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Résumé

Nous présentons ici un protocole pour reconstituer des faisceaux de microtubules in vitro et quantifier directement les forces exercées en leur sein en utilisant le piégeage optique simultané et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale. Ce test permet de mesurer à l’échelle nanométrique les forces et les déplacements générés par les ensembles de protéines au sein de réseaux de microtubules actifs.

Résumé

Les réseaux de microtubules sont utilisés dans les cellules pour accomplir un large éventail de tâches, allant de l’action en tant que pistes pour le transport des vésicules au travail en tant que réseaux spécialisés pendant la mitose pour réguler la ségrégation chromosomique. Les protéines qui interagissent avec les microtubules comprennent des moteurs tels que les kinésines et la dynéine, qui peuvent générer des forces actives et des mouvements directionnels, ainsi que des protéines non motrices qui réticulent les filaments dans des réseaux d’ordre supérieur ou régulent la dynamique des filaments. À ce jour, les études biophysiques des protéines associées aux microtubules se sont massivement concentrées sur le rôle des protéines monomotrices nécessaires au transport des vésicules, et des progrès significatifs ont été réalisés dans l’élucidation des propriétés génératrices de force et de la régulation mécanochimique des kinésines et des dynéines. Cependant, pour les processus dans lesquels les microtubules agissent à la fois comme cargaison et piste, comme lors du glissement du filament dans la broche mitotique, on comprend beaucoup moins la régulation biophysique des ensembles de protéines de réticulation impliquées. Ici, nous détaillons notre méthodologie pour sonder directement la génération de force et la réponse dans les réseaux minimaux de microtubules réticulés reconstitués à partir de microtubules purifiés et de protéines mitotiques. Les paires de microtubules sont réticulées par des protéines d’intérêt, un microtubule est immobilisé sur une lame de couverture de microscope et le deuxième microtubule est manipulé par un piège optique. La microscopie simultanée à fluorescence par réflexion interne totale permet une visualisation multicanal de tous les composants de ce réseau de microtubules lorsque les filaments s’écartent pour générer de la force. Nous démontrons également comment ces techniques peuvent être utilisées pour sonder les forces de poussée exercées par les ensembles kinésine-5 et comment les forces de freinage visqueuses apparaissent entre les paires de microtubules glissantes réticulées par le MAP PRC1 mitotique. Ces tests donnent un aperçu des mécanismes d’assemblage et de fonction des fuseaux et peuvent être plus largement adaptés pour étudier la mécanique du réseau de microtubules denses dans divers contextes, tels que l’axone et les dendrites des neurones et des cellules épithéliales polaires.

Introduction

Les cellules utilisent des réseaux de microtubules pour effectuer une grande variété de tâches mécaniques, allant du transport des vésicules 1,2,3 à la ségrégation chromosomique pendant la mitose 4,5,6. De nombreuses protéines qui interagissent avec les microtubules, telles que les protéines motrices moléculaires kinésine et dynéine, génèrent des forces et sont régulées par des charges mécaniques. Pour mieux comprendre le fonctionnement de ces molécules critiques, les chercheurs ont utilisé des méthodes biophysiques à molécule unique, telles que le piégeage optique et la microscopie TIRF, pour surveiller directement les paramètres critiques tels que les taux de pas à vide, la processivité et les relations force-vitesse pour les protéines individuelles. La géométrie expérimentale la plus couramment utilisée a été d’attacher des protéines motrices directement aux billes de piégeage dont la géométrie sphérique et la taille imitent les vésicules soumises à un transport motorisé. De nombreuses kinésines, dont la kinésine-1 7,8,9, la kinésine-2 10,11,12, la kinésine-313,14,15,16 la kinésine-517,18, la kinésine-8 19,20, ainsi que les complexes dynéine et dynéine 21,22, 23,24,25, ont été étudiés avec ces méthodes.

Dans de nombreux processus cellulaires, cependant, les protéines motrices et non motrices utilisent des microtubules à la fois comme voie et comme cargaison26,27. De plus, dans ces scénarios où les filaments de microtubules sont réticulés en faisceaux d’ordre supérieur, ces protéines fonctionnent comme des ensembles plutôt que comme des unités individuelles. Par exemple, à l’intérieur des cellules somatiques en division, des réseaux de filaments denses s’auto-organisent pour construire l’appareil de fuseau mitotique28,29,30. Le réseau interpolaire de microtubules de fuseau est très dynamique et est en grande partie arrangé avec des extrémités moins pointant vers les pôles de fuseau et des extrémités plus se chevauchant près de l’équateur de fuseau. Les filaments à l’intérieur de la broche sont réticulés par des protéines motrices telles que la kinésine-5 31,32,33, la kinésine-12 34,35,36 et la kinésine-1437,38,39, ou par des protéines non motrices telles quePRC1 40,41,42,43 ou NuMA 44,45, 46. Ils se déplacent fréquemment ou subissent des contraintes mécaniques lors de processus tels que le flux vers les pôles ou lors de la coordination du centrage chromosomique pendant la métaphase ou la ségrégation chromosomique pendant l’anaphase 47,48,49,50,51,52. L’intégrité de l’appareil de broche à l’échelle du micron par mitose repose donc sur un équilibre soigneusement régulé des forces de poussée et de traction générées et soutenues par ce réseau de filaments en interaction. Cependant, les outils nécessaires pour sonder cette régulation mécanique et expliquer comment les ensembles de protéines travaillent de concert pour coordonner les mouvements des microtubules et produire les forces nécessaires pour assembler correctement la broche n’ont été développés que récemment, et nous commençons tout juste à comprendre les règles biophysiques qui définissent les réseaux de microtubules dynamiques.

Le but de ce manuscrit est de démontrer les étapes nécessaires pour reconstituer des paires de microtubules réticulés in vitro, immobiliser ces faisceaux dans une chambre de microscopie qui permet une visualisation simultanée de la fluorescence des microtubules et des protéines de réticulation et la mesure de la force à l’échelle nanométrique, et de traiter ces données de manière robuste. Nous détaillons les étapes nécessaires pour polymériser de manière stable les microtubules marqués par fluorescence, préparer les lames de couverture du microscope pour la fixation, préparer des billes de polystyrène pour les expériences de piégeage optique et assembler des réseaux de filaments réticulés qui préservent leur fonctionnalité in vivo tout en permettant une manipulation biophysique directe.

Protocole

1. Préparation des microtubules

REMARQUE: Lors de l’utilisation de protéines de réticulation marquées GFP, rouge (par exemple, rhodamine) et rouge lointain (par exemple, HiLyte647 biotinylé, appelé rouge lointain biotinylé dans le reste du texte), le marquage fluorophore organique des microtubules fonctionne bien. Une diaphonie minimale entre les trois canaux peut être obtenue pendant l’imagerie en utilisant un filtre de fluorescence interne totale (TIRF) quadribande de haute qualité.

  1. Préparer les stocks de semences de microtubules GMPCPP
    1. Mettre en suspension 1 mg de tubuline lyophilisée non marquée dans 84 μL de 1x BRB80 glacé (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA; pH 6,8), avec du DTT ajouté à une concentration finale de 1 mM juste avant utilisation. Suspendre 60 μg de tubuline lyophilisée marquée au fluorophore dans 6 μL de froid 1x BRB80 avec 1 mM de DTT. Suspendre 60 μg de tubuline lyophilisée marquée à la biotine dans 6 μL de froid 1x BRB80 avec 1 mM de DTT.
    2. Pour préparer des graines de tubuline non biotinylées marquées à la rhodamine avec un rapport d’étiquetage de 1:10, ajouter 84 μL de tubuline non marquée, 6 μL de tubuline marquée au fluorophore et 10 μL de solution mère GMPCPP de 10 mM dans un tube de 0,5 mL. Bien mélanger en pipetant doucement et garder sur la glace.
      NOTE: La polymérisation GMPCPP est préférée pour ces tests car les microtubules sont plus stables et se prêtent à une manipulation directe avec le piège optique que si polymérisé avec GTP ou si le taxol est omis.
    3. Pour préparer des graines de tubuline biotinylées marquées en rouge avec un rapport d’étiquetage fluorescent de 1:10, ajouter 80 μL de tubuline non marquée, 6 μL de tubuline marquée au fluorophore, 4 μL de tubuline marquée à la biotine et 10 μL de solution mère GMPCPP de 10 mM dans un tube de 0,5 mL. Bien mélanger en pipetant doucement et garder sur la glace. Incuber le stock de graines sur la glace pendant 5 min.
    4. Transférer la solution de tubuline dans un tube en polycarbonate approprié pour la centrifugation à grande vitesse. Centrifuger le stock de semences à ~350 000 x g pendant 5 min à 2 °C pour empêcher la polymérisation des microtubules et récupérer le surnageant pour l’aliquote. La concentration finale estimée de tubuline à ce stade est de ~50 μM.
    5. À l’aide de tubes de PCR de 0,2 mL, préparer 2 μL d’aliquotes du stock de semences et surgeler avec de l’azote liquide. Les aliquotes peuvent être conservées à -80 °C jusqu’à 6 mois.
  2. Polymérisation des microtubules
    1. Préparer 500 μL de 1x BRB80 et déposer sur de la glace. Placer une partie de chacune des aliquotes de stock de graines de rhodamine rouge lointain biotinylées et non biotinylées sur de la glace pour décongeler.
    2. Incuber les stocks de graines sur la glace pendant 5 min. À la fin de la période d’incubation, ajouter immédiatement 26 μL de 1x BRB80 dans chaque tube. Si des microtubules plus longs sont souhaités, augmenter le volume de BRB80 de 5 à 10 μL, tandis que, pour les microtubules plus courts, réduire le volume de polymérisation de 5 μL.
    3. Incuber les stocks de semences de microtubules pendant 1 h à 37 °C au bain-marie. Combiner 298,5 μL de 1x BRB80 à température ambiante et 1,5 μL de solution mère de taxol 4 mM pour obtenir une solution de taxol 20 μM. Préparez 300 μL de 1x BRB80 et conservez les deux tubes à température ambiante.
    4. Réchauffer un rotor à grande vitesse approprié à 30 °C. Cela peut être fait dans une ultracentrifugeuse de table réglée à 30 °C. Retirez les microtubules du bain-marie et maintenez-les à température ambiante sur une paillasse pendant 10-15 min.
  3. Clarification des microtubules
    1. Ajouter 100 μL de température ambiante 1x BRB80 à la solution de croissance des microtubules et mélanger en agitant le tube ~10 fois ou en pipetant doucement. Transférer la solution de croissance des microtubules dans un tube à centrifuger en polycarbonate.
    2. Marquez un côté du tube en polycarbonate, qui sera orienté vers l’extérieur par rapport à la rotation de la centrifugeuse. Cela aidera à localiser la pastille de microtubule, qui sera à peine visible en raison du petit volume de matériau.
    3. Centrifuger la solution de microtubules à ~350 000 x g pendant 10 min à 30 °C. Après la centrifugation, inspectez le tube contenant les microtubules à la recherche d’une pastille si possible. Retirez soigneusement tous les microlitres de liquide, sauf les derniers microlitres, sans déranger la pastille. Si le granulé n’est pas clairement visible, utilisez le marquage fait comme guide pour éviter de déranger la zone où se trouve le granulé.
    4. Ajouter immédiatement 100 μL de 1x BRB80 + 20 μM taxol dans le tube à microtubules. Cela peut être ajouté directement sur la pastille; La perturbation de la pastille à ce stade n’a pas d’incidence significative sur le processus de clarification.
    5. Centrifuger à nouveau les microtubules à ~350 000 x g pendant 10 min, en veillant à ce que la section marquée du tube soit à nouveau orientée vers l’extérieur par rapport à la rotation de la centrifugeuse.
    6. Retirez tous les microlitres de solution comme précédemment, en prenant soin de ne pas perturber la pastille de microtubule. Répétez les étapes 1.3.4.-1.3.5. puis remettre en suspension la pastille de microtubule dans 20-50 μL de 1x BRB80 + 20 μM taxol.
    7. Remettez en suspension en pipetant la majeure partie du volume de remise en suspension et en l’éjectant doucement directement sur la pastille, en répétant 20-30x ou jusqu’à ce que la pastille soit complètement remise en suspension. Cela doit être fait avec précaution afin de ne pas cisailler les microtubules par un pipetage trop vigoureux. Couper l’embout de la pipette pour augmenter la taille de l’ouverture peut également être utile pour réduire le cisaillement des microtubules.
    8. Conservez les microtubules à température ambiante en enveloppant le tube dans du papier d’aluminium pour protéger les fluorophores de la lumière et en les gardant sur la paillasse. Les microtubules sont généralement utilisables pendant 2-3 jours après clarification.
  4. Évaluation des microtubules par microscopie
    1. Préparer une dilution 1:10 de la solution de microtubules clarifiés en mélangeant 1 μL de microtubules et 9 μL de température ambiante 1x BRB80. Imagez immédiatement cette solution en pipetant 10 μL sur une lame de microscope, puis en plaçant une lamelle de couverture sur la gouttelette pour former une courge.
    2. S’assurer que les microtubules d’une longueur comprise entre 8 et 25 μm à haute densité (plusieurs centaines par champ de vision complet en couches dans un réseau dense) sont visibles lorsqu’ils sont visualisés à l’aide de la microscopie à fluorescence et d’un objectif 100x focalisé sur la surface de la lamelle de couverture en contact avec la dilution des microtubules.

2. Préparation des lamelles passivées

  1. Laver les feuillets de couverture
    1. Placer des lamelles de recouvrement de 18 mm x 18 mm dans des supports en plastique non réactif, puis placer chaque grille dans un bécher de 100 mL. Placez un bordereau de couverture par emplacement dans les racks, car le nettoyage des deux côtés des lamelles de couverture est nécessaire.
    2. Sonicer à l’aide d’un sonicateur de bain pendant 5 min, en utilisant 50 mL des solutions suivantes dans l’ordre indiqué pour chaque cycle de sonication : (1) eau désionisée (résistivité de 18,3 MΩ-cm), (2) solution Micro-90 à 2 %, (3) eau désionisée, (4) 0,1 M KOH fraîchement préparée, (5) eau désionisée (Figure 1A). Assurez-vous que les lamelles de couverture sont entièrement recouvertes de liquide. Entre les cycles de sonication, rincez chaque grille de lamelles de couverture dans de l’eau désionisée à l’aide d’une pince à épiler pour tremper la grille de haut en bas de 10 à 20 fois dans de l’eau désionisée, remplacez l’eau et répétez le processus de rinçage 2x.
    3. Rincez les lamelles 3x à l’eau, puis remplissez les béchers avec de l’éthanol à 100% et remettez les grilles dans les béchers. Déplacez les béchers dans une hotte et disposez suffisamment de lingettes en papier tissu pour faire de la place pour tous les supports de couverture. Ensuite, retirez les supports avec une pince à épiler et placez-les sur les lingettes en tissu.
    4. À l’aide d’un flux d’azote gazeux sec, souffler l’éthanol des lamelles de couverture et de leurs supports jusqu’à ce qu’il soit sec. Éliminer le reste de l’éthanol des béchers et les sécher de la même façon en utilisant le flux sec d’azote gazeux (figure 1A).
  2. Fonctionnalisation de surface aminosilane sur lamelles de recouvrement
    1. Préparer la solution de réactif (3-aminopropyl)tiethoxysilane (APTES) en ajoutant 40 mL d’acétone et 400 μL de réactif APTES dans un tube conique de 50 mL, en coiffant hermétiquement et en mélangeant en retournant 10x.
    2. Déplacez un rack de lamelles de couverture dans son bécher sec correspondant, puis immergez-le complètement dans la solution APTES. Incuber pendant 5 min (Figure 1A). Déplacez le rack traité APTES dans un nouveau bécher sec et déplacez un nouveau rack dans l’APTES pour incuber sur 5 m.
    3. Rincer la grille traitée avec de l’eau désionisée en trempant la grille de 10 à 20 x comme décrit à l’étape 2.1.2., en remplaçant l’eau 5x. Répéter jusqu’à ce que tous les feuillets de couverture aient été traités et lavés.
  3. PEGylation de la surface aminosilane
    1. Préparer deux solutions de PEG, l’une de ~100 μL avec 25 % p/v de PEG et l’autre de ~10 μL avec 10 % p/v de biotine-PEG, toutes deux en suspension dans du NaHCO3 de 0,1 M fraîchement préparé, suffisamment pour enduire 24 lamelles de couverture. Centrifuger la solution de PEG à 25 % à 3 000 x g pendant 20 s une fois que 0,1 M de NaHCO3 est ajouté pour dissoudre complètement le PEG; La solution peut rester trouble. Mélanger la biotine-PEG par pipetage doux (Figure 1B).
    2. Préparer un mélange de solutions de PEG et de biotine-PEG, avec 33,3 fois le volume de PEG pour 1 volume de biotine-PEG (par exemple, 100 μL de solution de PEG et 3 μL de solution de biotine-PEG).
    3. Dans une hotte, disposez plusieurs lingettes stériles et non pelucheuses. Déplacez les supports de couvercle sur les lingettes et séchez-les avec un flux sec d’azote gazeux comme auparavant. Sur plusieurs lingettes neuves et sèches, disposez les lamelles maintenant entièrement séchées disposées par paires et étiquetez chacune dans le coin inférieur droit avec un symbole asymétrique tel que « b ». Ce marquage sera opposé à la surface de l’échantillon de la lamelle de couverture et n’interférera pas avec l’expérience (figure 1B).
    4. Retournez un bordereau dans chaque paire avec une pince à épiler. Sur chaque lamelle de couverture retournée, placer 6 μL de mélange PEG/biotine-PEG et placer la deuxième lamelle de couverture sur le dessus de manière à ce que les deux étiquettes « b » soient tournées vers l’extérieur.
    5. Alignez les bords de la glissière de couverture et placez-les dans une chambre humidifiée et étanche à l’air pour éviter le séchage. Incuber les lames de couverture dans la chambre d’humidité à température ambiante pendant 3 h.
    6. Après l’incubation, retirez les lamelles de couverture de la chambre d’humidité, séparez soigneusement les paires de couvercles et replacez-les dans leurs racks. Lavez chaque grille dans de l’eau désionisée comme auparavant, en trempant les grilles à l’aide d’une pince à épiler 10-20x et en remplaçant l’eau un total de 5x.
    7. Placez tous les côtés PEGylés des lamelles de couverture dans la même direction de sorte qu’il n’y ait pas deux surfaces de lamelles PEGylées face à face. La surface PEGylated sera très collante jusqu’à ce qu’elle sèche complètement, alors prenez des précautions supplémentaires pour éviter que les lamelles de couverture ne se touchent. Sécher chaque grille et couvercle comme avant en utilisant un flux sec d’azote gazeux (figure 1B).
    8. Une fois que les lamelles de recouvrement et leurs racks sont complètement séchés, stocker dans un dessiccateur sous vide pour éviter la dégradation du revêtement de surface. Correctement stocké sous vide et avec un dessiccant pour empêcher l’humidité de perturber le revêtement PEG; Les feuillets de couverture peuvent être utilisés pendant environ 1 semaine.

3. Préparation de perles enduites de kinésine

  1. Sélection et préparation de la construction de la kinésine de rigueur
    1. Exprimer et purifier les constructions de la kinésine de rigueur selon les protocoles publiés53,54. Congeler rapidement 5 μL aliquotes de solutions de kinésine à 0,02 mg/mL et conserver à -80 °C pendant 1 an.
      REMARQUE: Les protéines de la kinésine de rigueur ont une mutation ponctuelle G234A qui empêche l’hydrolyse de l’ATP. Lorsqu’elles sont conjuguées à des microbilles, les interactions de haute affinité avec le microtubule permettent aux billes de supporter des charges de 10 à 20 pN pendant plusieurs minutes. Des versions mutées par rigor de l’homodimère kinésine-1 K56053 couramment utilisé et d’une construction K43955 optimisée ont également été utilisées avec succès dans ces essais54. Cette construction K439 améliorée contient un domaine de dimérisation EB1 pour améliorer la stabilité et une étiquette C-terminal 6-His pour une liaison spécifique à un anticorps 6-He, comme décrit ci-dessous.
  2. Liaison 6-Son anticorps aux billes enrobées de streptavidine
    1. Ajouter 50 μL de billes de polystyrène recouvertes de streptavidine de 1 μm de diamètre dans un tube centrifuge de 0,5 mL. Soniquer pendant 30 s.
    2. Ajouter 10 μL de 200 mM de TNT à 790 μL de 1x BRB80. Ajouter 10 μL de billes soniquées à 40 μL de ce tampon TNT 1x BRB80 + 2,5 mM.
    3. Combiner 1 μL d’anticorps 6-His biotinylé et 49 μL de 1x BRB80 + 2,5 mM de DTT; vortex brièvement à mélanger.
    4. Combiner les 50 μL de mélange de billes diluées et les 50 μL de dilution d’anticorps dans un nouveau tube. Placer le tube dans un rotateur tubulaire à 4 °C et tourner pendant 1 h. Faire tourner le mélange de billes pendant 10 min à 3 000 x g à 4 °C.
    5. Retirer à la pipette le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 100 μL de solution de caséine à 2 mg/mL dans 1x BRB80. Répéter cette centrifugation et remettre en suspension 2x.
  3. Ajout de kinésine de rigueur
    1. Remettez en suspension la pastille finale dans 100 μL de solution de caséine à 2 mg/mL. Dans un tube à centrifuger de 0,5 mL, combiner 5 μL de kinésine de rigueur 0,02 mg/mL et 5 μL de billes, en mélangeant doucement en agitant légèrement le tube ~10x.
    2. Gardez la suspension à talon K439 G234A et les 6-His perles restantes sur le rotor à 4 °C lorsqu’elles ne sont pas utilisées. Les perles doivent être préparées fraîches et utilisées le jour même pour les expériences, car elles ont tendance à s’agglutiner et à perdre de l’activité au-delà de cette période.

4. Assemblage de la chambre de microscopie

  1. Préparation des lames de verre et construction de la chambre
    1. Rincez d’abord les lames de verre de microscope de 75 mm x 25 mm avec de l’eau ultrapure, puis avec un nettoyant pour vitres à l’ammoniac sans traînées, puis à nouveau avec de l’eau ultrapure. Agiter pour éliminer les gouttelettes d’eau en excès. Sécher les lames à l’aide d’un jet d’azote de manière à ne plus laisser de traînées et déposer les lames sur une serviette en papier (figure 2A).
    2. Avec des ciseaux, couper le ruban adhésif double face en bandes de ~2-3 mm x 2,5 cm (2 bandes par chambre simple et 3 par chambre double).
    3. À l’aide de pinces, posez deux bandes de ruban adhésif sur une lame de verre afin qu’il y ait ~0,5 cm d’espace entre elles pour construire une seule chambre. Pour les chambres doubles, utilisez le même espacement, mais avec trois bandes de ruban adhésif (figure 2B). Le volume du canal d’échantillonnage utilisant cette méthode est d’environ 10 μL.
      NOTE: Plus la ou les chambres sont larges, plus il est probable que des bulles se forment lorsque des solutions sont introduites; Cependant, les chambres de moins de 0,5 cm de large peuvent être difficiles à utiliser en raison de la surface réduite pour l’imagerie.
    4. Grattez sur toute la longueur de chaque bande de ruban adhésif à l’aide d’une pince afin que le ruban adhésif soit fermement collé à la lame de verre.
    5. Relâchez la pression du dessiccateur et utilisez une pince pour retirer une lamelle de couverture biotinylée d’un rack de rangement. Placez un capseau biotinylé sur la lame de verre à l’aide d’une pince. Assurez-vous que le côté biotinylé est orienté vers l’intérieur, vers la lame de verre.
    6. À l’aide de l’extrémité arrière plate de la pince, appuyez doucement sur le verre à l’endroit où la lamelle de couverture touche le ruban pour sceller solidement les chambres. Une légère pression doit être utilisée pour s’assurer que la glissière de couverture ne se fissure pas (figure 2C).
    7. Conservez les chambres de microscopie finies dans un contenant hermétique, à l’abri de la lumière directe, jusqu’à leur utilisation (figure 2D).
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser les chambres le jour même de leur fabrication, car les lamelles de recouvrement biotinylées se dégradent lorsqu’elles sont exposées à l’air.
  2. Flux de réactifs de microscopie
    1. Construisez une chambre d’humidité en plaçant un mouchoir non pelucheux plié imbibé d’eau ultrapure au fond d’une boîte d’embout de pipette vide. Les chambres d’échantillonnage doivent être conservées dans cette boîte entre les étapes d’écoulement afin de réduire l’évaporation des solutions du canal.
    2. Introduisez tous les réactifs en pipetant le liquide à une extrémité du canal et en évacuant le liquide à l’extrémité opposée. Pour évacuer, tournez une extrémité du tissu et placez-la doucement du côté de sortie de la chambre, ce qui permet une action capillaire pour distribuer le réactif de manière homogène (Figure 3A). Amener tous les réactifs à température ambiante juste avant l’écoulement pour éviter la dépolymérisation des microtubules.
    3. À l’aide d’une pointe de pipette inclinée de 20 μL de manière à toucher le côté d’entrée d’une chambre, inverser lentement 10 μL de streptavidine ou de neutravidine à 0,5 mg/mL. Utiliser des pointes de pipette plus petites et un débit lent et constant de réactifs pour réduire la probabilité d’obtenir des bulles dans la chambre (Figure 3B).
    4. Incuber la lame dans la chambre d’humidité pendant 4 minutes avec le côté couvercle de la chambre vers le bas. Cette orientation permettra à des objets plus gros, tels que des microtubules ou des perles, de couler près de la surface PEGylée.
    5. Rincer la chambre en utilisant 20 μL de 1x BRB80, en utilisant un mouchoir non pelucheux pour aspirer les liquides. S’il y a une fuite dans la chambre, jetez la lame et commencez par une autre; Les petites bulles qui se produisent dans la chambre n’auront pas d’impact négatif sur l’imagerie.
    6. Répéter les étapes d’écoulement, d’incubation et de rinçage avec 10 μL de solution bloquant la caséine à 0,5 mg/mL (figure 3C). Diluer les microtubules rouge lointain biotinylés ~1:20 et couler 10 μL dans la chambre. Incuber pendant 5 min et rincer la chambre avec 20 μL de 1x BRB80 (Figure 3D). La densité optimale de ces microtubules dans un champ de vision d’imagerie de 100 μm x 100 μm devrait être de 10 à 20; et la dilution à ce stade devrait être ajustée pour atteindre ce rapport de liaison superficielle.
    7. Répéter les étapes d’écoulement, d’incubation et de rinçage avec 10 μL d’une concentration appropriée (généralement 1-10 nM) de protéine motrice ou non motrice à étudier (figure 3E).
    8. Débit dans 10 μL de microtubules de rhodamine dilués à une concentration similaire à celle des microtubules rouge lointain biotinylés précédents. Répétez les étapes d’incubation et de rinçage (Figure 3F).
    9. Combiner 1 μL de billes enrobées de kinésine de rigueur et 19 μL de tampon réactionnel optimisé pour l’activité protéique de réticulation. Par exemple, pour l’analyse de l’activité de la kinésine-5, utiliser un tampon réactionnel avec 1 mM de rupture de liaison TCEP, 0,2 mg/mL de caséine alpha, 70 mM de KCl, un système de piégeage de l’oxygène (4,5 mg/mL de glucose, 350 unités/mL de glucose oxydase, 34 unités/mL de catalase), 1 mM de TNT et de l’ATP à la concentration souhaitée (p. ex. 1 mM pour des conditions de vitesse maximale de la kinésine) dans 1x BRB80 (Figure 3G ). Pour l’analyse des protéines non motrices, omettre l’ATP et faire varier la concentration de KCl pour moduler la force d’interaction protéine-microtubule dans ces essais.
    10. Scellez les deux bords de la chambre avec du vernis à ongles transparent et attendez que le vernis sèche avant d’imager (Figure 3H). Une chambre construite avec succès n’aura aucune fuite présente et un minimum de bulles.

5. Faisceaux de microtubules d’imagerie avec TIRF 3 couleurs

  1. Utiliser un microscope inversé doté de capacités d’imagerie TIRF et dans lequel un piège optique à faisceau unique a été construit (figure 4).
    REMARQUE: Pour les études décrites ici, un microscope inversé a été utilisé avec une lentille d’objectif d’huile 100x / NA1.49, un module TIRF et trois lasers à 488 nm, 561 nm et 640 nm pour la protéine marquée GFP, les microtubules marqués à la rhodamine et les microtubules biotinylés marqués en rouge lointain, respectivement.
    1. Ajouter une goutte d’huile d’immersion sur la lamelle de couverture de la chambre d’échantillonnage. Un excès d’huile peut endommager l’objectif du microscope. Avec le côté couvercle de la chambre d’échantillonnage vers le bas, placez l’échantillon à imager sur la plate-forme du microscope.
    2. Soulevez lentement l’objectif de manière à ce qu’il y ait un contact entre la lamelle de couverture et l’objectif à travers l’huile. Ajustez la hauteur de l’objectif de sorte que la surface de la glissière de couverture de la chambre d’échantillonnage soit nette.
    3. Enregistrez des images à image unique de l’échantillon dans les trois canaux. Pour les expériences ici, utilisez 100-200 ms d’exposition comme durée d’imagerie optimale sur les trois canaux; Des temps d’exposition plus longs peuvent entraîner une augmentation du photoblanchiment.
    4. Ajustez la puissance du laser pour obtenir un bon rapport signal sur bruit à partir des échantillons tout en minimisant le photoblanchiment pendant les 2 à 5 minutes lorsque le faisceau individuel est analysé. Pour le laser utilisé ici (Figure 4 et Figure 5), utiliser une puissance laser de 5 mW pour le canal GFP et de 3 mW pour les deux canaux de microtubules comme optimal.
      REMARQUE : Les faisceaux assemblés avec succès doivent être constitués d’un microtubule immobilisé en surface dans le canal rouge lointain, d’une région coextensive de plusieurs microns avec un signal important de la protéine GFP et d’un microtubule de rhodamine chevauchant ces régions et s’étendant ensuite de plusieurs microns loin du faisceau (Figure 5B, C et Figure 6 ). L’imagerie en direct du microtubule de rhodamine devrait révéler des fluctuations subtiles à l’extrémité du microtubule non réticulé, indiquant que ce filament n’est pas attaché à la surface ou à d’autres protéines dans la chambre.
    5. Observez la fréquence des faisceaux de microtubules par champ de vision. Pour un échantillon préparé avec succès, il devrait y avoir environ 3-4 faisceaux de microtubules présents par champ de vision de 100 μL x 100 μL par chambre.

6. Réalisation d’expériences de pièges optiques sur des faisceaux de microtubules

  1. Étalonnage préexpérimental des conditions
    1. Pour effectuer ces expériences, utilisez un piège optique à faisceau unique avec une rigidité de 0,05-0,1 pN/nm. Incorporer l’optique de piégeage et le photodétecteur sensible à la position dans un microscope inversé compatible FRIF en introduisant des filtres passe-courts juste en dessous de l’objectif et au-dessus du condenseur, respectivement (Figure 4).
    2. De plus, ajoutez une étape de nanopositionnement sur laquelle repose l’échantillon pour permettre à l’utilisateur de déplacer les microtubules avec une précision à l’échelle nanométrique de manière contrôlée pendant ces essais. Le système utilisé ici pour acquérir des données représentatives a été décrit dans l’ouvrage publié 27,53,54,56,57.
      NOTE: Bien que dépassant le cadre de ce protocole, de multiples ressources sont disponibles qui détaillent la construction et l’étalonnage d’un piège optique à faisceauunique 58,59,60.
    3. Observez la densité des billes dans l’échantillon à l’aide d’un fond clair ou d’un canal DIC et de l’objectif 100x au microscope. Utilisez la microscopie à fond clair uniquement pour identifier et manipuler les billes et non pour enregistrer simultanément avec l’acquisition d’images en fluorescence. Espacer les billes à une distance moyenne d’au moins 10 μm les unes des autres et s’assurer qu’elles sont exemptes de tout type de confinement ou de fixation de surface et qu’elles ne sont pas attachées les unes aux autres ou autrement regroupées.
    4. S’assurer que les microtubules rouge lointain biotinylés sont fermement attachés à la surface de la lamelle de couverture, sans mouvement brownien visible, tel que des mouvements le long de l’axe des microtubules ou des extrémités libres de microtubules fluctuant en solution.
    5. S’assurer que les microtubules de rhodamine sont attachés aux microtubules biotinylés via le MAP de réticulation et qu’ils fluctuent visiblement à leurs extrémités libres. La fixation à la surface des microtubules non biotinylés indique souvent que la PEGylation peut avoir échoué ou que le revêtement PEG s’est dégradé.
  2. Mesures de glissement des microtubules d’entraînement moteur
    1. Exprimer et purifier la protéine motrice d’intérêt en suivant les protocoles publiés. Par exemple, des protéines kinésine-5 marquées GFP ont été purifiées avec succès et utilisées dans ces dosages 53,61, ainsi que la kinésine-1262 et la kinésine-1463 non marquées. Assemblez et visualisez les faisceaux réticulés moteur-protéine comme décrit ci-dessus aux étapes 4 et 5.
    2. Capturez avec le piège optique une seule perle libre en solution qui présente un mouvement brownien. Ajustez l’optique du piège si nécessaire pour déplacer le cordon vers le milieu du champ de vision. Assurez-vous que le motif d’interférence réfléchi par le faisceau de piège est symétrique et ajustez l’optique du piège pour résoudre toute asymétries de faisceau.
    3. Déplacer l’étape de l’échantillon de manière à ce que l’extrémité libre d’un microtubule de rhodamine dans un faisceau soit directement sous la bille et que la bille soit à plusieurs microns de la région de chevauchement contenant des protéines de réticulation afin de minimiser le photoblanchiment induit par le faisceau de piège. Abaissez le cordon dans l’axe Z jusqu’à ce qu’il entre en collision avec le microtubule. Prenez soin d’abaisser doucement le cordon et ne poussez pas le cordon contre la surface du couvercle, car cela pourrait entraîner un collage à la surface du couvercle.
    4. Éteignez brièvement le piège pour observer avec le canal de fond clair la motilité du cordon attaché au microtubule coulissant. Lors de l’exécution d’essais de protéines motrices, la bille attachée se déplacera directionnellement lorsque les microtubules se sépareront. Réactivez le piège et capturez à nouveau la perle.
    5. Commencez à enregistrer les données de fluorescence dans les trois canaux (488 nm, 561 nm, 640 nm) à une vitesse de 1 à 2 images par s en utilisant la puissance et les temps d’exposition du laser optimisés à l’étape 5 ci-dessus.
    6. À l’aide du logiciel de piégeage, enregistrez les données de tension du photodétecteur sensible à la position (signaux d’intensité X, Y et SUM), de l’étage de nanopositionnement (coordonnées X, Y et Z) et de l’état de l’obturateur de la caméra TIRF. Commencez à numériser ces valeurs de tension de piège à l’aide d’une carte d’acquisition de données d’entrée de tension dédiée contrôlée par un logiciel approprié (tel que le code LabView personnalisé) à une vitesse de 1 à 10 kHz, en fonction des exigences expérimentales.
    7. Surveillez le signal de force au fur et à mesure que les données sont acquises et portez une attention particulière à toute anomalie qui pourrait interférer avec la collecte réussie des données.
      NOTE: Les anomalies incluent, sans toutefois s’y limiter, (1) d’autres perles se déplaçant dans le piège, (2) la perle s’échappant prématurément du piège et (3) des chutes soudaines de force et un échec ultérieur à réamorcer la force contre le piège, indiquant des problèmes avec les molécules de kinésine de rigueur à la surface de la bille.
    8. Après la mesure, désactiver le piège pour libérer le cordon et répéter avec une nouvelle perle et un nouveau microtubule jusqu’à ce que le nombre requis de répétitions expérimentales soit atteint.
  3. Mesures passives de résistance à la réticulation
    1. Exprimer et purifier les protéines de réticulation non motrice d’intérêt en suivant les protocoles publiés. Par exemple, le PRC1 43,54,57 marqué GFP sur toute la longueur et une construction tronquée NuMA dimère 56 ont été utilisés avec succès dans ces essais. Assemblez et visualisez les faisceaux réticulés comme décrit ci-dessus aux étapes 4 et 5.
    2. Identifier un faisceau de microtubules approprié qui ne contient que deux microtubules, un biotinylé avec fixation en pleine surface et un microtubule non biotinylé partiellement libre en solution; cela donne une extrémité libre pour attacher un cordon et garantit que le cordon n’est pas attaché au microtubule lié à la surface et est aligné sur l’axe X ou Y, de sorte que le mouvement de la scène sera le long d’un seul axe.
    3. Utilisez le piège optique pour capturer une perle libre subissant un mouvement brownien. Une fois que la perle a été piégée, déplacez soigneusement la perle vers le faisceau de microtubules sélectionné, en vous assurant qu’aucune autre perle n’est tirée dans le piège dans le processus. Assurez-vous que le cordon se trouve à plusieurs microns de la région de chevauchement contenant les protéines de réticulation afin de minimiser le photoblanchiment de l’étiquette GFP.
    4. Abaissez délicatement la bille sur l’axe Z jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec le bord du segment libre du microtubule de rhodamine. Tirez doucement vers le haut et déplacez-vous perpendiculairement à l’axe du microtubule pour vérifier la fixation en observant la flexion du microtubule de rhodamine et en suivant la position du cordon. S’il n’est pas fixé, répétez le léger choc du cordon sur le microtubule jusqu’à ce qu’il soit attaché.
    5. Réalignez soigneusement le microtubule de rhodamine le long de l’axe du microtubule du microtubule attaché à la surface en déplaçant l’étape de nanopositionnement et configurez les paramètres pour le tirage automatisé du faisceau de microtubules. Réglez la direction le long de l’axe parallèle des microtubules, réglez la vitesse de traction souhaitée (25-200 nm/s est une plage de vitesses utile) et le temps de traction souhaité (environ 30 s à 2 min) en fonction de la longueur de chevauchement.
    6. Commencez à enregistrer les données de fluorescence dans les trois canaux (488 nm, 561 nm, 640 nm) à une vitesse de 1 à 2 images par seconde. Utilisez les puissances laser et les temps d’exposition optimisés à l’étape 5 ci-dessus.
    7. Lancez le mouvement automatisé de la scène et enregistrez les données de recouvrement à partir du détecteur sensible à la position, de la scène et de l’état de la caméra TIRF. Surveillez tout facteur qui pourrait interférer avec la collecte de données, y compris, sans toutefois s’y limiter, (1) l’entrée d’une autre bille dans le piège, (2) la perte prématurée de la réticulation des microtubules ou (3) le détachement du cordon du microtubule de rhodamine.
    8. Désactivez le piège pour libérer la perle et répétez l’expérience comme vous le souhaitez. Une chambre d’échantillonnage typique peut être utilisée pendant environ 30 minutes avant que la dégradation des faisceaux et la perte d’activité protéique ne se produisent.
      REMARQUE : Les effets de dégradation varient selon le réticulant utilisé, mais peuvent se manifester par la formation de puncta statiques sur les microtubules ou la surface, la perte de fluctuations des microtubules indiquant une liaison non spécifique ou l’incapacité d’attacher de manière stable des billes aux microtubules.

7. Analyse des données et corrélation des images de fluorescence avec les enregistrements de pièges optiques

REMARQUE: Pour optimiser la collecte de données, il est avantageux d’utiliser deux systèmes de contrôle informatique distincts: un pour le logiciel de piégeage optique et un autre pour l’imagerie par fluorescence. Cette configuration permet l’acquisition de données à grande vitesse dans les deux modalités expérimentales et élimine les retards de nanosecondes et microsecondes dans l’exécution des opérations introduits dans les données, qui peuvent survenir lors de l’utilisation d’un seul processeur.

  1. Numériser les données de piégeage optique à un taux optimisé pour les protéines de réticulation motrices ou non motrices utilisées et leurs taux de pas attendus (par exemple, généralement entre 1 et 10 kHz).
  2. Enregistrez les signaux de tension X, Y et SUM du photodétecteur sensible à la position, ainsi que les données de position X, Y et Z de l’étage de nano-positionnement à l’aide d’un logiciel dédié pour contrôler le piège optique et échantillonner les signaux de tension numériques de ces composants.
  3. Enregistrez le signal numérique d’état d’ouverture de l’obturateur de la caméra avec un canal d’entrée de tension supplémentaire sur la carte d’acquisition de données de piégeage optique. Cela permet de corréler les données d’imagerie par fluorescence avec les traces de temps de piégeage optique. Commencez la collecte de données avec le piège optique avant le début de l’imagerie afin que le signal de la caméra de la première image soit correctement enregistré.
  4. Faire la moyenne des données brutes de séries chronologiques acquises à des taux d’échantillonnage élevés à l’aide d’une méthode de filtrage appropriée, telle qu’une fenêtre coulissante, un filtre médian ou un filtre gaussien, selon les besoins.
  5. Quantifier les données de séries chronologiques d’images de fluorescence à l’aide de méthodes telles que l’analyse linéaire, dans laquelle la valeur d’intensité en pixels le long de la région du microtubule est calculée. À partir de ces trajectoires de lignes, identifiez les bords des microtubules et, par conséquent, les régions de chevauchement. En outre, utilisez l’intensité de fluorescence du canal protéique réticulant pour calculer la localisation, la concentration et la densité des protéines.
  6. La corrélation de force et les données d’image sont un résultat essentiel de ce système expérimental. Par exemple, sélectionnez et faites la moyenne de tous les points de données de force dans une zone d’exposition de caméra donnée (indiquée par le pic de signal numérique correspondant dans le canal de la caméra) pour les comparer directement avec le cadre d’image de fluorescence correspondant. Par la suite, extrayez les relations entre l’amplitude de la force et le nombre de protéines de réticulation, la longueur de chevauchement ou la distribution de la réticulation.

Résultats

La préparation de faisceaux de microtubules adaptés à l’analyse biophysique est considérée comme réussie si plusieurs des critères clés sont remplis. Tout d’abord, l’imagerie en trois couleurs devrait révéler deux microtubules alignés avec une concentration de protéine de réticulation décorant préférentiellement la région de chevauchement (Figure 5B, C et Figure 6B). Idéalement, la distance entre le bord ...

Discussion

Les réseaux de microtubules sont utilisés par une myriade de types de cellules pour accomplir un large éventail de tâches qui sont fondamentalement de nature mécanique. Afin de décrire comment les cellules fonctionnent à la fois dans les états sains et pathologiques, il est essentiel de comprendre comment ces réseaux à l’échelle du micron sont organisés et régulés par les protéines de taille nanométrique qui les construisent collectivement. Les outils biophysiques tels que les pinces optiques sont bien ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs souhaitent remercier R21 AG067436 (à JP et SF), T32 AG057464 (à ET) et Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (à SF).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nmIPG PhotonicsYLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applicationsChromaTRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin ConjugateInvitrogen#MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC gradeFisher Scientific18-608-395
Alpha casein from bovine milkSigma1002484390
ATPFisher ScientificBP413-25
BenzonaseNovagen70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio, Inc.NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta CellsMillipore Sigma71-400-3
CatalaseMP Biomedicals LLC190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objectiveNikonN/A
ChloramphenicolACROS Organics227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslipsFisher ScientificC14784
Delicate Task WipersKimberly-Clark34120
Dextrose AnhydrousFisher ScientificBP3501
D-SucroseFisher ScientificBP220-1
DTTFisher ScientificBP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 BathLAUDA-Brinkmann27709
EDTAFisher ScientificBP118-500
EGTAMillipore Corporation32462-25GM
FIJI / Image Jhttps://fiji.sc/N/A
Frosted Microscope SlidesCorning12-553-1075mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose OxidaseMP Biomedicals LLC195196Type VII, without added oxygen
GMPCPPJena BiosciencesJBS-NU-405SCan be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover GlassThermo Scientific3405
HEPESFisher ScientificBP310-500
ImidazoleFisher Scientific03196-500
IPTGFisher ScientificBP1755-10
Laboratory dessicatorBel-Art999320237190mm plate size
Kanamycin SulfateFischer ScientificBP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6HisGilbert Lab, RPIN/Adoi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
KimwipeKimberley ClarkZ188956lint-free tissue
Immersion Oil, Type BCargille16484
Lens TissueThorLabsMC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm)NikonN/A
LysozymeMP Biomedicals LLC100834
Magnesium Acetate TetrahydrateFisher ScientificBP215-500
Microfuge 18Beckman Coulter367160
MPEG-SVA MW-5000Laysan Bio, Inc.NC0107576
NeutravadinInvitrogenPI31000
Nikon Ti-E inverted microscopeNikonN/ANikon LuN4 Laser
Ni-NTA ResinThermo Scientific88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		IDTN/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		IDTN/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mmBeckman Coulter343755
Optima-TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361544
Paclitaxel (Taxol equivalent)Thermo Fisher ScientificP3456
PIPESACROS Organics172615000
PMSFMillipore7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin labelCytoskeleton, Inc.T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 FluorCytoskeleton, Inc.TL670Mfar red labelled
Porcine Tubulin, RhodamineCytoskeleton, Inc.TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin ProteinCytoskeleton, Inc.T240
Potassium AcetateFisher ScientificBP364-500
Prime 95B sCMOS cameraPhotometricN/A
Quadrant Detector Sensor HeadThorLabsPDQ80A
Quikchange Lightning KitAgilent Technologies210518
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Square Cover GlassesCorning12-553-45018 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin MicrospheresPolysciences Inc.24162-1
Superose-6 ColumnGE Healthcare29-0915--96
TCEPThermo Scientific77720
TLA-100 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator)VevorJPS-08A(DD)304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solutionVector LaboratoriesSP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-DS.C. JohnsonSJN695237

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