JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعادة تشكيل حزم الأنابيب الدقيقة في المختبر وتحديد القوى التي تمارس داخلها مباشرة باستخدام الاصطياد البصري المتزامن والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي. يسمح هذا الفحص بقياس القوى والإزاحات الناتجة عن مجموعات البروتين داخل شبكات الأنابيب الدقيقة النشطة على مستوى النانو.

Abstract

تستخدم شبكات الأنابيب الدقيقة في الخلايا لإنجاز مجموعة واسعة من المهام ، بدءا من العمل كمسارات لنقل الحويصلة إلى العمل كمصفوفات متخصصة أثناء الانقسام الفتيلي لتنظيم فصل الكروموسومات. تشمل البروتينات التي تتفاعل مع الأنابيب الدقيقة محركات مثل الكينيسين والداينين ، والتي يمكن أن تولد قوى نشطة وحركة اتجاهية ، بالإضافة إلى البروتينات غير الحركية التي تربط الخيوط في شبكات أعلى مرتبة أو تنظم ديناميكيات الخيوط. حتى الآن ، ركزت الدراسات الفيزيائية الحيوية للبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة بشكل كبير على دور البروتينات الحركية المفردة اللازمة لنقل الحويصلة ، وتم إحراز تقدم كبير في توضيح خصائص توليد القوة والتنظيم الكيميائي الميكانيكي للكينيسين والداينين. ومع ذلك ، بالنسبة للعمليات التي تعمل فيها الأنابيب الدقيقة كشحنة ومسار ، كما هو الحال أثناء انزلاق الفتيل داخل المغزل الانقسامي ، لا يفهم الكثير عن التنظيم الفيزيائي الحيوي لمجموعات البروتينات المتشابكة المعنية. هنا ، نقوم بتفصيل منهجيتنا للتحقيق المباشر في توليد القوة والاستجابة لها داخل شبكات الحد الأدنى من الأنابيب الدقيقة المتشابكة المعاد تشكيلها من الأنابيب الدقيقة المنقاة والبروتينات الانقسامية. يتم ربط أزواج الأنابيب الدقيقة بواسطة البروتينات ذات الأهمية ، ويتم تثبيت أحد الأنابيب الدقيقة إلى غطاء المجهر ، ويتم التلاعب بالأنبوب الدقيق الثاني بواسطة مصيدة بصرية. يسمح الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي المتزامن بتصور متعدد القنوات لجميع مكونات شبكة الأنابيب الدقيقة هذه حيث تنزلق الخيوط بعيدا لتوليد القوة. نوضح أيضا كيف يمكن استخدام هذه التقنيات لاستكشاف قوى الدفع التي تمارسها مجموعات kinesin-5 وكيف تنشأ قوى الكبح اللزجة بين أزواج الأنابيب الدقيقة المنزلقة المتشابكة بواسطة MAP PRC1 الانقسامي. توفر هذه المقايسات نظرة ثاقبة لآليات تجميع المغزل ووظيفته ويمكن تكييفها على نطاق أوسع لدراسة ميكانيكا شبكة الأنابيب الدقيقة الكثيفة في سياقات متنوعة ، مثل المحور العصبي والتشعبات للخلايا العصبية والخلايا الظهارية القطبية.

Introduction

تستخدم الخلايا شبكات الأنابيب الدقيقة لأداء مجموعة متنوعة من المهام الميكانيكية ، بدءا من نقل الحويصلة1،2،3 إلى فصل الكروموسومات أثناء الانقسامالفتيلي 4،5،6. العديد من البروتينات التي تتفاعل مع الأنابيب الدقيقة ، مثل البروتينات الحركية الجزيئية kinesin و dynein ، تولد قوى وتنظمها الأحمال الميكانيكية. لفهم كيفية عمل هذه الجزيئات الحرجة بشكل أفضل ، استخدم الباحثون طرقا فيزيائية حيوية أحادية الجزيء ، مثل الاصطياد البصري والفحص المجهري TIRF ، لمراقبة المعلمات الحرجة بشكل مباشر مثل معدلات الخطوات غير المحملة ، والمعالجة ، وعلاقات القوة والسرعة للبروتينات الفردية. كانت الهندسة التجريبية الأكثر استخداما هي ربط البروتينات الحركية مباشرة بخرز محاصرة تحاكي هندستها الكروية وحجمها الحويصلات التي تخضع للنقل بمحرك. العديد من kinesins ، بما في ذلك kinesin-17،8،9 ، kinesin-2 10،11،12 ، kinesin-3 13،14،15،16 kinesin-5 17،18 ، kinesin-8 19،20 ، وكذلك مجمعات dynein و dynein21,22 ، 23،24،25 ، تمت دراستها بهذه الطرق.

ومع ذلك ، في العديد من العمليات الخلوية ، تستخدم البروتينات الحركية وغير الحركية الأنابيب الدقيقة كمسار وشحن26,27. علاوة على ذلك ، في هذه السيناريوهات حيث يتم ربط خيوط الأنابيب الدقيقة في حزم ذات ترتيب أعلى ، تعمل هذه البروتينات كمجموعات بدلا من وحدات مفردة. على سبيل المثال ، داخل الخلايا الجسدية المنقسمة ، تنظم شبكات الخيوط الكثيفة نفسها لبناء جهاز المغزل الانقسامي28،29،30. شبكة الأنابيب الدقيقة المغزل بين الأقطاب ديناميكية للغاية ويتم ترتيبها إلى حد كبير مع نهايات ناقصة تشير إلى أقطاب المغزل ونهايات زائد متداخلة بالقرب من خط الاستواء المغزل. يتم ربط الخيوط داخل المغزل بواسطة البروتينات الحركية مثل kinesin-5 31،32،33 ، kinesin-12 34،35،36 ، و kinesin-1437،38،39 ، أو بواسطة البروتينات غير الحركية مثلPRC1 40،41،42،43 أو NuMA44،45 ، 46. غالبا ما تتحرك أو تتعرض لإجهاد ميكانيكي أثناء عمليات مثل التدفق القطبي أو أثناء تنسيق تمركز الكروموسوم أثناء الطور الاستوائي أو فصل الكروموسوم أثناء الطورالانفصالي 47،48،49،50،51،52. وبالتالي ، فإن سلامة جهاز المغزل على نطاق ميكرون من خلال الانقسام الميتوزي تعتمد على توازن منظم بعناية بين قوى الدفع والسحب الناتجة والمستدامة بواسطة هذه الشبكة من الخيوط المتفاعلة. ومع ذلك ، فإن الأدوات اللازمة لاستكشاف هذا التنظيم الميكانيكي وشرح كيفية عمل مجموعات البروتين بشكل منسق لتنسيق حركات الأنابيب الدقيقة وإنتاج القوى اللازمة لتجميع المغزل بشكل صحيح لم يتم تطويرها إلا مؤخرا ، ونحن بدأنا للتو في فهم القواعد الفيزيائية الحيوية التي تحدد شبكات الأنابيب الدقيقة الديناميكية.

الهدف من هذه المخطوطة هو إظهار الخطوات المطلوبة لإعادة تكوين أزواج الأنابيب الدقيقة المتشابكة في المختبر، وشل حركة هذه الحزم في غرفة الفحص المجهري التي تسمح بتصور مضان متزامن لكل من الأنابيب الدقيقة والبروتينات المتشابكة وقياس القوة النانوية، ومعالجة هذه البيانات بقوة. نحن نفصل الخطوات اللازمة لبلمرة الأنابيب الدقيقة التي تحمل علامة التألق بشكل ثابت ، وإعداد أغطية المجهر للتعلق ، وإعداد حبات البوليسترين لتجارب الاصطياد البصري ، وتجميع شبكات الخيوط المتشابكة التي تحافظ على وظائفها في الجسم الحي مع السماح بالتلاعب الفيزيائي الحيوي المباشر.

Protocol

1. إعداد الأنابيب الدقيقة

ملاحظة: عند استخدام بروتينات متشابكة تحمل علامة GFP ، أحمر (على سبيل المثال ، رودامين) وأحمر بعيد (على سبيل المثال ، HiLyte647 البيوتينيل ، يشار إليه باسم البيوتينيل الأحمر البعيد في بقية النص) يعمل وضع العلامات الفلورية العضوية للأنابيب الدقيقة بشكل جيد. يمكن تحقيق الحد الأدنى من الحديث المتبادل بين القنوات الثلاث أثناء التصوير باستخدام مرشح مضان الانعكاس الداخلي الكلي رباعي النطاق عالي الجودة (TIRF).

  1. تحضير مخزون بذور الأنابيب الدقيقة GMPCPP
    1. قم بتعليق 1 ملغ من التوبولين المجفف بالتجميد غير المسمى في 84 ميكرولتر من الثلج البارد 1x BRB80 (80 مللي متر أنابيب ، 1 مللي متر MgCl2 ، 1 مللي متر EGTA ؛ درجة الحموضة 6.8) ، مع إضافة DTT إلى تركيز نهائي قدره 1 ملي مول قبل الاستخدام مباشرة. قم بتعليق 60 ميكروغرام من التوبولين المجفف بالتجميد المسمى بالفلوروفور في 6 ميكرولتر من 1x BRB80 البارد مع 1 mM DTT. قم بتعليق 60 ميكروغرام من التوبولين المجفف بالتجميد المسمى بالبيوتين في 6 ميكرولتر من 1x BRB80 البارد مع 1 mM DTT.
    2. لتحضير مخزون بذور توبولين غير بيوتينيل يحمل علامة الرودامين بنسبة وضع العلامات 1:10 ، أضف 84 ميكرولتر من التوبولين غير المسمى ، و 6 ميكرولتر من التوبولين الموسوم بالفلوروفور ، و 10 ميكرولتر من محلول مخزون GMPCPP 10 mM إلى أنبوب 0.5 مل. تخلط جيدا عن طريق سحب بلطف والحفاظ على الثلج.
      ملاحظة: يفضل بلمرة GMPCPP لهذه المقايسات لأن الأنابيب الدقيقة أكثر استقرارا وقابلية للتلاعب المباشر بالمصيدة البصرية مما لو كانت مبلمرة باستخدام GTP أو إذا تم حذف التاكسول.
    3. لتحضير مخزون بذور التوبولين الحاصل على علامة حمراء بعيدة مع نسبة وضع العلامات الفلورية 1:10 ، أضف 80 ميكرولتر من التوبولين غير المسمى ، و 6 ميكرولتر من التوبولين المسمى بالفلوروفور ، و 4 ميكرولتر من التوبولين المسمى بالبيوتين ، و 10 ميكرولتر من محلول مخزون GMPCPP 10 mM في أنبوب 0.5 مل. تخلط جيدا عن طريق سحب بلطف والحفاظ على الثلج. احتضان مرق البذور على الجليد لمدة 5 دقائق.
    4. انقل محلول التوبولين إلى أنبوب بولي كربونات مناسب للطرد المركزي عالي السرعة. قم بالطرد المركزي لمخزون البذور عند ~ 350000 × جم لمدة 5 دقائق عند 2 درجة مئوية لمنع بلمرة الأنابيب الدقيقة واستعادة المادة الطافية للاقتباس. التركيز النهائي المقدر للتوبولين في هذه المرحلة هو ~ 50 ميكرومتر.
    5. باستخدام أنابيب PCR سعة 0.2 مل ، قم بإعداد 2 ميكرولتر من مخزون البذور وتجميد سريع مع النيتروجين السائل. يمكن تخزين القسمة في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. بلمرة الأنابيب الدقيقة
    1. تحضير 500 ميكرولتر من 1x BRB80 ووضعها على الجليد. ضع واحدة من كل من حصص بذور الرودامين الحمراء البعيدة وغير البيوتينيل على الجليد لإذابة.
    2. احتضان مخزون البذور على الجليد لمدة 5 دقائق. في نهاية فترة الحضانة ، أضف على الفور 26 ميكرولتر من 1x BRB80 إلى كل أنبوب. إذا كانت الأنابيب الدقيقة الأطول مطلوبة ، فقم بزيادة حجم BRB80 بمقدار 5-10 ميكرولتر ، بينما بالنسبة للأنابيب الدقيقة الأقصر ، قلل حجم البلمرة بمقدار 5 ميكرولتر.
    3. احتضان مخزون بذور الأنابيب الدقيقة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي. اجمع بين 298.5 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة 1x BRB80 و 1.5 ميكرولتر من محلول مخزون تاكسول 4 مللي متر لإنتاج محلول تاكسول 20 ميكرومتر. قم بإعداد 300 ميكرولتر من 1x BRB80 واحتفظ بكلا الأنبوبين في درجة حرارة الغرفة.
    4. قم بتسخين دوار مناسب عالي السرعة إلى 30 درجة مئوية. يمكن القيام بذلك في جهاز طرد مركزي فائق منضدية مضبوط على 30 درجة مئوية. أخرج الأنابيب الدقيقة من الحمام المائي واحفظها في درجة حرارة الغرفة على سطح الطاولة لمدة 10-15 دقيقة.
  3. توضيح الأنابيب الدقيقة
    1. أضف 100 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة 1x BRB80 إلى محلول نمو الأنابيب الدقيقة واخلطه عن طريق تحريك الأنبوب ~ 10 مرات أو سحب برفق. نقل محلول نمو الأنابيب الدقيقة إلى أنبوب طرد مركزي من البولي كربونات.
    2. ضع علامة على جانب واحد من أنبوب البولي كربونات ، والذي سيواجه الخارج بالنسبة لدوران جهاز الطرد المركزي. سيساعد ذلك في تحديد موقع حبيبات الأنابيب الدقيقة ، والتي ستكون بالكاد مرئية بسبب صغر حجم المادة.
    3. جهاز طرد مركزي لمحلول الأنابيب الدقيقة عند ~ 350000 × جم لمدة 10 دقائق عند 30 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، افحص الأنبوب الذي يحتوي على الأنابيب الدقيقة بحثا عن حبيبات إن أمكن. قم بإزالة جميع الميكرولترات القليلة الأخيرة من السائل بعناية ، دون إزعاج الحبيبات. إذا لم تكن الحبيبات مرئية بوضوح, استخدم العلامة التي تم وضعها كدليل لتجنب إزعاج المنطقة التي توجد بها الحبيبات.
    4. أضف على الفور 100 ميكرولتر من 1x BRB80 + 20 μM taxol إلى أنبوب الأنابيب الدقيقة. يمكن إضافة هذا مباشرة إلى الحبيبات. لا يؤثر تعطيل الحبيبات في هذه المرحلة بشكل كبير على عملية التوضيح.
    5. قم بالطرد المركزي للأنابيب الدقيقة مرة أخرى عند ~ 350000 × جم لمدة 10 دقائق ، مع الحرص على التأكد من توجيه الجزء المحدد من الأنبوب مرة أخرى إلى الخارج بالنسبة لدوران جهاز الطرد المركزي.
    6. قم بإزالة كل المحلول باستثناء بضعة ميكرولترات كما كان من قبل ، مع الحرص مرة أخرى على تجنب تعطيل حبيبات الأنابيب الدقيقة. كرر الخطوات 1.3.4.-1.3.5. ثم أعد تعليق حبيبات الأنابيب الدقيقة في 20-50 ميكرولتر من 1x BRB80 + 20 ميكرومتر تاكسول.
    7. أعد التعليق عن طريق سحب معظم حجم إعادة التعليق وإخراجه برفق مباشرة على الحبيبات ، مع تكرار 20-30x أو حتى يتم إعادة استبدال الحبيبات بالكامل. يجب أن يتم ذلك بحذر حتى لا يتم قص الأنابيب الدقيقة عن طريق السحب القوي للغاية. يمكن أن يكون قطع طرف الماصة لزيادة حجم الفتحة مفيدا أيضا في تقليل قص الأنابيب الدقيقة.
    8. قم بتخزين الأنابيب الدقيقة في درجة حرارة الغرفة عن طريق لف الأنبوب بورق القصدير لحماية الفلوروفورات من الضوء والاحتفاظ بها على سطح الطاولة. يمكن استخدام الأنابيب الدقيقة بشكل عام لمدة 2-3 أيام بعد التوضيح.
  4. تقييم الأنابيب الدقيقة من خلال الفحص المجهري
    1. قم بإعداد تخفيف 1:10 من محلول الأنابيب الدقيقة الموضح عن طريق خلط 1 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة و 9 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة 1x BRB80. قم بتصوير هذا المحلول على الفور عن طريق سحب 10 ميكرولتر على شريحة مجهر ثم وضع غطاء فوق القطرة لتشكيل القرع.
    2. تأكد من أن الأنابيب الدقيقة التي تتراوح أطوالها من 8-25 ميكرومتر بكثافة عالية (عدة مئات لكل مجال رؤية كامل في طبقات في شبكة كثيفة) مرئية عند تصورها باستخدام الفحص المجهري الفلوري وهدف 100x يركز على سطح الغطاء الملامس لتخفيف الأنابيب الدقيقة.

2. إعداد أغطية التخميل

  1. أغطية الغسيل
    1. ضع أغطية 18 مم × 18 مم في رفوف بلاستيكية غير تفاعلية ، ثم ضع كل رف في دورق سعة 100 مل. ضع غطاء غطاء واحدا لكل فتحة في الرفوف ، حيث من الضروري تنظيف جانبي أغطية الغطاء.
    2. سونيكات باستخدام سونيكاتور الحمام لمدة 5 دقائق ، باستخدام 50 مل من الحلول التالية بالترتيب المعطى لكل دورة صوتنة: (1) ماء منزوع الأيونات (مع مقاومة 18.3 MΩ-cm) ، (2) 2٪ محلول Micro-90 ، (3) ماء منزوع الأيونات ، (4) طازج 0.1 M KOH ، (5) ماء منزوع الأيونات (الشكل 1 أ). تأكد من أن أغطية الغطاء مغطاة بالكامل بالسائل. بين دورات الصوتنة ، اشطف كل رف من أغطية الأغطية في ماء منزوع الأيونات باستخدام ملاقط لغمس الرف لأعلى ولأسفل 10-20x في الماء منزوع الأيونات ، واستبدال الماء ، وتكرار عملية الشطف 2x.
    3. اشطف الأغطية 3 مرات في الماء ، ثم أعد ملء الأكواب بالإيثانول بنسبة 100٪ وأعد الرفوف إلى الكئوس. انقل الأكواب الزجاجية إلى غطاء دخان وضع مناديل مبللة كافية لإفساح المجال لجميع رفوف الغطاء. ثم ، قم بإزالة الرفوف بملاقط وضعها على مناديل المناديل.
    4. باستخدام تيار غاز النيتروجين الجاف ، قم بتفجير الإيثانول من أغطية الغطاء ورفوفها حتى يجف. تخلص من الإيثانول المتبقي من الكئوس الزجاجية وجففها بالمثل باستخدام تيار غاز النيتروجين الجاف (الشكل 1 أ).
  2. وظيفة سطح أمينوسيلان على أغطية
    1. تحضير محلول كاشف (3-Aminopropyl) tiethoxysilane (APTES) بإضافة 40 مل من الأسيتون و 400 ميكرولتر من كاشف APTES إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، وتغطيته بإحكام ، والخلط عن طريق قلب 10x.
    2. انقل رفا واحدا من أغطية الغطاء إلى دورق جاف مطابق له ، ثم اغمسه بالكامل في محلول APTES. احتضان لمدة 5 دقائق (الشكل 1 أ). انقل الرف المعالج ب APTES إلى دورق جاف جديد ، وانقل رفا جديدا إلى APTES لاحتضانه لمسافة 5 أمتار.
    3. اشطف الرف المعالج بالماء منزوع الأيونات عن طريق غمس الحامل 10-20x كما هو موضح في الخطوة 2.1.2 ، واستبدال الماء 5x. كرر حتى تتم معالجة جميع أغطية الغطاء وغسلها.
  3. Pegمن سطح أمينوسيلان
    1. قم بإعداد حلين PEG ، أحدهما ~ 100 ميكرولتر مع 25٪ w / v PEG والآخر ~ 10 ميكرولتر مع 10٪ w / v biotin-PEG ، وكلاهما معلق في 0.1 M NaHCO3 طازجا ، وهو ما يكفي لطلاء 24 غطاء غطاء. جهاز طرد مركزي لمحلول PEG بنسبة 25٪ عند 3000 × جم لمدة 20 ثانية بمجرد إضافة 0.1 M NaHCO3 لإذابة PEG بالكامل ؛ قد يظل المحلول غائما. امزج البيوتين-PEG عن طريق السحب اللطيف (الشكل 1 ب).
    2. تحضير خليط من محاليل PEG و biotin-PEG ، مع حجم 33.3 مرة من PEG إلى 1 حجم من البيوتين-PEG (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر من محلول PEG و 3 ميكرولتر من محلول البيوتين-PEG).
    3. في غطاء الدخان ، ضع عدة مناديل معقمة وخالية من النسالة. انقل رفوف الغطاء على المناديل وجففها بتيار غاز النيتروجين الجاف كما كان من قبل. على العديد من المناديل الجديدة والجافة ، ضع أغطية الأغطية المجففة بالكامل الآن مرتبة في أزواج وقم بتسمية كل منها في الزاوية اليمنى السفلية برمز غير متماثل مثل "b". ستكون هذه العلامة مقابل سطح العينة لغطاء الغطاء ولن تتداخل مع التجربة (الشكل 1 ب).
    4. اقلب غطاء غطاء واحدا في كل زوج بملاقط. على كل غطاء مقلوب ، ضع 6 ميكرولتر من خليط PEG / البيوتين-PEG وضع الغطاء الثاني في الأعلى بحيث يكون كلا الملصقين "b" متجها للخارج.
    5. قم بمحاذاة حواف الغطاء المنزلق ، وضعها في غرفة رطبة ومحكمة الإغلاق لمنع الجفاف. احتضان الأغطية في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات.
    6. بعد الحضانة ، قم بإزالة أغطية الغطاء من غرفة الرطوبة ، وافصل أزواج الغطاء بعناية ، وضعها مرة أخرى في رفوفها. اغسل كل رف في ماء منزوع الأيونات كما كان من قبل ، وقم بغمس الرفوف باستخدام ملاقط 10-20x واستبدال الماء بما مجموعه 5x.
    7. ضع جميع جوانب PEGylated من أغطية الغطاء في مواجهة نفس الاتجاه بحيث لا يواجه سطحان PEGylated coverslip بعضهما البعض. سيكون سطح PEGylated لزجا جدا حتى يجف تماما ، لذا توخ مزيدا من الحذر لمنع انزلاق الغطاء من اللمس. جفف كل رف وأغطية كما كان من قبل باستخدام تيار غاز النيتروجين الجاف (الشكل 1 ب).
    8. بمجرد أن تجف الأغطية ورفوفها بالكامل ، قم بتخزينها في مجفف فراغ لمنع تدهور طلاء السطح. تخزينها بشكل صحيح تحت فراغ ومع المجففة لمنع الرطوبة من تعطيل طلاء PEG ؛ يمكن استخدام أغطية الغطاء لمدة 1 أسبوع تقريبا.

3. تحضير الخرز المطلي بالكينيسين

  1. اختيار وإعداد بناء كينيسين الصارم
    1. التعبير عن وتنقية تركيبات kinesin الصارمة وفقا للبروتوكولات المنشورة53,54. قم بتجميد 5 ميكرولتر من محلول كينيسين 0.02 مجم / مل وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 عام.
      ملاحظة: تحتوي بروتينات كينيسين الصارمة على طفرة نقطية G234A تمنع التحلل المائي ATP. عند الاقتران مع الميكروبيدات ، تسمح التفاعلات عالية التقارب مع الأنابيب الدقيقة للخرز بالحفاظ على أحمال من 10-20 pN لعدة دقائق. كما تم استخدام إصدارات متحولة صارمة من كل من kinesin-1 homodimer K56053 الشائع الاستخدام و K439 المحسن55 بنجاح في هذه المقايسات54. يحتوي هذا البناء المحسن K439 على مجال ثنائي EB1 لتعزيز الاستقرار وعلامة C-terminal 6-His للربط المحدد بجسم مضاد 6-His ، كما هو موضح أدناه.
  2. ربط 6-جسمه المضاد بالخرز المغلف بالستربتافيدين
    1. أضف 50 ميكرولتر من حبات البوليسترين المطلية بالستربتافيدين بقطر 1 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي سعة 0.5 مل. سونيكات لمدة 30 ثانية.
    2. أضف 10 ميكرولتر من 200 mM DTT إلى 790 ميكرولتر من 1x BRB80. أضف 10 ميكرولتر من الخرز الصوتي إلى 40 ميكرولتر من هذا المخزن المؤقت 1x BRB80 + 2.5 mM DTT.
    3. الجمع بين 1 ميكرولتر من الجسم المضاد 6-HIS البيوتينيل و 49 ميكرولتر من 1x BRB80 + 2.5 mM DTT ؛ دوامة لفترة وجيزة لخلط.
    4. الجمع بين 50 ميكرولتر من خليط حبة مخففة و 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة في أنبوب جديد. ضع الأنبوب في أنبوب دوار عند 4 درجات مئوية وقم بتدويره لمدة 1 ساعة. قم بتدوير خليط الخرز لمدة 10 دقائق عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية.
    5. ماصة قبالة الطافي وإعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من محلول الكازين 2 ملغ / مل في 1x BRB80. كرر هذا الطرد المركزي وإعادة التعليق 2x.
  3. إضافة كينيسين صارم
    1. أعد تعليق الحبيبات النهائية في 100 ميكرولتر من محلول الكازين 2 مجم / مل. في أنبوب طرد مركزي سعة 0.5 مل ، ادمج 5 ميكرولتر من 0.02 مجم / مل كينيسين صارم و 5 ميكرولتر من الخرز ، واخلطه برفق عن طريق تحريك الأنبوب ~ 10x برفق.
    2. احتفظ بكل من تعليق حبة K439 G234A والخرز 6-His المتبقي على الدوار عند 4 درجات مئوية عندما لا تكون قيد الاستخدام. يجب تحضير الخرز طازجا واستخدامه في نفس اليوم للتجارب لأنها تميل إلى التكتل وفقدان النشاط بعد هذا الوقت.

4. تجميع غرفة الفحص المجهري

  1. إعداد الشرائح الزجاجية وبناء الغرفة
    1. شطف 75 مم × 25 مم مجهر الزجاج الشرائح أولا بالماء عالي النقاء ، تليها منظف الزجاج الأمونيا-د غير الخط ، ثم مرة أخرى بالماء عالي النقاء. رج العبوة لإزالة قطرات الماء الزائدة. جفف الشرائح باستخدام تيار النيتروجين حتى لا تبقى خطوط وضع الشرائح على منشفة ورقية (الشكل 2 أ).
    2. باستخدام المقص ، قم بقص الشريط على الوجهين إلى شرائح ~ 2-3 مم × 2.5 سم (شريطان لكل غرفة واحدة و 3 لكل غرفة مزدوجة).
    3. باستخدام ملقط ، ضع شريطين من الشريط على شريحة زجاجية واحدة بحيث يكون هناك ~ 0.5 سم من المساحة بينهما لبناء غرفة واحدة. بالنسبة للغرف المزدوجة ، استخدم نفس التباعد ، ولكن مع ثلاثة شرائط من الشريط (الشكل 2 ب). يبلغ حجم قناة العينة باستخدام هذه الطريقة حوالي 10 ميكرولتر.
      ملاحظة: كلما اتسعت الغرفة (الغرف) ، زاد احتمال تشكل الفقاعات عند تدفق المحاليل ؛ ومع ذلك ، قد يكون من الصعب استخدام الغرف التي يقل عرضها عن 0.5 سم بسبب انخفاض مساحة التصوير.
    4. اكشط طول كل شريط من الشريط باستخدام ملقط بحيث يتم لصق الشريط بقوة على الشريحة الزجاجية.
    5. حرر الضغط من المجفف واستخدم ملقط لإزالة غطاء بيوتينيل واحد من رف التخزين. ضع غطاء بيوتينيل واحد فوق الشريحة الزجاجية باستخدام ملقط. تأكد من أن الجانب الحيوي مواجه للداخل ، نحو الشريحة الزجاجية.
    6. باستخدام الطرف الخلفي المسطح للملقط ، اضغط برفق على الزجاج حيث يلامس الغطاء الشريط لإغلاق الغرف بإحكام. يجب استخدام ضغط خفيف لضمان عدم تصدع غطاء الغطاء (الشكل 2C).
    7. قم بتخزين غرف الفحص المجهري النهائية في حاوية محكمة الإغلاق ، بعيدا عن الضوء المباشر ، حتى الاستخدام (الشكل 2D).
      ملاحظة: يوصى باستخدام الغرف في نفس اليوم الذي صنعت فيه ، حيث تتحلل أغطية البيوتينيل عند تعرضها للهواء.
  2. تدفق الكواشف المجهرية
    1. قم ببناء غرفة رطوبة عن طريق وضع منديل مطوي خال من النسالة مبلل بماء فائق النقاء في الجزء السفلي من صندوق طرف ماصة فارغ. يجب الاحتفاظ بغرف العينة في هذا المربع بين خطوات التدفق لتقليل تبخر المحاليل من القناة.
    2. أدخل جميع الكواشف عن طريق سحب السائل في أحد طرفي القناة وفتل السائل في الطرف المقابل. للفتيل ، قم بلف أحد طرفي الأنسجة وضعه برفق على جانب الخروج من الغرفة ، مما يسمح بعمل الشعيرات الدموية لتوزيع الكاشف بشكل متجانس (الشكل 3 أ). أحضر جميع الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة قبل التدفق مباشرة لمنع إزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة.
    3. باستخدام طرف ماصة بزاوية 20 ميكرولتر بحيث يلامس جانب الدخول في غرفة واحدة ، يتدفق ببطء في 10 ميكرولتر من 0.5 مجم / مل من الستربتافيدين أو النيوترافيدين. استخدم أطراف ماصة أصغر وتدفقا بطيئا وثابتا للكواشف لتقليل احتمالية الحصول على فقاعات في الغرفة (الشكل 3 ب).
    4. احتضان الشريحة في غرفة الرطوبة لمدة 4 دقائق مع توجيه جانب انزلاق الغطاء من الغرفة لأسفل. سيسمح هذا الاتجاه للأجسام الأكبر ، مثل الأنابيب الدقيقة أو الخرز ، بالغرق بالقرب من سطح PEGylated.
    5. اغسل الحجرة باستخدام 20 ميكرولتر من 1x BRB80 ، باستخدام منديل خال من النسالة لسحب السوائل. إذا كان هناك تسرب في الغرفة ، فتجاهل الشريحة وابدأ بأخرى ؛ الفقاعات الصغيرة التي تحدث في الغرفة لن تؤثر بشكل ضار على التصوير.
    6. كرر خطوات التدفق والحضانة والتدفق باستخدام 10 ميكرولتر من محلول حجب الكازين 0.5 مجم / مل (الشكل 3C). تمييع الأنابيب الدقيقة الحمراء البعيدة البيوتينيلات ~ 1:20 وتدفق 10 ميكرولتر في الغرفة. احتضان لمدة 5 دقائق وشطف الغرفة مع 20 ميكرولتر من 1x BRB80 (الشكل 3D). يجب أن تكون الكثافة المثلى لهذه الأنابيب الدقيقة في مجال رؤية تصوير 100 ميكرومتر × 100 ميكرومتر 10-20 ؛ ويجب تعديل التخفيف في هذه المرحلة لتحقيق نسبة الارتباط السطحي هذه.
    7. كرر خطوات التدفق والحضانة والتدفق بتركيز 10 ميكرولتر من تركيز مناسب (عادة 1-10 نانومتر) محرك متشابك أو بروتين غير حركي ليتم دراسته (الشكل 3E).
    8. تدفق في 10 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة رودامين المخففة إلى تركيز مماثل للأنابيب الدقيقة الحمراء البعيدة البيوتينيلة السابقة. كرر خطوات الحضانة والتدفق (الشكل 3F).
    9. اجمع بين 1 ميكرولتر من الخرز المطلي بالكينيسين الصارم و 19 ميكرولتر من مخزن التفاعل المحسن لنشاط البروتين المتشابك. على سبيل المثال ، لتحليل نشاط kinesin-5 ، استخدم مخزن التفاعل المؤقت مع قاطع رابطة TCEP 1 mM ، و 0.2 مجم / مل من الكازين ألفا ، و 70 mM KCl ، ونظام كسح الأكسجين (4.5 مجم / مل جلوكوز ، و 350 وحدة / مل من أوكسيديز الجلوكوز ، و 34 وحدة / مل من الكاتالاز) ، و 1 mM DTT ، و ATP عند التركيز المطلوب (على سبيل المثال ، 1 mM لظروف سرعة الكينسين القصوى) في 1x BRB80 (الشكل 3G ). لتحليل البروتينات غير الحركية ، احذف ATP وقم بتغيير تركيز KCl لتعديل قوة تفاعل البروتين والأنابيب الدقيقة في هذه المقايسات.
    10. أغلق حافتي الحجرة بطلاء أظافر شفاف وانتظر حتى يجف الطلاء قبل التصوير (الشكل 3H). لن تحتوي الغرفة التي تم بناؤها بنجاح على أي تسرب وفقاعات دنيئة.

5. تصوير حزم الأنابيب الدقيقة مع TIRF 3 ألوان

  1. استخدم أداة مجهر مقلوب لديها قدرات تصوير TIRF ، والتي تم فيها إنشاء مصيدة بصرية أحادية الحزمة (الشكل 4).
    ملاحظة: بالنسبة للدراسات الموصوفة هنا ، تم استخدام مجهر مقلوب مع عدسة موضوعية زيتية 100x / NA1.49 ، ووحدة TIRF ، وثلاثة ليزر عند 488 نانومتر و 561 نانومتر و 640 نانومتر للبروتين الموسوم ب GFP ، والأنابيب الدقيقة التي تحمل علامة الرودامين ، والأنابيب الدقيقة ذات العلامات الحمراء البيوتينيل ، على التوالي.
    1. أضف قطرة واحدة من زيت الغمر على غطاء غرفة العينة. قد يؤدي الزيت المفرط إلى إتلاف هدف المجهر. مع توجيه جانب الغطاء لغرفة العينة لأسفل ، ضع العينة المراد تصويرها على منصة المجهر.
    2. ارفع الهدف ببطء بحيث يكون هناك اتصال بين كل من الغطاء والهدف من خلال الزيت. اضبط الارتفاع المستهدف بحيث يكون سطح انزلاق الغطاء لحجرة العينة في بؤرة التركيز.
    3. سجل صورا أحادية الإطار للعينة في جميع القنوات الثلاث. بالنسبة للتجارب هنا ، استخدم 100-200 مللي ثانية من التعرض كمدة تصوير مثالية عبر جميع القنوات الثلاث ؛ قد تؤدي أوقات التعرض الأطول إلى زيادة التبييض الضوئي.
    4. اضبط طاقة الليزر لتحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة من العينات مع تقليل التبييض الضوئي خلال 2-5 دقائق عند فحص الحزمة الفردية. بالنسبة لليزر المستخدم هنا (الشكل 4 والشكل 5) ، استخدم طاقة ليزر تبلغ 5 ميجاوات لقناة GFP و 3 ميجاوات لكلا قناتي الأنابيب الدقيقة على النحو الأمثل.
      ملاحظة: يجب أن تتكون الحزم المجمعة بنجاح من أنبوب دقيق واحد مثبت السطح في القناة الحمراء البعيدة ، ومنطقة متراسعة من عدة ميكرونات مع إشارة بروتين GFP كبيرة ، وأنبوب دقيق رودامين يتداخل مع هذه المناطق ثم يمتد عدة ميكرونات بعيدا عن الحزمة (الشكل 5B و C والشكل 6 ). يجب أن يكشف التصوير المباشر للأنبوب الدقيق للرودامين عن تقلبات طفيفة في نهاية الأنابيب الدقيقة غير المتشابكة ، مما يشير إلى أن هذا الخيط غير مرتبط بالسطح أو البروتينات الأخرى في الغرفة.
    5. راقب تواتر حزم الأنابيب الدقيقة لكل مجال رؤية. للحصول على عينة معدة بنجاح ، يجب أن يكون هناك ما يقرب من 3-4 حزم من الأنابيب الدقيقة لكل 100 ميكرولتر × 100 ميكرولتر مجال رؤية لكل غرفة.

6. إجراء تجارب المصيدة الضوئية على حزم الأنابيب الدقيقة

  1. معايرة الظروف قبل التجريبية
    1. لإجراء هذه التجارب ، استخدم مصيدة بصرية أحادية الحزمة بصلابة 0.05-0.1 pN / nm. قم بدمج بصريات الملاءمة والكاشف الضوئي الحساس للموضع في مجهر مقلوب قادر على TIRF عن طريق إدخال مرشحات تمرير قصير أسفل الهدف مباشرة وفوق المكثف ، على التوالي (الشكل 4).
    2. بالإضافة إلى ذلك ، أضف مرحلة تحديد المواقع النانوية التي تجلس عليها العينة للسماح للمستخدم بتحريك الأنابيب الدقيقة بدقة مقياس نانومتر بطريقة مضبوطة أثناء هذه المقايسات. تم وصف النظام المستخدم هنا للحصول على بيانات تمثيلية في العمل المنشور27،53،54،56،57.
      ملاحظة: على الرغم من أنه خارج نطاق هذا البروتوكول ، تتوفر موارد متعددة توضح بالتفصيل بناء ومعايرة مصيدة بصرية أحادية الحزمة58،59،60.
    3. راقب كثافة الخرز في العينة باستخدام حقل ساطع أو قناة DIC وهدف 100x على المجهر. استخدم الفحص المجهري برايتفيلد فقط لتحديد الخرز ومعالجته وليس للتسجيل في وقت واحد مع الحصول على صورة مضانة. باعد بين الخرزات لتكون على بعد 10 ميكرومتر على الأقل من بعضها البعض في المتوسط ، وتأكد من خلوها من أي نوع من الحبس السطحي أو التعلق وعدم ربطها ببعضها البعض أو تجميعها بطريقة أخرى.
    4. تأكد من أن الأنابيب الدقيقة ذات اللون الأحمر البعيد البيوتينيل متصلة بقوة بسطح الغطاء ، مع عدم وجود حركة براونية مرئية ، مثل الحركات على طول محور الأنابيب الدقيقة أو الأطراف الحرة للأنابيب الدقيقة المتقلبة في المحلول.
    5. تأكد من أن الأنابيب الدقيقة للرودامين متصلة بالأنابيب الدقيقة البيوتينية عبر MAP المتشابكة وتتقلب بشكل واضح في نهاياتها الحرة. غالبا ما يشير التعلق السطحي للأنابيب الدقيقة غير البيوتينيلية إلى أن PEGylation ربما لم ينجح أو أن طلاء PEG قد تدهور.
  2. قياسات انزلاق الأنابيب الدقيقة ذات المحرك
    1. التعبير عن البروتين الحركي وتعقيته باتباع البروتوكولات المنشورة. على سبيل المثال ، تم تنقية بروتينات kinesin-5 كاملة الطول الموسومة ب GFP بنجاح واستخدامها في هذه المقايسات 53,61 ، بالإضافة إلى kinesin-1262 و kinesin-1463 غير المصنفة. قم بتجميع وتصور الحزم المتشابكة بين البروتين الحركي كما هو موضح أعلاه في الخطوتين 4 و 5.
    2. التقط باستخدام المصيدة البصرية حبة واحدة مجانية في محلول يظهر حركة براونية. اضبط بصريات الملائمة حسب الضرورة لتحريك الخرزة إلى منتصف مجال الرؤية. تأكد من أن نمط التداخل المنعكس من شعاع الملائمة متماثل واضبط بصريات الملائمة لحل أي عدم تناسق للحزمة.
    3. حرك مرحلة العينة بحيث تكون النهاية الحرة للأنبوب الدقيق للرودامين داخل الحزمة أسفل الخرزة مباشرة وتكون الخرزة على بعد عدة ميكرونات من منطقة التداخل التي تحتوي على بروتينات متشابكة لتقليل التبييض الضوئي الناجم عن حزمة المصيدة. اخفض الخرزة في المحور Z حتى تصطدم بالأنابيب الدقيقة. احرص على خفض الخرزة برفق ، ولا تدفع الخرزة على سطح الغطاء ، لأن ذلك قد يتسبب في الالتصاق بسطح الغطاء المنزلق.
    4. قم بإيقاف تشغيل المصيدة لفترة وجيزة لمراقبة حركة الخرزة المتصلة بالأنابيب الدقيقة المنزلقة باستخدام قناة برايتفيلد. عند إجراء فحوصات البروتين الحركي ، ستتحرك الخرزة المرفقة بشكل اتجاهي حيث تنزلق الأنابيب الدقيقة بعيدا. أعد تنشيط المصيدة والتقط الخرزة مرة أخرى.
    5. ابدأ في تسجيل بيانات التألق في القنوات الثلاث (488 نانومتر ، 561 نانومتر ، 640 نانومتر) بمعدل 1-2 إطار لكل ثانية باستخدام طاقة الليزر وأوقات التعرض التي تم تحسينها في الخطوة 5 أعلاه.
    6. باستخدام برنامج كمبيوتر الملائمة، قم بتسجيل بيانات الجهد من كاشف الضوء الحساس للموضع (إشارات شدة X وY وSUM)، ومرحلة تحديد المواقع النانوية (إحداثيات X وY وZ)، وحالة غالق الكاميرا TIRF. ابدأ في رقمنة قيم جهد الملائمة هذه باستخدام لوحة مخصصة للحصول على بيانات إدخال الجهد يتم التحكم فيها بواسطة برنامج مناسب (مثل كود LabView المكتوب خصيصا) بمعدل 1-10 كيلو هرتز ، اعتمادا على المتطلبات التجريبية.
    7. راقب إشارة القوة عند الحصول على البيانات وانتبه جيدا لأي حالات شاذة قد تتداخل مع جمع البيانات بنجاح.
      ملاحظة: تشمل الحالات الشاذة على سبيل المثال لا الحصر (1) خرزات أخرى تتحرك في المصيدة ، (2) الخرزة التي تهرب من المصيدة قبل الأوان ، و (3) الانخفاضات المفاجئة للقوة والفشل اللاحق في إعادة تشغيل القوة ضد المصيدة ، مما يشير إلى وجود مشكلات في جزيئات كينيسين الصارمة على سطح الخرزة.
    8. بعد القياس ، قم بإلغاء تنشيط المصيدة لتحرير الخرزة وكرر باستخدام حبة جديدة وأنابيب دقيقة جديدة حتى يتم تحقيق العدد المطلوب من التكرارات التجريبية.
  3. قياسات مقاومة التشابك السلبي
    1. التعبير عن وتنقية البروتينات المتشابكة غير الحركية ذات الأهمية باتباع البروتوكولات المنشورة. على سبيل المثال ، تم استخدام PRC143،54،57 كامل الطول المسمى GFP وبناءمقطوع ثنائي الشكل 56 بنجاح في هذه المقايسات. قم بتجميع الحزم المتشابكة وتصورها كما هو موضح أعلاه في الخطوتين 4 و 5.
    2. تحديد حزمة الأنابيب الدقيقة المناسبة التي تحتوي على اثنين فقط من الأنابيب الدقيقة ، واحدة بيوتينيل مع ملحق السطح الكامل وواحدة غير biotinylated microtubule التي هي حرة جزئيا في المحلول ؛ هذا يعطي نهاية حرة لربط حبة ويضمن أن الخرزة غير متصلة بالأنابيب الدقيقة المرتبطة بالسطح ويتم محاذاتها إما على المحور X أو Y ، بحيث تكون حركة المرحلة على طول محور واحد فقط.
    3. استخدم المصيدة البصرية لالتقاط حبة حرة تخضع لحركة براونية. بمجرد حبس الخرزة ، انقل الخرزة بعناية إلى حزمة الأنابيب الدقيقة المحددة ، مما يضمن عدم سحب أي خرزات أخرى إلى المصيدة في هذه العملية. تأكد من أن الخرزة تبعد عدة ميكرونات عن منطقة التداخل التي تحتوي على بروتينات متشابكة لتقليل التبييض الضوئي لعلامة GFP.
    4. اخفض الخرزة بعناية في المحور Z حتى تتلامس مع حافة الجزء الحر من الأنابيب الدقيقة للرودامين. اسحب لأعلى برفق وتحرك بشكل عمودي على محور الأنابيب الدقيقة للتحقق من التعلق من خلال مراقبة ثني الأنابيب الدقيقة الرودامين واتباع موضع الخرزة. إذا لم يتم إرفاقها ، كرر الارتطام اللطيف للحبة على الأنابيب الدقيقة حتى يتم تثبيتها.
    5. أعد تنظيم الأنابيب الدقيقة للرودامين بعناية على طول محور الأنابيب الدقيقة للأنبوب الدقيق المتصل بالسطح عن طريق تحريك مرحلة تحديد المواقع النانوية وإعداد معلمات السحب الآلي لحزمة الأنابيب الدقيقة. اضبط الاتجاه على طول المحور المتوازي للأنابيب الدقيقة ، واضبط سرعة السحب المطلوبة (25-200 نانومتر / ثانية هي مجموعة مفيدة من السرعات) ، ووقت السحب المطلوب (حوالي 30 ثانية إلى 2 دقيقة) اعتمادا على طول التداخل.
    6. ابدأ في تسجيل بيانات التألق في القنوات الثلاث (488 نانومتر ، 561 نانومتر ، 640 نانومتر) بمعدل 1-2 إطار في الثانية. استخدم قوى الليزر وأوقات التعرض المحسنة في الخطوة 5 أعلاه.
    7. ابدأ حركة المسرح المؤتمتة وسجل بيانات الملائمة من الكاشف الحساس للموضع والمرحلة وحالة كاميرا TIRF. راقب أي عوامل يمكن أن تتداخل مع جمع البيانات ، والتي تشمل على سبيل المثال لا الحصر (1) حبة أخرى تدخل المصيدة ، (2) فقدان سابق لأوانه للتشابك بين الأنابيب الدقيقة ، أو (3) انفصال الخرزة عن الأنابيب الدقيقة للرودامين.
    8. قم بإلغاء تنشيط المصيدة لتحرير الخرزة وكرر التجربة حسب الرغبة. يمكن استخدام غرفة عينة نموذجية لمدة 30 دقيقة تقريبا قبل تدهور الحزم وفقدان نشاط البروتين.
      ملاحظة: ستختلف تأثيرات التحلل حسب الرابط المتشابك المستخدم ولكن يمكن أن تظهر على شكل نقاط ثابتة إما على الأنابيب الدقيقة أو السطح ، أو فقدان تقلبات الأنابيب الدقيقة التي تشير إلى ارتباط غير محدد ، أو عدم القدرة على ربط الخرز بثبات بالأنابيب الدقيقة.

7. تحليل البيانات وارتباط صور التألق بسجلات الفخ الضوئية

ملاحظة: لتحسين جمع البيانات ، من المفيد استخدام نظامين منفصلين للتحكم في الكمبيوتر: أحدهما لبرنامج الاصطياد البصري والآخر للتصوير الفلوري. يسمح هذا الإعداد بالحصول على بيانات عالية السرعة في كل من الطرائق التجريبية ويزيل تأخيرات النانو والميكروثانية في تنفيذ العملية التي يتم إدخالها إلى البيانات ، والتي يمكن أن تنشأ عند استخدام وحدة معالجة مركزية واحدة.

  1. رقمنة بيانات الاصطياد البصري بمعدل محسن للبروتينات المتشابكة الحركية أو غير الحركية المستخدمة ومعدلات خطواتها المتوقعة (على سبيل المثال ، عادة بين 1-10 كيلو هرتز).
  2. سجل إشارات الجهد X و Y و SUM من الكاشف الضوئي الحساس للموضع ، بالإضافة إلى البيانات الموضعية X و Y و Z لمرحلة تحديد المواقع النانوية باستخدام برنامج مخصص للتحكم في المصيدة الضوئية وأخذ عينات من إشارات الجهد الرقمي من هذه المكونات.
  3. سجل الإشارة الرقمية لحالة فتح الغالق من الكاميرا باستخدام قناة إدخال جهد إضافية على لوحة الحصول على بيانات الملائمة البصرية. وهذا يسمح بربط بيانات التصوير الفلوري مع آثار وقت الاصطياد البصري. ابدأ جمع البيانات باستخدام المصيدة البصرية قبل بدء التصوير بحيث يتم تسجيل إشارة الكاميرا من الإطار الأول بشكل صحيح.
  4. متوسط بيانات السلاسل الزمنية الخام التي تم الحصول عليها بمعدلات أخذ عينات عالية باستخدام طريقة تصفية مناسبة ، مثل النافذة المنزلقة أو المرشح المتوسط أو مرشح Gaussian ، اعتمادا على الاحتياجات.
  5. حدد بيانات السلاسل الزمنية لصورة التألق باستخدام طرق مثل تحليل linecan ، حيث يتم حساب قيمة كثافة البكسل على طول منطقة الأنابيب الدقيقة. من هذه الخطوطمسارات المسح ، حدد حواف الأنابيب الدقيقة ، وبالتالي مناطق التداخل. بالإضافة إلى ذلك ، استخدم شدة التألق من قناة بروتين crosslinker لحساب توطين البروتين وتركيزه وكثافته.
  6. يعد ارتباط القوة وبيانات الصورة ناتجا أساسيا لهذا النظام التجريبي. على سبيل المثال، حدد ومتوسط جميع نقاط بيانات القوة داخل منطقة تعريض ضوئي معينة للكاميرا (يشار إليها بارتفاع الإشارة الرقمية المقابل في قناة الكاميرا) للمقارنة مباشرة مع إطار الصورة الفلورية المقابل. بعد ذلك ، استخرج العلاقات بين حجم القوة وعدد البروتينات المتشابكة أو طول التداخل أو توزيع المتشابك.

النتائج

يعتبر إعداد حزم الأنابيب الدقيقة المناسبة للتحليل الفيزيائي الحيوي ناجحا إذا تم استيفاء العديد من المعايير الرئيسية. أولا ، يجب أن يكشف التصوير بثلاثة ألوان عن اثنين من الأنابيب الدقيقة المحاذاة مع تركيز البروتين المتشابك الذي يزين منطقة التداخل بشكل تفضيلي (الشكل 5B...

Discussion

يتم استخدام شبكات الأنابيب الدقيقة من قبل أنواع لا تعد ولا تحصى من الخلايا لإنجاز مجموعة واسعة من المهام ذات الطبيعة الميكانيكية بشكل أساسي. من أجل وصف كيفية عمل الخلايا في كل من الحالات الصحية والمرضية ، من الأهمية بمكان فهم كيفية تنظيم هذه الشبكات ذات النطاق الميكروني وتنظيمها بواسطة ا?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من R21 AG067436 (إلى JP و SF) ، و T32 AG057464 (إلى ET) ، وصناديق بدء تشغيل معهد رينسيلار للفنون التطبيقية (إلى SF).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nmIPG PhotonicsYLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applicationsChromaTRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin ConjugateInvitrogen#MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC gradeFisher Scientific18-608-395
Alpha casein from bovine milkSigma1002484390
ATPFisher ScientificBP413-25
BenzonaseNovagen70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio, Inc.NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta CellsMillipore Sigma71-400-3
CatalaseMP Biomedicals LLC190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objectiveNikonN/A
ChloramphenicolACROS Organics227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslipsFisher ScientificC14784
Delicate Task WipersKimberly-Clark34120
Dextrose AnhydrousFisher ScientificBP3501
D-SucroseFisher ScientificBP220-1
DTTFisher ScientificBP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 BathLAUDA-Brinkmann27709
EDTAFisher ScientificBP118-500
EGTAMillipore Corporation32462-25GM
FIJI / Image Jhttps://fiji.sc/N/A
Frosted Microscope SlidesCorning12-553-1075mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose OxidaseMP Biomedicals LLC195196Type VII, without added oxygen
GMPCPPJena BiosciencesJBS-NU-405SCan be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover GlassThermo Scientific3405
HEPESFisher ScientificBP310-500
ImidazoleFisher Scientific03196-500
IPTGFisher ScientificBP1755-10
Laboratory dessicatorBel-Art999320237190mm plate size
Kanamycin SulfateFischer ScientificBP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6HisGilbert Lab, RPIN/Adoi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
KimwipeKimberley ClarkZ188956lint-free tissue
Immersion Oil, Type BCargille16484
Lens TissueThorLabsMC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm)NikonN/A
LysozymeMP Biomedicals LLC100834
Magnesium Acetate TetrahydrateFisher ScientificBP215-500
Microfuge 18Beckman Coulter367160
MPEG-SVA MW-5000Laysan Bio, Inc.NC0107576
NeutravadinInvitrogenPI31000
Nikon Ti-E inverted microscopeNikonN/ANikon LuN4 Laser
Ni-NTA ResinThermo Scientific88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		IDTN/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		IDTN/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mmBeckman Coulter343755
Optima-TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361544
Paclitaxel (Taxol equivalent)Thermo Fisher ScientificP3456
PIPESACROS Organics172615000
PMSFMillipore7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin labelCytoskeleton, Inc.T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 FluorCytoskeleton, Inc.TL670Mfar red labelled
Porcine Tubulin, RhodamineCytoskeleton, Inc.TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin ProteinCytoskeleton, Inc.T240
Potassium AcetateFisher ScientificBP364-500
Prime 95B sCMOS cameraPhotometricN/A
Quadrant Detector Sensor HeadThorLabsPDQ80A
Quikchange Lightning KitAgilent Technologies210518
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Square Cover GlassesCorning12-553-45018 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin MicrospheresPolysciences Inc.24162-1
Superose-6 ColumnGE Healthcare29-0915--96
TCEPThermo Scientific77720
TLA-100 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator)VevorJPS-08A(DD)304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solutionVector LaboratoriesSP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-DS.C. JohnsonSJN695237

References

  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-mediated transport. Traffic. 20 (11), 851-866 (2019).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Helmke, K. J., Heald, R., Wilbur, J. D. Interplay between spindle architecture and function. International Review of Cell and Molecular Biology. 306, (2013).
  5. Elting, M. W., Suresh, P., Dumont, S. The spindle: integrating architecture and mechanics across scales. Trends in Cell Biology. 28 (11), 896-910 (2018).
  6. Kapoor, T. Metaphase spindle assembly. Biology. 6 (1), 8 (2017).
  7. Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
  8. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  9. Schnitzer, M. J., Visscher, K., Block, S. M. Force production by single kinesin motors. Nature Cell Biology. 2 (10), 718-723 (2000).
  10. Andreasson, J. O. L., Shastry, S., Hancock, W. O., Block, S. M. The mechanochemical cycle of mammalian kinesin-2 KIF3A/B under load. Current Biology. 25 (9), 1166-1175 (2015).
  11. Bensel, B. M. The mechanochemistry of the kinesin-2 kif3ac heterodimer is related to strain-dependent kinetic properties of kif3a and kif3c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15632-15641 (2020).
  12. Gilbert, S. P., Guzik-Lendrun, S., Rayment, I. Kinesin-2 motors: kinetics and biophysics. Journal of Biological Chemistry. 293 (12), 4510-4518 (2018).
  13. Okada, Y., Higuchi, H., Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through binding to tubulin. Nature. 424 (6948), 574-577 (2003).
  14. Budaitis, B. G., et al. Pathogenic mutations in the kinesin-3 motor KIF1A diminish force generation and movement through allosteric mechanisms. Journal of Cell Biology. 220 (4), 202004227 (2021).
  15. Tomishige, M., Klopfenstein, D. R., Vale, R. D. Conversion of Unc104/KIF1A kinesin into a processive motor after dimerization. Science. 297 (5590), 2263-2267 (2002).
  16. Siddiqui, N., et al. Force generation of KIF1C is impaired by pathogenic mutations. bioRxiv. , (2021).
  17. Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
  18. Valentine, M. T., Gilbert, S. P. To step or not to step? How biochemistry and mechanics influence processivity in Kinesin and Eg5. Current Opinion in Cell Biology. 19 (1), 75-81 (2007).
  19. Jannasch, A., Bormuth, V., Storch, M., Howard, J., Schäffer, E. Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state. Biophysical Journal. 104 (11), 2456-2464 (2013).
  20. Bormuth, V., Varga, V., Howard, J., Schäffer, E. Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules. Science. 325 (5942), 870-873 (2009).
  21. Gennerich, A., Carter, A. P., Reck-Peterson, S. L., Vale, R. D. Force-induced bidirectional stepping of cytoplasmic dynein. Cell. 131 (5), 952-965 (2007).
  22. Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J., Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature. 427 (6975), 649-652 (2004).
  23. Redwine, W. B., et al. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. eLife. 6, 28257 (2017).
  24. Belyy, V., Hendel, N. L., Chien, A., Yildiz, A. Cytoplasmic dynein transports cargos via load-sharing between the heads. Nature Communications. 5 (1), 5544 (2014).
  25. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  26. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  27. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  28. Dumont, S., Mitchison, T. J. Force and length in the mitotic spindle. Current Biology. 19 (17), 749-761 (2009).
  29. McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Biophysics of mitosis. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (2), 147-207 (2012).
  30. McIntosh, J., Hays, T. A brief history of research on mitotic mechanisms. Biology. 5 (4), 55 (2016).
  31. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Seminars in Cell and Developmental Biology. 21 (3), 255-259 (2010).
  32. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  33. Vukušić, K., Ponjavić, I., Buđa, R., Risteski, P., Tolić, I. M. Microtubule-sliding modules based on kinesins EG5 and PRC1-dependent KIF4A drive human spindle elongation. Developmental Cell. 56 (9), 1253-1267 (2021).
  34. Sturgill, E. G., Ohi, R. Kinesin-12 differentially affects spindle assembly depending on its microtubule substrate. Current Biology. 23 (14), 1280-1290 (2013).
  35. Drechsler, H., McHugh, T., Singleton, M. R., Carter, N. J., McAinsh, A. D. The Kinesin-12 Kif15 is a processive track-switching tetramer. eLife. 3, 01724 (2014).
  36. Tanenbaum, M. E., et al. Kif15 Cooperates with Eg5 to promote bipolar spindle assembly. Current Biology. 19 (20), 1703-1711 (2009).
  37. Mountain, V., et al. Cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 147 (2), 351-365 (1999).
  38. Norris, S. R., et al. Microtubule minus-end aster organization is driven by processive HSET-tubulin clusters. Nature Communications. 9 (1), 2659 (2018).
  39. Cai, S., Weaver, L. N., Ems-McClung, S. C., Walczak, C. E. Proper organization of microtubule minus ends is needed for midzone stability and cytokinesis. Current Biology. 20 (9), 880-885 (2010).
  40. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
  41. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  42. Zhu, C., Lau, E., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E., Jiang, W. Spatiotemporal control of spindle midzone formation by PRC1 in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6196-6201 (2006).
  43. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  44. Elting, M. W., Prakash, M., Udy, D. B., Dumont, S. Mapping load-bearing in the mammalian spindle reveals local kinetochore fiber anchorage that provides mechanical isolation and redundancy. Current Biology. 27 (14), 2112-2122 (2017).
  45. Fant, X., Merdes, A., Haren, L. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA. International Review of Cytology. 238, 1-57 (2004).
  46. Merdes, A., Heald, R., Samejima, K., Earnshaw, W. C., Cleveland, D. W. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMA). Journal of Cell Biology. 149 (4), 851-861 (2000).
  47. Maddox, P., Straight, A., Coughlin, P., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Direct observation of microtubule dynamics at kinetochores in Xenopus extract spindles: Implications for spindle mechanics. Journal of Cell Biology. 162 (3), 377-382 (2003).
  48. Maddox, P., Desai, A., Oegema, K., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Poleward microtubule flux is a major component of spindle dynamics and anaphase A in mitotic Drosophila embryos. Current Biology. 12 (19), 1670-1674 (2002).
  49. LaFountain, J. R., Cohan, C. S., Siegel, A. J., LaFountain, D. J. Direct visualization of microtubule flux during metaphase and anaphase in crane-fly spermatocytes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5724-5732 (2004).
  50. Pavin, N., Tolić, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  51. Vukušić, K., Tolić, I. M. Anaphase B: Long-standing models meet new concepts. Seminars in Cell and Developmental Biology. 117, 127-139 (2021).
  52. Vukušić, K., et al. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes. Developmental Cell. 43 (1), 11-23 (2017).
  53. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  54. Gaska, I., Armstrong, M. E., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts like a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 367-378 (2020).
  55. Woll, K. A., et al. An allosteric propofol-binding site in kinesin disrupts kinesin-mediated processive movement on microtubules. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11283-11295 (2018).
  56. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  57. Alfieri, A., Gaska, I., Forth, S. Two modes of PRC1-mediated mechanical resistance to kinesin-driven microtubule network disruption. Current Biology. 31 (12), 2495-2506 (2021).
  58. Koch, M. D., Shaevitz, J. W. Introduction to optical tweezers. Methods in Molecular Biology. 1486, 3-24 (2017).
  59. Sarshar, M., Wong, W. T., Anvari, B. Comparative study of methods to calibrate the stiffness of a single-beam gradient-force optical tweezers over various laser trapping powers. Journal of Biomedical Optics. 19 (11), 115001 (2014).
  60. Van Mameren, J., Wuite, G. J. L., Heller, I. Introduction to optical tweezers: Background, system designs, and commercial solutions. Methods in Molecular Biology. 783, 1-20 (2011).
  61. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9, 51131 (2020).
  62. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology:CB. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  65. . SMART - Servier Medical ART Available from: https://smart.servier.com/ (2022)
  66. Gaska, I., Armstrong, M., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts as a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 1-14 (2020).
  67. Janson, M. E., De Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  68. Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
  69. Powers, A. F., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  70. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  71. Fong, K. K., et al. Direct measurement of the strength of microtubule attachment to yeast centrosomes. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1853-1861 (2017).
  72. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
  73. Memet, E., et al. Microtubules soften due to cross-sectional flattening. eLife. 7, 34695 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved