Анализ объема территории астроцитов и укладки плитки в толстых свободно плавающих участках тканей

Резюме

Этот протокол описывает методы секционирования, окрашивания и визуализации свободно плавающих участков тканей мозга мыши с последующим подробным описанием анализа объема территории астроцитов и перекрытия территории астроцитов или облицовки.

Аннотация

Астроциты обладают поразительной степенью морфологической сложности, которая позволяет им взаимодействовать почти с каждым типом клеток и структур в мозге. Благодаря этим взаимодействиям астроциты активно регулируют многие критические функции мозга, включая образование синапсов, нейротрансмиссию и ионный гомеостаз. В мозге грызунов астроциты растут в размерах и сложности в течение первых трех послеродовых недель и создают четкие, не перекрывающиеся территории, чтобы выложить черепицу мозга. Этот протокол обеспечивает установленный метод анализа объема территории астроцитов и облицовки астроцитов с использованием свободно плавающих участков ткани из мозга мыши. Во-первых, этот протокол описывает этапы сбора тканей, криосечения и иммуноокрашения свободно плавающих участков тканей. Во-вторых, этот протокол описывает получение и анализ изображений объема территории астроцитов и объема перекрытия территории с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений. Наконец, в этой рукописи обсуждаются преимущества, важные соображения, общие подводные камни и ограничения этих методов. Этот протокол требует мозговой ткани с разреженной или мозаичной флуоресцентной маркировкой астроцитов и предназначен для использования с общим лабораторным оборудованием, конфокальной микроскопией и коммерчески доступным программным обеспечением для анализа изображений.

Введение

Астроциты представляют собой тщательно разветвленные клетки, которые выполняют многие важные функции в мозге¹. В коре головного мозга мышей радиальные глиальные стволовые клетки дают начало астроцитам во время поздней эмбриональной и ранней постнатальной стадий². В течение первых трех послеродовых недель астроциты растут в размерах и сложности, развивая тысячи тонких ветвей, которые непосредственно взаимодействуют с синапсами¹. Одновременно астроциты взаимодействуют с соседними астроцитами, чтобы установить дискретные, неперекрывающиеся территории для плитки мозга³, сохраняя при этом связь через каналы щелевого соединения⁴. Морфология и организация астроцитов нарушаются во многих болезненных состояниях после инсульта или травмы⁵, что указывает на важность этих процессов для правильной работы мозга. Анализ морфологических свойств астроцитов во время нормального развития, старения и заболевания может дать ценную информацию о биологии и физиологии астроцитов. Кроме того, анализ морфологии астроцитов после генетических манипуляций является ценным инструментом для распознавания клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют установлением и поддержанием морфологической сложности астроцитов.

Анализ морфологии астроцитов в мозге мыши осложняется как сложностью ветвления астроцитов, так и астроцитарной плиткой. Окрашивание антител с использованием промежуточной нити глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) в качестве астроцит-специфического маркера захватывает только основные ветви и значительно недооценивает морфологическую сложность астроцитов¹. Другие клеточные маркеры, такие как транспортер глутамата 1 (GLT-1; slc1a2), глютаминсинтетаза или S100β, лучше маркируют ветви астроцитов⁶, но создают новую проблему. Астроцитарные территории в значительной степени не перекрываются, но небольшая степень перекрытия существует на периферических краях. Из-за сложности ветвления, когда соседние астроциты помечены одним цветом, невозможно различить, где заканчивается один астроцит и начинается другой. Разреженная или мозаичная маркировка астроцитов эндогенными флуоресцентными белками решает обе проблемы: флуоресцентный маркер заполняет клетку, чтобы захватить все ветви и позволяет визуализировать отдельные астроциты, которые можно отличить от их соседей. Несколько различных стратегий были использованы для достижения разреженной флуоресцентной маркировки астроцитов с генетическими манипуляциями или без них, включая вирусную инъекцию, плазмидную электропорацию или трансгенные линии мыши. Подробная информация о выполнении этих стратегий описана в ранее опубликованных исследованиях и протоколах ^{1,7,8,9,10,11,12,13}.

В данной статье описан метод измерения объема территории астроцитов из мозга мыши с флуоресцентной маркировкой в разреженной популяции астроцитов (рисунок 1). Поскольку средний диаметр астроцита в коре головного мозга мыши составляет примерно 60 мкм, для повышения эффективности захвата отдельных астроцитов в их совокупности используются участки толщиной 100 мкм. Иммуноокрашивание не требуется, но рекомендуется для усиления эндогенного флуоресцентного сигнала для конфокальной визуализации и анализа. Иммуноокрашивание может также позволить лучше обнаруживать тонкие ветви астроцитов и уменьшать фотоотбеливание эндогенных белков во время получения изображения. Для улучшения проникновения антител в толстые срезы и для сохранения объема ткани от разрезания с помощью визуализации используются свободно плавающие участки тканей. Анализ объема территории астроцитов выполняется с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений. Дополнительно в этом протоколе описан метод анализа астроцитарной плитки в участках тканей с мозаичной маркировкой, где соседние астроциты экспрессируют различные флуоресцентные метки. Этот протокол был успешно использован в нескольких недавних исследованиях ^1,8,9 для характеристики роста астроцитов во время нормального развития мозга, а также влияния генетических манипуляций на развитие астроцитов.

протокол

Все мыши использовались в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл и Отделом сравнительной медицины (протокол IACUC No 21-116.0). Мыши обоих полов на 21-й послеродовой день (P21) были использованы для этих экспериментов. Мыши CD1 были получены коммерчески (Таблица материалов), а мыши MADM9 WT:WT и MADM9 WT:KO были описаны ранее⁹.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол требует мозга с флуоресцентной экспрессией белка в разреженной популяции астроцитов. Флуоресцентная экспрессия белка может быть введена генетически, вирусно или путем электропорации. Подробности способов разреженной маркировки астроцитов описаны в ранее опубликованных исследованиях и протоколах 1,7,8,9,10,11,12,13.

1. Сбор и подготовка тканей

ВНИМАНИЕ: Параформальдегид (PFA) является опасным химическим веществом. Выполните все шаги с PFA в химическом вытяжном шкафу.

1. Обезболивать мышей инъекционным анестетиком (например, Авертином; 0,8 мг/кг) и обеспечивать глубину анестезии щипцом пальца ноги. Используйте перистальтический насос для выполнения внутрисердечной перфузии ледяным трис-буферным физиологическим раствором (TBS) + гепарин со скоростью ~ 3 мл / мин до тех пор, пока печень не станет чистой (обычно 3-5 мин), с последующим ледяным холодным 4% PFA в TBS со скоростью ~ 3 мл / мин в течение 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока и время оптимизированы для мышей послеродового дня 21 (P21). Корректировка скорости потока и времени перфузии может потребоваться для мышей разного возраста.
2. После перфузии используйте пару операционных ножниц, чтобы отсоединить голову и удалить кожу, чтобы обнажить череп. Затем используйте пару микро-рассекающих ножниц, чтобы удалить верхнюю часть черепа, чтобы обнажить мозг. Используйте пару щипцов или небольшой шпатель, чтобы удалить мозг и перенести его в трубку, содержащую ледяные 4% PFA, и инкубировать в течение ночи при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте трубку с плоским дном, например, сцинтилляционный флакон объемом 7 мл, чтобы мозг не заклинивался в нижней части трубки, что могло бы сжать ткань и изменить объем астроцитов.
3. На следующий день вылейте PFA из трубки. Добавьте 5 мл 1x TBS в трубку, чтобы промыть мозг и удалить остаточный PFA. Вылейте TBS и повторите этот процесс еще два раза, в общей сложности три полоскания.
4. Добавьте 4-5 мл 30% сахарозы в TBS и инкубируйте мозг при 4 °C в течение 1-2 дней или до тех пор, пока мозг не опустится на дно трубки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мозги готовы к замораживанию после того, как они утонули, но могут храниться в растворе сахарозы при 4 °C в течение нескольких недель.
5. Готовят морозильную среду в пробирке объемом 50 мл, смешивая 15 мл 100% соединения оптимальной температуры резания (ОКТ) с 30 мл 30% сахарозы в TBS. Смешайте на нутаторе или орбитальном шейкере в течение не менее 1 ч, чтобы убедиться, что раствор полностью перемешан. Держите трубку в вертикальном положении в течение дополнительного часа, чтобы любые пузырьки поднялись на поверхность.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Морозильную среду можно приготовить заранее и хранить при комнатной температуре в течение нескольких недель.
6. Используйте серологический пипетку, чтобы добавить морозильную среду в квадратную форму для встраивания (Таблица материалов). Позаботьтесь о том, чтобы избежать введения пузырьков в среду. Для мозга мыши P21 достаточно 3 мл. Отрегулируйте громкость по мере необходимости для разных возрастов, чтобы мозг был полностью погружен в воду.
7. Добавьте мозг к среде и используйте пару щипцов No 5, чтобы удалить любой ствол мозга, который может помешать мозгу сидеть в плесени. Выровняйте переднюю часть мозга одним краем формы.
8. Переложите форму на ровную поверхность, охлажденную сухим льдом. Металлическая банка для обеда, наполненная сухим льдом, хорошо подходит для этой цели. Окружите форму гранулами сухого льда, чтобы обеспечить медленное и равномерное замораживание.
9. Как только морозильная среда станет полностью белой и твердой, храните форму при -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг может храниться при -80 °C в течение нескольких лет.

2. Киросекционирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод секционирования предназначен для работы со многими различными коммерчески доступными криостатами. С криостатом, используемым здесь (Таблица материалов), оптимальная температура резки головки образца составляет -23 ° C, с температурой окружающей среды в камере от -23 ° C до -25 ° C.

ВНИМАНИЕ: Лезвие криостата чрезвычайно острое. Соблюдайте осторожность при манипулировании лезвием и работе с криостатом.

1. Подготовьте среду для секционирования, смешав 25 мл 1x TBS и 25 мл глицерина в пробирке объемом 50 мл. Проще всего добавить глицерин, налив его непосредственно в трубку и используя маркеры на трубке для измерения. Встряхните/вихрьте трубку, чтобы перемешать. Этот раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких недель.
2. Подготовьтесь к сбору тканевых срезов, добавив 2 мл секционной среды на скважину в 12-луночную пластину. Пометьте верхнюю и нижнюю части пластины информацией о образце. Поместите пластину вместе с другими материалами (лезвие криостата, лезвие бритвы, патроны и кисти) непосредственно в криостат и дайте им акклиматизироваться к температуре в течение ~ 5 минут.
3. Переместите мозг в криостатную камеру и позвольте им акклиматизироваться к температуре вместе с припасами.
4. Удалите замороженный блок ткани из формы, срезав два угла формы лезвием бритвы и отклеив форму от ткани. Ориентируйте блок так, чтобы передняя часть мозга была обращена вверх.
5. Добавьте OCT к патрону таким образом, чтобы ~2/3 патрона было покрыто OCT, и сразу же поместите блок ткани на патрон, сохраняя ориентацию, описанную выше. Вдавите блок в центр развертывания Office так, чтобы он был плоским на поверхности патрона.
6. После того, как OCT полностью заморожен и блок тканей надежно закреплен на месте, прижмите патрон к головке образца. Вставьте лезвие криостата и поднесите лезвие близко к образцу.
7. Проходите через мозг с интервалом 100 мкм до тех пор, пока не будет достигнута интересующая область мозга. Чтобы уменьшить количество ОКТ, которое растворяется в секционной среде, используйте лезвие бритвы, чтобы обрезать лишнюю морозильную среду со стороны блока тканей.
8. Как только область будет достигнута, начните собирать участки толщиной 100 мкм. Собирайте секции, используя либо стабилизирующую пластину, либо медленно продвигая криостат одной рукой, используя кисть в другой руке, чтобы направить секцию от блока по мере его приближения к лезвию. Если модель криостата имеет педаль, то используйте педаль для продвижения криостата, чтобы обе руки могли быть использованы для направления секции от блока.
9. Переложите срезы на 12-луночную пластину с помощью кисти или щипцов. Каждая скважина может вместить не менее 10-12 секций. При добавлении секции к среде обычно достаточно прикоснуться нижним краем секции к секционной среде и позволить секции расплавиться в среде, не намочив щетку или щипцы. Если щетка касается среды, обязательно высушите ее бумажным полотенцем или салфеткой, так как чрезмерно влажная щетка затруднит перенос участков ткани.
10. Закрепите пластину, обернув ее фольгой или парафиновой пленкой. Убедитесь, что он четко обозначен, а затем храните его при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства протоколов окрашивания срезы могут храниться при температуре -20 °C в течение не менее 1-2 лет без существенной потери сигнала.

3. Иммуноокрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все промывки и инкубации на орбитальной платформе шейкера, установленной примерно на 100 оборотов в минуту. Все этапы выполняются при комнатной температуре, за исключением первичной инкубации антител, которая проводится при 4 °C. Подготовьте монтажную среду заранее, объединив ингредиенты в пробирке объемом 50 мл и перемешав на питателе в течение ночи. Защитите от света и храните при температуре 4 °C до 2 месяцев. Если эндогенный флуоресцентный сигнал достаточен для визуализации и анализа без необходимости иммуноокрашивания, этапы 3.1-3.9 можно пропустить. При пропуске иммуноокрашивания выполните три 10-минутные промывки в TBS и перейдите к шагу 3.10.

1. Приготовьте свежий раствор TBST (0,2% Triton in TBS), добавив 1 мл 10% Triton-X в пробирку объемом 50 мл и заполнив трубку до 50 мл 1x TBS. Приготовьте 2 мл блокирующих и антителовых растворов (10% козьей сыворотки в TBST) для каждого мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов делайте свежий TBST для каждого нового эксперимента по окрашиванию и используйте высококачественный источник 10% водного раствора Triton-X (Таблица материалов).
2. Маркировка 24-луночной плиты согласно схеме (рисунок 1). Размещайте разные образцы в разных рядах, а разные решения в разных столбцах. Добавьте 1 мл TBST в первые три столбца («Wash 1», «Wash 2» и «Wash 3»). Добавьте 1 мл блокирующего раствора в четвертую колонку.
3. Подготовьте стеклянную кирку, расплавив конец пипетки Пастера 5,75 в небольшой крючок с помощью горелки Бунзена. Используйте эту кирку для переноса участков ткани из 12-луночной пластины в колонну Wash 1 24-луночной пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов просеивайте секции перед началом окрашивания. Чтобы отсеять секции, перенесите секции одну за другой на чашку Петри, заполненную 1x TBS, и исследуйте секции с помощью флуоресцентного микроскопа с объективом 5x или 10x, чтобы обеспечить наличие достаточного количества флуоресцентно меченых клеток. Рекомендуется окрашивать от четырех до шести секций на лунку, хотя при необходимости может быть окрашено до восьми на лунку.
4. Промыть секции по 10 мин в промыть 1, 2 и 3 лунки, а затем инкубировать секции в течение 1 ч в блокирующем растворе. Используйте стеклянную кирку для переноса секций из одного колодца в другой. Кирка может быть использована для передачи нескольких участков мозга одновременно.
5. Приготовьте 1 мл первичного раствора антител для каждого образца (например, Rabbit RFP 1:2000 или Chicken GFP 1:2000). Добавляют антитело к раствору антитела, кратковременно вихрь, а затем центрифугируют в течение 5 мин при ≥ 4000 х г при 4 °C. Инкубируют срезы в первичных антителах в течение двух-трех ночей при 4 °C при встряхивании.
6. После первичной инкубации антител аспирируйте 1-й день TBST из промывочных колодцев, добавьте 1 мл нового TBST в каждую промывочную скважину и переместите секции в первый промывочный колодец. Промывайте секции 3x в течение 10 минут каждая.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для аспирации используйте пипетку Пастера 9, соединенную с трубкой в вакуумную колбу. В качестве источника вакуума могут использоваться домашние вакуумные линии или электрический вакуумный насос.
7. Пока срезы промывают, готовят вторичные растворы антител в концентрации 1:200, добавляя антитела к раствору антител (например, козий анти-кролик 594 или козий анти-курица 488). Вихрь ненадолго, а затем вращайтесь в течение 5 мин при ≥ 4000 х г при 4 °C.
8. Инкубировать срезы во вторичных антителах в течение 3 ч при комнатной температуре. Защитите участки от света на этом этапе и всех последующих шагах, чтобы смягчить отбеливание вторичных антител.
9. После вторичной инкубации антител аспирируйте День 2 TBST из промывочных колодцев, добавьте 1 мл нового TBST в каждую промывочную скважину и переместите секции в первый промывочный колодец. Промывайте секции 3x в TBST в течение 10 мин каждый.
10. Во время окончательной стирки выньте монтажную среду от 4 °C и дайте ей нагреться до комнатной температуры. Приготовьте смесь 2:1 из 1X TBS:dH₂O и добавьте ее в чашку Петри. Подготовьте слайд микроскопа, добавив на поверхность 800 мкл 2:1 TBS:dH₂O.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется использовать неотверждаемый монтажный носитель. Затвердевающая монтажная среда может изменить объем ткани, что может сбить с толку анализ объема территории астроцитов. Рецепт простого и недорогого самодельного монтажного носителя приведен в Таблице материалов.
11. Используя тонкую кисть, перенесите участки по одному из колодца Wash 3 в чашку Петри. Этот шаг удаляет тритон и помогает секциям выровняться. Далее переложите срезы из чашки Петри в жидкость на слайде.
12. Используйте кисть, чтобы помочь расположить секции так, чтобы они были плоскими на слайде. Аккуратно удалите лишнюю жидкость с горки с помощью пипетки P1000 с последующей вакуум-аспирацией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте наконечник пипетки P200 в конец пипетки Пастера для более точного контроля вакуум-аспирации.
13. После того, как вся лишняя жидкость будет удалена с слайда, используйте передаточный пипетку, чтобы немедленно добавить одну каплю монтажного материала в каждую секцию и аккуратно положить крышку на слайд. Дайте монтажному материалу распространиться в течение нескольких минут, а затем удалите все лишние монтажные материалы, которые выходят из-под крышки вакуум-аспирацией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания секций перед добавлением монтажного носителя. Если срезы начинают высыхать до добавления монтажной среды, это может повлиять на объем тканей и затруднить точный сбор данных.
14. Запечатайте все четыре края обшивки прозрачным лаком для ногтей. Дайте слайдам высохнуть в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем храните их при температуре 4 °C. Подождите не менее 2 часов перед визуализацией или изображением на следующий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Участки, окрашенные антителами против GFP и RFP, могут храниться до 2 недель до визуализации, при условии, что они полностью запечатаны лаком для ногтей.

4. Конфокальная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол дает общие рекомендации по получению изображений, которые широко применимы к различным конфокальным микроскопам, а не конкретные детали для конкретного конфокального и программного интерфейса.

1. Используйте 10-кратный объектив, чтобы найти отдельные клетки для визуализации, принимая во внимание конкретную область мозга или подобласти (например, слой 5 зрительной коры), как это актуально для эксперимента. Используйте ручку фокусировки, чтобы попытаться определить, содержится ли весь астроцит в секции.
2. Переключитесь на масляный объектив с более высоким увеличением (например, 40x, 60x или 63x) и поместите ячейку в фокус. Просматривая окуляр, используйте ручку фокусировки, чтобы переместиться сверху вниз ячейки.
   1. Визуально осмотрите ячейку, чтобы убедиться, что вся ячейка содержится в секции. Если ячейка резко выходит из фокуса и обрезается на краю раздела, исключите эту ячейку и найдите другую.
3. Используя связанное с конфокальным микроскопом программное обеспечение для сбора, настройте параметры захвата для получения соответствующего отношения сигнал/шум и уровня детализации (разрешение 512 x 512 обеспечит достаточную детализацию для анализа территории и сократит время получения изображения). Используйте 2-кратный зум, если используется 40-кратный объектив, и без масштабирования, если используется объектив 60x или 63x.
4. Установите верхнюю и нижнюю границы z-стека. Чтобы гарантировать, что весь астроцит захватывается, первое и последнее изображения z-стека не должны содержать флуоресцентной маркировки клетки. Для адекватного отбора проб используйте шаг размером 0,5 мкм.

5. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает этапы выполнения анализа изображений с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений (например, Imaris; см. Таблицу материалов). Другие версии этого программного обеспечения могут использоваться с незначительными изменениями в рабочем процессе. Этот протокол также требует, чтобы MATLAB запустил файл Convex Hull XTension (дополнительный файл).

1. Перед началом анализа установите файл XTSpotsConvexHull.m , вставив файл в подпапку rtmatlab папки XT.
2. Используйте конвертер файлов Imaris для преобразования изображений в формат '.ims'. Откройте файл изображения в программном обеспечении для анализа изображений и просмотрите изображение в режиме 3D-просмотра, нажав кнопку 3D View .
3. Перед анализом осмотрите ячейку, чтобы убедиться, что она соответствует критериям включения.
   1. Убедитесь, что вся ячейка присутствует в изображении (т. е. ни одна часть ячейки не должна быть вырезана из изображения). Поверните изображение, чтобы осмотреть передний и задний края.
   2. Убедитесь, что клетка имеет только одно тело клетки. Нажмите кнопку «Фрагмент», перетащите курсор в левой части экрана, чтобы переместиться по z-стеку, и убедитесь, что помеченная ячейка содержит только одно тело ячейки.
   3. Убедитесь, что есть отдельный астроцит, который можно отличить от любых соседних астроцитов, которые помечены тем же цветом.
4. Создание поверхности
   1. Снова выбрав кнопку 3D View , создайте новую поверхность, щелкнув синий значок Добавить новые поверхности .
      1. На вкладке Создание, которая отображается в левом нижнем углу окна программного обеспечения, убедитесь, что в параметрах алгоритма установлены флажки Сегментировать только область интереса и Статистика объект-объект, а в настройках создания снят флажок Начать создание в режиме среза. Нажмите на синюю стрелку, чтобы продолжить.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Интересующая область может не понадобиться, если на изображении за пределами интересующей ячейки нет дополнительного флуоресцентного сигнала. В этом случае оставьте без флажка Сегмент только интересующий регион и перейдите к шагу 5.4.3.
   2. Создайте интересующую область вокруг ячейки, введя размеры в поля в разделе «Размер » инструмента «Создание поверхности» или перетащив края желтого поля (рисунок 2A). Нажмите на синюю стрелку , чтобы продолжить.
   3. Выберите правильный исходный канал из раскрывающегося списка для анализа (например, канал 1 или канал, содержащий флуоресцентную заливку ячейки). Значение в поле Surfaces Detail определяется программным обеспечением и на основе параметров получения изображения. Убедитесь, что это значение остается постоянным для всех образцов в эксперименте. Нажмите на синюю стрелку , чтобы продолжить.
   4. Отрегулируйте пороговое значение (абсолютную интенсивность), перетащив желтую полосу или введя значения в поле, чтобы серая поверхность заполняла как можно больше сигнала ячейки, не выходя за границу ячейки. Небольшое количество флуоресцентного сигнала будет видно по краям поверхности (рисунок 2B). Нажмите на синюю стрелку , чтобы продолжить.
   5. Последняя панель инструмента Surface Creation задает минимальное значение качества, которое является значением нижнего порога программного обеспечения по умолчанию. В раскрывающемся списке убедитесь, что выбран параметр Количество вокселей Img=1. Убедитесь, что только левая кнопка питания для Нижнего порога является зеленой (активной); правая кнопка питания должна быть красного цвета (неактивна). Программное обеспечение по умолчанию устанавливает значение Lower Threshold равным 10. Оставьте это без изменений и нажмите на зеленую стрелку, чтобы завершить генерацию поверхности.
   6. Внимательно осмотрите вновь образовавшуюся поверхность. Удалите все части поверхности, которые не являются частью ячейки, выделив их, щелкнув инструмент «Редактирование карандаша» и щелкнув параметр «Удалить ».
   7. Объедините оставшиеся части поверхности, щелкнув значок воронки Filter , чтобы выбрать все, щелкнув значок редактирования карандаша и щелкнув опцию Unify (рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При большом файле изображения программное обеспечение может иногда аварийно завершать работу на последующих этапах этого протокола. На этом этапе рекомендуется сохранить файл.
5. Создание пятен вблизи поверхности
   1. Нажмите на оранжевый значок Добавить новые пятна. Выбрав новые точки (например, «Пятна 1»), на вкладке «Создать» убедитесь, что для параметров алгоритма установлен флажок «Статистика объект-объект», а в настройках «Создание» снят флажок «Начать создание с помощью режима с помощью срезов». Нажмите на синюю стрелку, чтобы продолжить.
   2. Выберите правильный исходный канал из раскрывающегося списка (например, канал 1), а затем введите в поле расчетное значение диаметра XY 0,400 мкм. Убедитесь, что выбрано только поле Вычитание фона . Нажмите на синюю стрелку , чтобы продолжить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 0,400 мкм подходит для изображений 1024 x 1024 или 512 x 512 с использованием объектива 63x, 60x или 40x. Для других условий визуализации диаметр должен определяться на основе условий визуализации и оставаться постоянным на протяжении всего анализа. Соответствующее значение создаст достаточно пятен, чтобы покрыть весь положительный сигнал, но не добавит пятен на фоновом сигнале.
   3. Последняя панель инструмента Spots Creation устанавливает минимальное значение качества, которое является значением нижнего порога программного обеспечения по умолчанию; убедитесь, что это значение остается неизменным, если нет заметной разницы в размещении/распределении пятен (например, из-за более низкого качества окрашивания). Нажмите на зеленую стрелку , чтобы завершить создание пятен.
   4. Чтобы лучше просматривать пятна, измените прозрачность поверхности, выбрав «Поверхность » и щелкнув инструмент «Многоцветный цвет ». В разделе Материал выберите материал, который делает поверхность достаточно прозрачной для просмотра пятен по всей ячейке (предпоследний материал в списке) (рисунок 2D, E).
   5. Повторно выберите точки, щелкните значок Фильтр и выберите Из раскрывающегося списка «Кратчайшее расстояние до поверхностей Surfaces= SurfaceS X», где «Поверхности X» — это анализируемая поверхность (например, Surfaces 1). Убедитесь, что кнопки питания Нижнего и Верхнего пороговых значений зеленые (активные).
      1. Введите минимальное расстояние -1,0 мкм (расстояние пятен от внутренней части поверхности) в поле Нижнее пороговое значение и максимальное расстояние 0,1 мкм (расстояние снаружи) в поле Верхнее пороговое значение . Нажмите кнопку «Дублировать выделение в новые места», чтобы завершить создание пятен близко к поверхности.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальные и максимальные значения расстояния могут варьироваться в зависимости от различных параметров получения изображения, таких как цель, масштаб и разрешение. Эти цифры должны быть определены эмпирически. Прозрачная поверхность помогает судить, охватывают ли значения все пятна, которые точно представляют форму поверхности.
6. Создание выпуклого корпуса и измерение территории
   1. Убедитесь, что вновь созданные Spots выбраны в верхней левой панели окна программного обеспечения (например, «Spots 1 Selection ['Shortest Distance...]»). Нажмите на значок шестеренки Tools , а затем на плагин Convex Hull . Нажмите на плагин только один раз и подождите, пока появится окно MATLAB, а затем исчезнет (это может занять несколько секунд). Сплошной корпус появится в 3D-виде.
   2. В левой верхней панели выберите Выпуклый корпус Spots X Selection ['Кратчайшее расстояние...], где 'Spots X Selection' - это вновь созданные пятна (например, Spots 1 Selection), а затем нажмите на корпус , чтобы выбрать его (рисунок 2F).
   3. Щелкните значок графика Статистика , перейдите на вкладку Выбор , убедитесь, что в верхнем раскрывающемся списке выбран пункт Конкретные значения , а затем выберите Том из нижнего раскрывающегося списка. Запишите объем корпуса. Сохраните файл и перейдите к следующему изображению.
7. Измерение объема перекрытия территории для соседних ячеек с различными флуоресцентными метками
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола может быть использован, если образцы содержат соседние астроциты, которые экспрессируют различные флуоресцентные метки (например, астроцит 1 экспрессирует только GFP, а астроцит 2 экспрессирует только RFP). Эта маркировка была достигнута с использованием вирусных или генетических стратегий, как^{описано} ранее ^9,10 (рисунок 3A).
   1. Используя шаги, описанные в шагах 5.4-5.6, создайте поверхность, пятна, близкие к поверхности, и выпуклую оболочку для каждого астроцита (рисунок 3B).
   2. Выбрав Выпуклый корпус пятен 1 Selection... , нажмите на значок карандаша Редактировать и нажмите на Выбор маски. В окне Канал маски убедитесь, что выбран канал 1 (или канал, представляющий астроцит 1) и убедитесь, что установлен флажок рядом с дублирующимся каналом перед применением параметра маски . Нажмите OK , чтобы создать канал Masked CH1.
   3. С выпуклым корпусом пятен 2 Выбор... выберите, нажмите на значок карандаша Редактировать и нажмите на Выбор маски. В окне Канал маски выберите Канал 2 (или канал, представляющий астроцит 2) в раскрывающемся меню и убедитесь, что установлен флажок рядом с дублирующимся каналом перед применением параметра маски . Нажмите OK , чтобы создать канал Masked CH2 (рисунок 3C).
   4. Нажмите кнопку Coloc в верхней части экрана и используйте инструмент Coloc для создания канала совместной локализации двух замаскированных каналов. Установите для параметра Канал A значение Канал 3 - Замаскированный КАНАЛ CH1 и Канал B - Канал 4 - Замаскированный КАНАЛ 2 (рисунок 3D).
   5. Перетащите желтую полосу гистограммы влево для обоих каналов. Используйте вид фрагмента ниже, чтобы наблюдать сигнал совместной локализации, который будет виден серым цветом. Обратите внимание, что, поскольку флуоресцентные сигналы двух ячеек фактически не колокализованы, порог необходимо будет переместить влево, чтобы ложные колокализации начали появляться в точках контакта клетки с клеткой.
   6. Нажмите «Построить канал Колок» справа, чтобы завершить процесс. Нажмите на 3D-вид , чтобы вернуться к стандартному 3D-виду. Канал результатов колокализации теперь будет виден серым цветом и появится в поле настройки дисплея.
   7. Создайте поверхность, пятна, близкие к поверхности, и выпуклую оболочку канала результата колокализации , используя шаги, описанные в 5.4-5.7 (рисунок 3E, F).
   8. Запишите объем выпуклого корпуса. Это объем перекрытия территории. Разделите это число на объем территории одного из астроцитов, чтобы рассчитать процент перекрытия территории. Выберите контрольный или астроцит дикого типа, если один из астроцитов генетически манипулируется по отношению к другому.

Результаты

На рисунке 1 представлен схематический обзор основных шагов и рабочего процесса для этого протокола. На рисунке 2 показаны скриншоты ключевых шагов с использованием программного обеспечения для анализа изображений для создания поверхности, создания пя...

Обсуждение

Этот протокол описывает установленный метод анализа объема территории астроцитов и мозаики астроцитов в коре мыши, подробно описывая все основные этапы, начиная с перфузии и заканчивая анализом изображений. Этот протокол требует мозга от мышей, которые экспрессируют флуоресцентные б...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Roboz	RS-5045
1 mL TB Syringe	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS (tris-buffered saline)			30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin			28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate	Genesee Scientific	25-107MP
30% Sucrose in TBS			15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS			40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin			0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice	Charles River	022
Collection vial for brains	Fisher Scientific	03-337-20
Confocal acquisition software	Olympous	FV31S-SW
Confocal microscope	Olympus	FV3000RS
Coverslips	Fisher Scientific	12544E
Cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX50
Cryostat blade	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
Embedding mold	Polysciences	18646A-1
Freezing Medium			2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody	Aves Labs	GFP1010
Glycerol	Thermo Scientific	158920010
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A-11039
Goat anti-rabbit 594	Invitrogen	A11037
Goat Serum	Gibco	16210064
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	Version 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
Metal lunch tin	AQUARIUS	N/A	From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol	Sigma-Aldrich	152463
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5921
Mouting medium			20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish	VWR	100491-940
N-propyl gallate	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC	Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6"	Roboz	RS-6820
Orbital platform shaker	Fisher Scientific	88861043	Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush	Bogrinuo	N/A	From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes"
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pasteur pipet (5.75")	VWR	14672-608
Pasteur pipet (9")	VWR	14672-380
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541-500G
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RFP antibody	Rockland	600-401-379
Sectioning medium			1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides	VWR	48311-703
Sodium chrloide	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
TBST (TBS + Triton X-100)			0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet	VWR	414004-002
Tri-bromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100 (high-quality)	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS			xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin			add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST			0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium