun cervello.
   NOTA: per ottenere i migliori risultati, creare TBST fresco per ogni nuovo esperimento di colorazione e utilizzare una fonte di alta qualità di Triton-X acquoso al 10% (Tabella dei materiali).
2. Etichettare una piastra a 24 pozzetti secondo lo schema (Figura 1). Posizionare campioni diversi in righe diverse e soluzioni diverse in colonne diverse. Aggiungere 1 mL di TBST alle prime tre colonne ('Wash 1', 'Wash 2' e 'Wash 3'). Aggiungere 1 mL di soluzione di blocco alla quarta colonna.
3. Preparare un plettro di vetro fondendo l'estremità di un pipetto 5.75 in Pasteur in un piccolo gancio usando un bruciatore Bunsen. Utilizzare questo plettro per trasferire le sezioni di tessuto dalla piastra a 12 pozzetti nella colonna Wash 1 della piastra a 24 pozzetti.
   NOTA: per ottenere risultati ottimali, esaminare le sezioni prima di iniziare la colorazione. Per lo screening delle sezioni, trasferire le sezioni una per una in una capsula di Petri riempita con 1x TBS ed esaminare le sezioni utilizzando un microscopio fluorescente con un obiettivo 5x o 10x per garantire che sia presente un numero adeguato di cellule marcate fluorescentemente. Si consiglia di colorare da quattro a sei sezioni per pozzetto, anche se fino a otto per pozzetto possono essere macchiate se necessario.
4. Lavare le sezioni per 10 minuti ciascuna in Lavare 1, 2 e 3 pozzetti, quindi incubare le sezioni per 1 ora nella soluzione di blocco. Utilizzare il plettro di vetro per trasferire le sezioni da un pozzetto all'altro. Il plettro può essere utilizzato per trasferire più sezioni cerebrali contemporaneamente.
5. Preparare 1 mL di soluzione anticorpale primaria per ogni campione (ad esempio, Rabbit RFP 1:2000 o Chicken GFP 1:2000). Aggiungere l'anticorpo alla soluzione anticorpale, vortice brevemente, quindi centrifugare per 5 minuti a ≥ 4.000 x g a 4 °C. Incubare le sezioni nell'anticorpo primario per due o tre notti a 4 °C mentre si agita.
6. Dopo l'incubazione degli anticorpi primari, aspirare il TBST Day 1 dai pozzetti di lavaggio, aggiungere 1 mL di nuovo TBST a ciascun pozzetto di lavaggio e spostare le sezioni nel primo pozzetto di lavaggio. Lavare le sezioni 3 volte per 10 minuti ciascuna.
   NOTA: per l'aspirazione, utilizzare un pipetto 9 in Pasteur collegato con tubo a un pallone sottovuoto. Le linee per vuoto domestiche o una pompa per vuoto elettrica possono essere utilizzate come fonte di vuoto.
7. Mentre le sezioni vengono lavate, preparare soluzioni anticorpali secondarie ad una concentrazione di 1:200 aggiungendo anticorpi alla soluzione anticorpale (ad esempio, capra anti-coniglio 594 o capra anti-pollo 488). Vortice brevemente, quindi ruotare per 5 minuti a ≥ 4.000 x g a 4 °C.
8. Incubare sezioni in anticorpi secondari per 3 ore a temperatura ambiente. Proteggere le sezioni dalla luce durante questa fase e tutti i seguenti passaggi per mitigare lo sbiancamento degli anticorpi secondari.
9. Dopo l'incubazione degli anticorpi secondari, aspirare il TBST Day 2 dai pozzetti di lavaggio, aggiungere 1 mL di nuovo TBST a ciascun pozzetto di lavaggio e spostare le sezioni nel primo pozzetto di lavaggio. Lavare le sezioni 3x in TBST per 10 minuti ciascuna.
10. Durante il lavaggio finale, estrarre il supporto di montaggio da 4 °C e lasciarlo riscaldare a temperatura ambiente. Preparare una miscela 2:1 di 1x TBS:dH₂O e aggiungerla a una capsula di Petri. Preparare un vetrino per microscopio aggiungendo 800 μL di 2:1 TBS:dH₂O alla superficie.
    NOTA: si consiglia vivamente di utilizzare supporti di montaggio non polimerizzabili. Il mezzo di montaggio indurente può alterare il volume del tessuto che può confondere l'analisi del volume del territorio degli astrociti. Una ricetta per un supporto di montaggio fatto in casa semplice ed economico è fornita nella Tabella dei materiali.
11. Usando un pennello fine, trasferire le sezioni una alla volta dal pozzetto Wash 3 alla piastra di Petri. Questo passaggio rimuove il tritone e aiuta le sezioni ad appiattirsi. Quindi trasferire le sezioni dalla capsula di Petri nel liquido sul vetrino.
12. Utilizzare un pennello per disporre le sezioni in modo che siano piatte sulla diapositiva. Rimuovere con attenzione il liquido in eccesso dal vetrino con un pipetto P1000, seguito dall'aspirazione sottovuoto.
    NOTA: aggiungere una punta del pipetto P200 all'estremità del pipetto Pasteur per un controllo più preciso dell'aspirazione del vuoto.
13. Una volta rimosso tutto il liquido in eccesso dalla diapositiva, utilizzare un pipetto di trasferimento per aggiungere immediatamente una goccia di supporto di montaggio a ciascuna sezione e posare delicatamente una slitta sulla diapositiva. Lasciare che il supporto di montaggio si diffonda per alcuni minuti, quindi rimuovere qualsiasi supporto di montaggio in eccesso che esce da sotto il coperchio mediante aspirazione sotto vuoto.
    NOTA: non lasciare asciugare le sezioni prima di aggiungere il supporto di montaggio. Se le sezioni iniziano ad asciugarsi prima dell'aggiunta del supporto di montaggio, ciò può influire sul volume del tessuto e impedire una raccolta accurata dei dati.
14. Sigillare tutti e quattro i bordi del coperchio con smalto trasparente. Lasciare asciugare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi conservarli piatti a 4 °C. Attendere almeno 2 ore prima dell'imaging o dell'immagine il giorno seguente.
    NOTA: le sezioni macchiate con anticorpi contro GFP e RFP possono essere conservate fino a 2 settimane prima dell'imaging, a condizione che siano completamente sigillate con smalto per unghie.

4. Imaging confocale

NOTA: questo protocollo fornisce linee guida generali per l'acquisizione di immagini che sono ampiamente applicabili a diversi microscopi confocali, piuttosto che dettagli specifici per una particolare interfaccia confocale e software.

1. Utilizzare un obiettivo 10x per localizzare le singole cellule per l'imaging, prendendo nota della specifica regione o sottoregione del cervello (ad esempio, strato 5 della corteccia visiva) come è rilevante per l'esperimento. Usa la manopola di messa a fuoco per cercare di determinare se l'intero astrocita è contenuto all'interno della sezione.
2. Passare a un obiettivo olio di ingrandimento più elevato (ad esempio, 40x, 60x o 63x) e mettere a fuoco la cella. Mentre guardi attraverso l'oculare, usa la manopola di messa a fuoco per spostarti dall'alto verso il basso della cella.
   1. Ispezionare visivamente la cella per assicurarsi che l'intera cella sia contenuta all'interno della sezione. Se la cella si spegne bruscamente e viene tagliata sul bordo della sezione, escluderla e individuarne un'altra.
3. Utilizzando il software di acquisizione associato al microscopio confocale, regolare i parametri di acquisizione per ottenere un rapporto segnale-rumore appropriato e un livello di dettaglio (la risoluzione 512 x 512 fornirà dettagli sufficienti per l'analisi del territorio e ridurrà il tempo di acquisizione dell'immagine). Utilizzare lo zoom 2x se si utilizza un obiettivo 40x e nessun zoom se si utilizza un obiettivo 60x o 63x.
4. Impostate i limiti superiore e inferiore dello z-stack. Per garantire che l'intero astrocita venga catturato, la prima e l'ultima immagine dello z-stack non devono contenere alcuna etichettatura fluorescente della cellula. Per un campionamento adeguato, utilizzare una dimensione del gradino di 0,5 μm.

5. Analisi delle immagini

NOTA: questo protocollo descrive i passaggi per l'esecuzione dell'analisi delle immagini utilizzando il software di analisi delle immagini disponibile in commercio (ad esempio, Imaris; vedere Tabella dei materiali). Altre versioni di questo software possono essere utilizzate con piccole modifiche al flusso di lavoro. Questo protocollo richiede anche MATLAB per eseguire il file Convex Hull XTension (File supplementare).

1. Prima di iniziare l'analisi, installare il file Convex Hull XTension XTSpotsConvexHull.m incollando il file nella sottocartella rtmatlab della cartella XT.
2. Usa Imaris File Converter per convertire le immagini in formato '.ims'. Aprire un file di immagine nel software di analisi delle immagini e visualizzare l'immagine in modalità di visualizzazione 3D selezionando il pulsante Vista 3D .
3. Prima dell'analisi, ispezionare la cella per assicurarsi che soddisfi i criteri di inclusione.
   1. Assicurarsi che l'intera cella sia presente all'interno dell'immagine (ad esempio, nessuna parte della cella deve essere tagliata dall'immagine). Ruotare l'immagine per ispezionare i bordi anteriore e posteriore.
   2. Assicurarsi che la cellula abbia un solo corpo cellulare. Fare clic sul pulsante Slice , trascinare il cursore a sinistra dello schermo per spostarsi attraverso lo z-stack e verificare che la cella etichettata contenga un solo corpo di cella.
   3. Assicurati che ci sia un singolo astrocita che possa essere distinto da qualsiasi astrocita vicino che è etichettato con lo stesso colore.
4. Creare una superficie
   1. Con il pulsante Vista 3D nuovamente selezionato, create una nuova superficie facendo clic sull'icona blu Aggiungi nuove superfici .
      1. Nella scheda Crea visualizzata nella parte inferiore sinistra della finestra del software, assicurarsi che solo le caselle Segmenta solo un'area di interesse e Statistiche oggetto-oggetto siano selezionate per Impostazioni algoritmo e che la casella di visualizzazione Avvia creazione con filtro dei dati per Preferenze di creazione sia deselezionata. Clicca sulla freccia blu per procedere.
         NOTA: una regione di interesse potrebbe non essere necessaria se non vi è alcun segnale fluorescente aggiuntivo nell'immagine al di fuori della cella di interesse. In questo caso, lasciare deselezionata Solo una regione di interesse e procedere al passaggio 5.4.3.
   2. Create un'area di interesse attorno alla cella immettendo le quote nelle caselle in Dimensioni dello strumento Creazione superficie oppure trascinando i bordi della casella gialla (Figura 2A). Clicca sulla freccia blu per procedere.
   3. Selezionare il canale sorgente corretto dall'elenco a discesa per l'analisi (ad esempio, canale 1 o canale che contiene il riempimento della cella fluorescente). Il valore nella casella Dettagli superfici (Surfaces Detail) è determinato dal software e si basa sui parametri di acquisizione delle immagini. Assicurarsi che questo valore rimanga costante per tutti i campioni dell'esperimento. Clicca sulla freccia blu per procedere.
   4. Regolate la soglia (intensità assoluta) trascinando la barra gialla o immettendo i valori nella casella in modo che la superficie grigia riempia il più possibile il segnale della cella senza andare oltre il limite della cella. Una piccola quantità di segnale fluorescente sarà visibile ai bordi della superficie (Figura 2B). Clicca sulla freccia blu per procedere.
   5. L'ultimo pannello dello strumento Creazione superficie imposta il valore minimo di qualità, ovvero il valore di soglia inferiore predefinito del software. Nell'elenco a discesa, assicurarsi che l'opzione Numero di Voxel Img=1 sia selezionata. Verificare che solo il pulsante di accensione sinistro per Soglia inferiore sia verde (attivo); il pulsante di accensione destro dovrebbe essere rosso (inattivo). Il valore predefinito del software è 10 per la soglia inferiore. Lasciatelo invariato e fate clic sulla freccia verde per completare la generazione della superficie.
   6. Ispezionare attentamente la superficie appena generata. Eliminate tutti i pezzi di superficie che non fanno parte della cella selezionandoli, facendo clic sullo strumento Modifica matita e facendo clic sull'opzione Elimina .
   7. Unificare i pezzi di superficie rimanenti facendo clic sull'icona Filtro imbuto per selezionare tutti, facendo clic sull'icona Modifica a matita e facendo clic sull'opzione Unifica (Figura 2C).
      NOTA: con un file di immagine di grandi dimensioni, il software potrebbe occasionalmente bloccarsi durante i passaggi successivi di questo protocollo. È una buona idea salvare il file a questo punto.
5. Generare punti vicino alla superficie
   1. Fai clic sull'icona arancione Aggiungi nuovi spot . Con i nuovi Spot (ad esempio, "Spot 1") selezionati, nella scheda Crea , assicurarsi che solo la casella Statistiche oggetto-oggetto sia selezionata per Impostazioni algoritmo e che la casella di visualizzazione Inizia creazione con filtro dei dati per le preferenze di creazione sia deselezionata. Clicca sulla freccia blu per procedere.
   2. Selezionare il canale sorgente corretto dall'elenco a discesa (ad esempio, canale 1), quindi immettere un valore di diametro XY stimato di 0,400 μm nella casella. Assicurarsi che sia selezionata solo la casella Sottrazione sfondo . Clicca sulla freccia blu per procedere.
      NOTA: 0,400 μm è appropriato per immagini 1024 x 1024 o 512 x 512 utilizzando obiettivi 63x, 60x o 40x. Per altre condizioni di imaging, il diametro deve essere determinato in base alle condizioni di imaging e rimanere costante durante tutte le analisi. Il valore appropriato creerà abbastanza punti per coprire tutti i segnali positivi, ma non aggiungerà punti sul segnale di sfondo.
   3. L'ultimo pannello dello strumento Creazione spot imposta il valore minimo di qualità, che è il valore predefinito della soglia inferiore del software; assicurarsi che questo valore rimanga invariato a meno che non vi sia una notevole differenza nel posizionamento / distribuzione delle macchie (ad esempio, a causa di una colorazione di qualità inferiore). Fare clic sulla freccia verde per completare la creazione dei punti.
   4. Per visualizzare meglio le macchie, modificate la trasparenza della superficie selezionando La superficie e facendo clic sullo strumento Colore multicolore. In Materiale (Material), selezionate il materiale che rende la superficie abbastanza trasparente da visualizzare i punti in tutta la cella (il terzultimo materiale dell'elenco) (Figura 2D,E).
   5. Riselezionate le macchie, fate clic sull'icona Filtro e selezionate Distanza più breve dalle superfici Superfici=Superfici X, dove "Superfici X" è la superficie analizzata (ad esempio, Superfici 1) dall'elenco a discesa. Assicurarsi che i pulsanti di alimentazione Soglia inferiore e Soglia superiore siano verdi (attivi).
      1. Immettere una distanza minima di -1,0 μm (distanza dei punti dall'interno della superficie) nella casella Soglia inferiore e una distanza massima di 0,1 μm (distanza dall'esterno) nella casella Soglia superiore . Fate clic sul pulsante Duplica selezione per nuovi punti per completare la generazione di punti vicino alla superficie.
         NOTA: i valori di distanza minima e massima possono variare in base a diversi parametri di acquisizione delle immagini, ad esempio obiettivo, zoom e risoluzione. Questi numeri devono essere determinati empiricamente. La superficie trasparente consente di giudicare se i valori catturano tutti i punti che rappresentano accuratamente la forma della superficie.
6. Genera scafo convesso e raccogli la misurazione del territorio
   1. Assicurati che gli Spot appena creati siano selezionati nel pannello in alto a sinistra della finestra del software (ad esempio, "Selezione Spot 1 ["Distanza più breve...]"). Fare clic sull'icona Strumenti ingranaggio, quindi sul plug-in Convex Hull . Fai clic sul plugin una sola volta e attendi che venga visualizzata la finestra di MATLAB e poi scompaia (questo potrebbe richiedere diversi secondi). Uno scafo solido apparirà nella vista 3D.
   2. Nel pannello in alto a sinistra, selezionare Convex Hull of Spots X Selection ['Shortest Distance...], dove 'Spots X Selection' è lo spot appena creato (ad esempio, Spots 1 Selection), quindi fare clic sullo scafo per selezionarlo (Figura 2F).
   3. Fare clic sull'icona Statistiche grafico, scegliere la scheda Selezione, assicurarsi che Valori specifici sia selezionato dall'elenco a discesa superiore e quindi scegliere Volume dall'elenco a discesa inferiore. Registrare il volume dello scafo. Salvare il file e passare all'immagine successiva.
7. Misurazione del volume di sovrapposizione del territorio per celle vicine con etichette fluorescenti diverse
   NOTA: Questa sezione del protocollo può essere utilizzata se i campioni contengono astrociti vicini che esprimono etichette fluorescenti distinte (ad esempio, Astrocyte 1 esprime solo GFP e Astrocyte 2 esprime solo RFP). Questa etichettatura è stata ottenuta utilizzando strategie virali o genetiche come precedentemente descritto ^9,10 (Figura 3A).
   1. Utilizzando i passaggi descritti nei passaggi 5.4-5.6, creare la superficie, i punti vicini alla superficie e lo scafo convesso per ciascun astrocita (Figura 3B).
   2. Con Convex Hull of Spots 1 Selection... selezionato, fai clic sull'icona Modifica a matita e fai clic su Selezione maschera. Nella finestra Canale maschera , assicurarsi che il canale 1 (o il canale che rappresenta l'astrocita 1) sia selezionato e assicurarsi che la casella accanto al canale duplicato prima di applicare l'opzione maschera sia selezionata. Fare clic su OK per creare il canale Masked CH1.
   3. Con scafo convesso di Spots 2 Selection... selezionato, fare clic sull'icona Modifica a matita e fare clic su Selezione maschera. Nella finestra Canale maschera , selezionare Canale 2 (o il canale che rappresenta l'astrocita 2) dal menu a discesa e assicurarsi che la casella accanto al canale duplicato prima di applicare l'opzione maschera sia selezionata. Fare clic su OK per creare il canale Masked CH2 (Figura 3C).
   4. Fare clic sul pulsante Coloc nella parte superiore dello schermo e utilizzare lo strumento Coloc per creare un canale di co-localizzazione dei due canali mascherati. Impostare il canale A sul canale 3 - CH1 mascherato e il canale B sul canale 4 - CH2 mascherato (Figura 3D).
   5. Trascinate la barra gialla dell'istogramma verso sinistra per entrambi i canali. Utilizzate la vista slice riportata di seguito per osservare il segnale di co-localizzazione, che sarà visibile in grigio. Si noti che poiché i segnali fluorescenti delle due cellule non sono effettivamente co-localizzati, la soglia dovrà essere spostata a sinistra in modo che le false co-localizzazioni inizino ad apparire nei punti di contatto cellula-cellula.
   6. Fai clic su Crea canale Coloc sul lato destro per completare il processo. Fare clic sulla vista 3D per tornare alla vista 3D standard. Un canale Risultato di colocalizzazione sarà ora visibile in grigio e apparirà nella casella di regolazione del display.
   7. Create la superficie, i punti vicini alla superficie e lo scafo convesso del canale Risultato di colocalizzazione utilizzando i passaggi descritti in 5.4-5.7 (Figura 3E,F).
   8. Registrare il volume dello scafo convesso. Questo è il volume di sovrapposizione del territorio. Dividi questo numero per il volume del territorio di uno degli astrociti per calcolare la percentuale di sovrapposizione del territorio. Scegli il controllo o l'astrocita wild-type se uno degli astrociti è geneticamente manipolato rispetto all'altro.

Risultati

Nella Figura 1 viene presentata una descrizione schematica dei passaggi principali e del flusso di lavoro per questo protocollo. La Figura 2 mostra schermate dei passaggi chiave che utilizzano il software di analisi delle immagini per generare una superficie, generare punti vicino alla superficie e generare uno scafo convesso. La Figura 3 mostra l'applicazione di questa tecnica per determinare la sovrapposizione/piastrellatura del t...

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo consolidato per analizzare il volume del territorio degli astrociti e la piastrellatura degli astrociti nella corteccia del topo, dettagliando tutti i passaggi principali che iniziano con la perfusione e terminano con l'analisi delle immagini. Questo protocollo richiede cervelli di topi che esprimono proteine fluorescenti in una popolazione sparsa o mosaica di astrociti. Al di fuori di questo requisito, i topi di qualsiasi età possono essere utilizzati per questo protocollo, con solo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Roboz	RS-5045
1 mL TB Syringe	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS (tris-buffered saline)			30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin			28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate	Genesee Scientific	25-107MP
30% Sucrose in TBS			15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS			40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin			0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice	Charles River	022
Collection vial for brains	Fisher Scientific	03-337-20
Confocal acquisition software	Olympous	FV31S-SW
Confocal microscope	Olympus	FV3000RS
Coverslips	Fisher Scientific	12544E
Cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX50
Cryostat blade	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
Embedding mold	Polysciences	18646A-1
Freezing Medium			2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody	Aves Labs	GFP1010
Glycerol	Thermo Scientific	158920010
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A-11039
Goat anti-rabbit 594	Invitrogen	A11037
Goat Serum	Gibco	16210064
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	Version 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
Metal lunch tin	AQUARIUS	N/A	From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol	Sigma-Aldrich	152463
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5921
Mouting medium			20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish	VWR	100491-940
N-propyl gallate	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC	Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6"	Roboz	RS-6820
Orbital platform shaker	Fisher Scientific	88861043	Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush	Bogrinuo	N/A	From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes"
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pasteur pipet (5.75")	VWR	14672-608
Pasteur pipet (9")	VWR	14672-380
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541-500G
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RFP antibody	Rockland	600-401-379
Sectioning medium			1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides	VWR	48311-703
Sodium chrloide	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
TBST (TBS + Triton X-100)			0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet	VWR	414004-002
Tri-bromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100 (high-quality)	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS			xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin			add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST			0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium