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摘要

在这里，我们提出了一种在 体外 重建微管束并使用同时光学捕获和全内反射荧光显微镜直接量化施加在其中的力的方案。该测定允许对活性微管网络中蛋白质集合产生的力和位移进行纳米级测量。

摘要

微管网络在细胞中用于完成广泛的任务，从充当囊泡运输的轨道到在有丝分裂期间作为专门的阵列来调节染色体分离。与微管相互作用的蛋白质包括驱动蛋白和动力蛋白等运动，它们可以产生主动力和方向运动，以及将细丝交联成高阶网络或调节细丝动力学的非运动蛋白。迄今为止，微管相关蛋白的生物物理研究主要集中在囊泡转运所需的单个运动蛋白的作用上，并且在阐明驱动蛋白和动力蛋白的力产生特性和机械化学调节方面取得了重大进展。然而，对于微管既充当货物又作为跟踪的过程，例如在有丝分裂纺锤体内的细丝滑动过程中，对所涉及的交联蛋白集合的生物物理调节知之甚少。在这里，我们详细介绍了我们直接探测从纯化的微管和有丝分裂蛋白重建的交联微管最小网络中的力产生和响应的方法。微管对由感兴趣的蛋白质交联，一个微管固定在显微镜盖玻片上，第二个微管由光学陷阱操纵。同时全内反射荧光显微镜允许在细丝滑开以产生力时对该微管网络的所有组件进行多通道可视化。我们还演示了如何使用这些技术来探测驱动蛋白-5集合施加的推动力，以及有丝分裂MAP PRC1交联的滑动微管对之间如何产生粘性制动力。这些测定提供了对纺锤体组装和功能的机制的见解，并且可以更广泛地适用于在不同情况下研究致密微管网络力学，例如神经元和极性上皮细胞的轴突和树突。

引言

细胞利用微管网络执行各种机械任务，从囊泡转运1，2，3到有丝分裂期间的染色体分离4，5，6。许多与微管相互作用的蛋白质，如分子运动蛋白驱动蛋白和动力蛋白，会产生力并受到机械载荷的调节。为了更好地了解这些关键分子的功能，研究人员采用了单分子生物物理方法，如光学捕获和TIRF显微镜，直接监测关键参数，如单个蛋白质的卸载步进速率，合成能力和力-速度关系。最常用的实验几何形状是将运动蛋白直接附着在捕获磁珠上，其球形几何形状和大小模仿经历运动驱动运输的囊泡。许多驱动蛋白，包括驱动蛋白-17，8，9，驱动蛋白-2 10，11，12，驱动蛋白-3 13，14，15，16 驱动蛋白-5 17，18，驱动蛋白-8 19，20，以及动力蛋白和动力蛋白复合物21，22，23，24，25，已经用这些方法进行了研究。

然而，在许多细胞过程中，运动蛋白和非运动蛋白使用微管作为轨道和货物26，27。此外，在这些微管细丝交联成高阶束的情况下，这些蛋白质作为集合而不是单个单元起作用。例如，在分裂的体细胞内，致密的细丝网络自组织以构建有丝分裂纺锤体装置28、29、30。极间主轴微管网络是高度动态的，主要排列为负端指向主轴两极，正端在主轴赤道附近重叠。纺锤体内的细丝由驱动蛋白（例如驱动蛋白-5 31，32，33、驱动蛋白-12 34，35，36 和驱动蛋白-14 37，38，39）或非运动蛋白（例如PRC1 40，41，42，43或NuMA44，45）交联，46.它们在极向通量或中期协调染色体居中或后期47，48，49，50，51，52期间的染色体分离等过程中经常移动或经历机械应力。因此，微米级纺锤体装置通过有丝分裂的完整性依赖于由该相互作用的细丝网络产生和维持的推拉力的精心调节平衡。然而，探测这种机械调节并解释蛋白质集合如何协同工作以协调微管运动并产生正确组装纺锤体所需的力所需的工具最近才被开发出来，我们才刚刚开始了解定义动态微管网络的生物物理规则。

本手稿的目的是展示在 体外重建交联微管对所需的步骤，将这些束固定在显微镜室中，允许同时对微管和交联蛋白进行荧光可视化以及纳米级力测量，并稳健地处理这些数据。我们详细介绍了稳定聚合荧光标记微管所需的步骤，准备用于附着的显微镜盖玻片，制备用于光学捕获实验的聚苯乙烯珠，以及组装交联长丝网络以保持其 体内 功能，同时允许直接生物物理操作。

研究方案

1. 微管的制备

注意:当使用GFP标记的交联蛋白时，微管的红色（例如，罗丹明）和远红色（例如，生物素化的HiLyte647，在文本的其余部分中称为生物素化的远红色）有机荧光团标记效果很好。通过使用高质量的四波段全内反射荧光（TIRF）滤光片，可以在成像过程中实现所有三个通道之间的最小串扰。

  1. 制备GMPCPP微管种子原液
    1. 将 1 mg 未标记的冻干微管蛋白悬浮在 84 μL 冰冷的 1x BRB80（80 mM PIPES、1 mM MgCl2、1 mM EGTA;pH 6.8）中，在使用前加入 DTT 至终浓度 1 mM。将 60 μg 荧光团标记的冻干微管蛋白悬浮在 6 μL 具有 1 mM DTT 的冷 1x BRB80 中。将 60 μg 生物素标记的冻干微管蛋白悬浮在 6 μL 冷 1x BRB80 和 1 mM DTT 中。
    2. 要制备标记比例为 1:10 的非生物素化罗丹明标记的微管蛋白种子原液，请将 84 μL 未标记的微管蛋白、6 μL 荧光团标记的微管蛋白和 10 μL 10 mM GMPCPP 储备溶液加入 0.5 mL 管中。轻轻移液混合均匀，并保持在冰上。
      注意:GMPCPP聚合是这些测定的首选，因为与用GTP聚合或省略紫杉醇相比，微管更稳定并且易于用光学陷阱直接操作。
    3. 要制备荧光标记比例为 1:10 的生物素化远红标记微管蛋白种子原液，请在 0.5 mL 管中加入 80 μL 未标记的微管蛋白、6 μL 荧光团标记的微管蛋白、4 μL 生物素标记的微管蛋白和 10 μL 10 mM GMPCPP 储备溶液。轻轻移液混合均匀，并保持在冰上。将种子在冰上孵育5分钟。
    4. 将微管蛋白溶液转移到适合高速离心的聚碳酸酯管中。将种子原液在2°C下以~350，000× g 离心5分钟，以防止微管聚合并回收上清液以等分试样。该阶段微管蛋白的最终估计浓度为~50μM。
    5. 使用 0.2 mL PCR 管制备 2 μL 等分试样的种子原液，并用液氮快速冷冻。等分试样可在-80°C下储存长达6个月。
  2. 微管聚合
    1. 准备 500 μL 的 1x BRB80 并放在冰上。将生物素化的远红和非生物素化的罗丹明种子原液各放在冰上解冻。
    2. 将种子在冰上孵育5分钟。在孵育期结束时，立即向每个试管中加入 26 μL 的 1x BRB80。如果需要更长的微管，将BRB80的体积增加5-10μL，而对于较短的微管，将聚合体积减少5μL。
    3. 将微管种子储备液在37°C的水浴中孵育1小时。将 298.5 μL 室温 1x BRB80 和 1.5 μL 4 mM 紫杉醇储备溶液混合，制成 20 μM 紫杉醇溶液。准备 300 μL 的 1x BRB80，并将两个试管保持在室温下。
    4. 将适当的高速转子加热至30°C。 这可以在设置为30°C的台式超速离心机中完成。 从水浴中取出微管，并在室温下在工作台上保持10-15分钟。
  3. 微管的澄清
    1. 向微管生长溶液中加入 100 μL 室温 1x BRB80，并通过轻弹试管 ~10 次或轻轻移液混合。将微管生长溶液转移到聚碳酸酯离心管中。
    2. 标记聚碳酸酯管的一侧，相对于离心机的旋转，该侧将朝外。这将有助于定位微管颗粒，由于材料体积小，微管颗粒几乎不可见。
    3. 在30°C下以~350，000× g 离心微管溶液10分钟。 离心后，如果可能，检查装有微管的管是否有沉淀。小心地取出除最后几微升液体以外的所有液体，不要干扰沉淀。如果颗粒不清晰可见，请使用标记作为指南，以避免干扰颗粒所在的区域。
    4. 立即向微管管中加入 100 μL 1x BRB80 + 20 μM 紫杉醇。这可以直接添加到颗粒上;在此阶段，颗粒的破坏不会显着影响澄清过程。
    5. 再次以~350，000× g 离心微管10分钟，注意确保管的标记部分相对于离心机的旋转再次向外定向。
    6. 像以前一样取出除几微升以外的所有溶液，再次小心避免破坏微管沉淀。重复步骤 1.3.4.-1.3.5。然后将微管沉淀重悬于20-50μL的1x BRB80 + 20μM紫杉醇中。
    7. 通过移取大部分重悬体积并将其直接轻轻喷射到沉淀上来重悬，重复 20-30 次或直到沉淀完全重悬。这应该小心完成，以免因过度剧烈的移液而剪切微管。切割移液器吸头以增加开口的大小也有助于减少微管剪切。
    8. 将微管在室温下储存，方法是将试管包裹在箔纸中，以保护荧光团免受光照并保持在工作台上。微管通常在澄清后可以使用2-3天。
  4. 通过显微镜评估微管
    1. 通过混合 1 μL 微管和 9 μL 室温 1x BRB80，制备 1:10 稀释的澄清微管溶液。通过将 10 μL 移液到显微镜载玻片上，然后将盖玻片放在液滴上以形成南瓜，立即对该溶液进行成像。
    2. 确保在使用荧光显微镜和聚焦在与微管稀释液接触的盖玻片表面的100倍物镜上可视化时，在高密度下长度为8-25μm的微管（每个全视场在密集网状中分层数百个）是可见的。

2. 钝化盖玻片的制备

  1. 清洗盖玻片
    1. 将 18 mm x 18 mm 盖玻片放入非反应性塑料架中，然后将每个盖玻片放入 100 mL 烧杯中。在机架中的每个插槽中放置一个盖玻片，因为需要清洁盖玻片的两侧。
    2. 使用浴超声仪超声处理5分钟，按照每个超声循环给定的顺序使用以下50mL溶液:（1）去离子水（电阻率为18.3MΩ-cm），（2）2%Micro-90溶液，（3）去离子水，（4）新鲜制备的0.1M KOH，（5）去离子水（图1A）。确保盖玻片完全被液体覆盖。在超声循环之间，用镊子将盖玻片架在去离子水中上下浸泡 10-20 倍，更换水，然后重复冲洗过程 2 倍，用去离子水冲洗每个盖玻片架。
    3. 用水冲洗盖玻片 3 次，然后用 100% 乙醇重新填充烧杯并将架子放回烧杯。将烧杯移入通风橱，并铺上足够的纸巾，为所有盖玻片架腾出空间。然后，用镊子取下架子并放在纸巾上。
    4. 使用干燥的氮气流，从盖玻片及其架子上吹出乙醇，直到干燥。处理烧杯中剩余的乙醇，并使用干燥的氮气流同样干燥它们（图1A）。
  2. 盖玻片上的氨基硅烷表面官能化
    1. 将 40 mL 丙酮和 400 μL APTES 试剂加入 50 mL 锥形管中，密闭盖住，倒置 10 倍混合，制备 （3-氨丙基）噻乙氧基硅烷 （APTES） 试剂溶液。
    2. 将一排盖玻片移动到相应的干烧杯中，然后完全浸没在APTES溶液中。孵育5分钟（图1A）。将APTES处理的架子移到新的干烧杯中，然后将新架子移入APTES中孵育5米。
    3. 按照步骤2.1.2.所述将架子浸泡10-20倍，更换水5倍，用去离子水冲洗处理过的架子。重复直到所有盖玻片都经过处理和清洗。
  3. 氨基硅烷表面的聚乙二醇化
    1. 制备两种PEG溶液，一种是~100 μL，含25%w/v peg，另一种是~10 μL含10%w/v生物素-PEG，均悬浮在新制备的0.1 M NaHCO3中，足以涂覆24张盖玻片。一旦加入0.1M NaHCO 3，将25%PEG溶液以3 ，000 x g 离心20秒以完全溶解PEG;解决方案可能仍然多云。通过轻柔移液混合生物素-PEG（图1B）。
    2. 制备 PEG 和生物素-PEG 溶液的混合物，将 33.3 倍体积的 PEG 与 1 体积的生物素-PEG 溶液（例如，100 μL PEG 溶液和 3 μL 生物素-PEG 溶液）。
    3. 在通风橱中，摆放几张无菌和不起毛的湿巾。将盖玻片架移到湿巾上，然后像以前一样用干燥的氮气流吹干。在几张新的干纸巾上，将现在已经完全干燥的盖玻片成对排列，并在右下角用不对称符号（如"b"）标记每个盖玻片。该标记将与盖玻片的样品表面相对，并且不会干扰实验（图1B）。
    4. 用镊子翻转每对盖玻片中的一张盖玻片。在每个翻转的盖玻片上，放置 6 μL PEG/生物素-PEG 混合物，并将第二个盖玻片放在顶部，使两个"b"标签朝外。
    5. 对齐盖玻片边缘，并放入加湿和密封的房间以防止干燥。将盖玻片在室温下在湿度室中孵育3小时。
    6. 孵育后，从湿度室中取出盖玻片，小心地分离盖玻片对，然后将它们放回架子中。像以前一样用去离子水清洗每个架子，用镊子浸泡架子 10-20 倍，总共更换 5 倍的水。
    7. 将盖玻片的所有聚乙二醇化面朝同一方向放置，这样就不会有两个聚乙二醇化盖玻片表面彼此面对。聚乙二醇化的表面在完全干燥之前会非常粘，因此要格外小心，以防止盖玻片接触。像以前一样使用干燥的氮气流干燥每个架子和盖玻片（图1B）。
    8. 盖玻片及其架子完全干燥后，存放在真空干燥器中，以防止表面涂层降解。在真空和干燥剂下妥善储存，以防止水分破坏PEG涂层;盖玻片可以使用约1周。

3. 驱动蛋白包被磁珠的制备

  1. 严谨性驱动蛋白构建体的选择与制备
    1. 根据公布的方案表达和纯化严格的驱动蛋白构建体53，54。快速冷冻 5 μL 等分试样的 0.02 mg/mL 驱动蛋白溶液，并在 -80 °C 下储存长达 1 年。
      注意:严谨的驱动蛋白具有G234A点突变，可阻止ATP水解。当与微珠偶联时，与微管的高亲和力相互作用使微球能够维持10-20pN的负载几分钟。常用的驱动蛋白-1同源二聚体K56053 和进一步优化的K439构建体55 的严格突变版本也已在这些测定中成功使用54。这种改进的K439构建体包含一个EB1二聚化结构域以增强稳定性，以及一个C末端6-He标签，用于与6-He抗体特异性结合，如下所述。
  2. 将6-His抗体与链霉亲和素包被的磁珠结合
    1. 将 50 μL 直径为 1 μm 的链霉亲和素包被的聚苯乙烯珠加入 0.5 mL 离心管中。超声处理30秒。
    2. 将 10 μL 的 200 mM DTT 添加到 790 μL 的 1x BRB80 中。将 10 μL 超声处理珠加入 40 μL 的 1x BRB80 + 2.5 mM DTT 缓冲液中。
    3. 混合 1 μL 生物素化的 6-His 抗体和 49 μL 的 1x BRB80 + 2.5 mM DTT;短暂涡旋混合。
    4. 将 50 μL 稀释微球混合物和 50 μL 抗体稀释液合并到新试管中。将管置于4°C的管旋转器中并旋转1小时。在4°C下以3，000× g 旋转珠子混合物10分钟。
    5. 移取上清液并将沉淀重悬于 100 μL 2 mg/mL 酪蛋白溶液中的 1x BRB80 中。重复此离心并重悬2次。
  3. 添加严谨的驱动蛋白
    1. 将最终沉淀重悬于 100 μL 2 mg/mL 酪蛋白溶液中。在 0.5 mL 离心管中，混合 5 μL 0.02 mg/mL 严谨性驱动蛋白和 5 μL 磁珠，轻轻轻弹试管 ~10x，轻轻混合。
    2. 不使用时，将K439 G234A珠悬浮液和转子上剩余的6-He磁珠保持在4°C。珠子必须新鲜制备并在同一天用于实验，因为它们往往会结块并失去活性超过这段时间。

4. 显微镜室的组装

  1. 载玻片的制备和腔室结构
    1. 首先用超纯水冲洗75 mm x 25 mm显微镜载玻片，然后用无条纹氨-d玻璃清洁剂冲洗，然后再次用超纯水冲洗。摇晃以去除多余的水滴。使用氮气流干燥载玻片，使其没有条纹残留，然后将载玻片放在纸巾上（图2A）。
    2. 用剪刀将双面胶带切成~2-3毫米x 2.5厘米的条状（每个单室2条，每个双室3条）。
    3. 使用镊子，将两条胶带放在一个载玻片上，以便在它们之间有~0.5厘米的空间以构建一个腔室。对于双腔室，使用相同的间距，但使用三条胶带（图2B）。使用这种方法的样品通道体积约为10 μL。
      注意:腔室越宽，溶液流入时形成气泡的可能性就越大;然而，由于成像面积减小，小于 0.5 cm 宽的腔室使用起来可能具有挑战性。
    4. 使用镊子刮过每条胶带的长度，使胶带牢固地粘附在载玻片上。
    5. 释放干燥器的压力，用镊子从存储架上取出一个生物素化的盖玻片。使用镊子将一个生物素化的盖玻片放在载玻片的顶部。确保生物素化的一面朝内，朝向载玻片。
    6. 使用镊子的平坦后端，轻轻按压盖玻片接触胶带的玻璃，以牢固地密封腔室。必须使用轻压以确保盖玻片不会破裂（图2C）。
    7. 将完成的显微镜室存放在密封容器中，远离直射光，直到使用（图2D）。
      注意:建议在制造腔室的同一天使用腔室，因为生物素化的盖玻片在暴露在空气中时会降解。
  2. 显微镜试剂的流入
    1. 通过在空移液器吸头盒的底部放置一个折叠起来的无绒纸巾，用超纯水润湿来构建湿度室。样品室应在流入步骤之间保存在该盒子中，以减少溶液从通道中蒸发。
    2. 通过在通道的一端移液液体并在另一端吸出液体来引入所有试剂。吸芯吸芯，扭转组织的一端并将其轻轻放置在腔室的出口侧，允许毛细管作用以均匀分布试剂（图3A）。在流入之前将所有试剂置于室温，以防止微管解聚。
    3. 使用 20 μL 倾斜移液器吸头使其接触一个腔室的入口侧，缓慢流入 10 μL 0.5 mg/mL 链霉亲和素或中性粒细胞亲和素。使用较小的移液器吸头和缓慢、恒定的试剂流入，以减少在腔室中获得气泡的可能性（图 3B）。
    4. 将载玻片在湿度室中孵育4分钟，室的盖玻片侧朝下。这种取向将允许较大的物体，如微管或珠子，在聚乙二醇化表面附近下沉。
    5. 使用 20 μL 的 1x BRB80 冲洗腔室，使用不起毛的纸巾抽出液体。如果腔室中存在泄漏，请丢弃载玻片并从另一张载玻片开始;腔室中出现的小气泡不会对成像产生不利影响。
    6. 用 10 μL 0.5 mg/mL 酪蛋白封闭溶液重复流入、孵育和冲洗步骤（图 3C）。稀释生物素化的远红微管~1:20，并将10μL流入腔室。孵育 5 分钟，并用 20 μL 的 1x BRB80 冲洗腔室（图 3D）。这些微管在100μm x 100μm成像视野内的最佳密度应为10-20;并且应调整此阶段的稀释度以达到此表面结合比例。
    7. 用 10 μL 适当浓度（通常为 1-10 nM）交联运动蛋白或待研究的非运动蛋白重复流入、孵育和冲洗步骤（图 3E）。
    8. 将 10 μL 罗丹明微管稀释至与先前生物素化的远红微管相似的浓度。重复孵育和冲洗步骤（图3F）。
    9. 将 1 μL 严谨的驱动蛋白包被微球和 19 μL 针对交联蛋白活性优化的反应缓冲液混合。例如，为了分析驱动蛋白-5活性，使用反应缓冲液和1 mM TCEP键断裂剂，0.2 mg/mLα酪蛋白，70 mM KCl，除氧系统（4.5 mg/mL葡萄糖，350单位/mL葡萄糖氧化酶，34单位/mL过氧化氢酶），1 mM DTT和ATP，在1x BRB80中以所需浓度（例如，1 mM表示最大驱动蛋白速度条件）（图3G）).对于非运动蛋白的分析，省略ATP并改变KCl的浓度以调节这些测定中的蛋白质 - 微管相互作用强度。
    10. 用透明的指甲油密封腔室的两边缘，并等待抛光剂干燥后再成像（图3H）。成功建造的腔室将不存在泄漏和最小的气泡。

5. 具有 3 色 TIRF 的成像微管束

  1. 采用具有TIRF成像功能的倒置显微镜仪器，并在其中构建了单光束光学陷阱（图4）。
    注意:对于此处描述的研究，倒置显微镜与100x/NA1.49油物镜，TIRF模块和三个488 nm，561 nm和640 nm的激光器分别用于GFP标记的蛋白质，罗丹明标记的微管和生物素化的远红色标记微管。
    1. 在样品室的盖玻片上加入一滴浸油。过多的油可能会损坏显微镜物镜。样品室的盖玻片面朝下，将要成像的样品放在显微镜平台上。
    2. 慢慢抬起物镜，使盖玻片和物镜之间通过油接触。调整物镜高度，使样品室的盖玻片表面聚焦。
    3. 在所有三个通道中记录样品的单帧图像。对于此处的实验，使用100-200毫秒的曝光作为所有三个通道的最佳成像持续时间;较长的曝光时间可能导致光漂白增加。
    4. 调整激光功率以从样品中获得良好的信噪比，同时在测定单个束时在2-5分钟内最大限度地减少光漂白。对于此处使用的激光器（图4和图 5），GFP通道使用 5 mW的激光功率，两个微管通道的激光功率为3 mW作为最佳选择。
      注意:成功组装的束应由远红色通道中的一个表面固定微管、具有显着 GFP 蛋白信号的几微米共宽区域以及重叠这些区域的罗丹明微管组成，然后从束延伸几微米（图 5B、C 和 图 6).罗丹明微管的实时成像应显示非交联微管末端的细微波动，表明该细丝未附着在腔室中的表面或其他蛋白质上。
    5. 观察每个视野的微管束的频率。对于成功制备的样品，每个腔室每 100 μL x 100 μL 视场中应存在大约 3-4 个微管束。

6. 对微管束进行光学陷阱实验

  1. 条件的实验前校准
    1. 为了进行这些实验，请使用刚度为0.05-0.1 pN / nm的单光束光学陷阱。通过分别在物镜下方和聚光镜上方引入短通滤光片，将捕获光学元件和位置敏感光电探测器集成到具有TIRF功能的倒置显微镜中（图4）。
    2. 此外，添加样品所在的纳米定位平台，以允许用户在这些测定过程中以受控方式以纳米级精度移动微管。这里用于获取代表性数据的系统已在已发表的著作27，53，54，56，57中描述。
      注意:虽然超出了本协议的范围，但有多种资源可用，详细说明单光束光学陷阱58，59，60的构造和校准。
    3. 使用明场或DIC通道以及显微镜上的100倍物镜观察样品中珠子的密度。仅使用明场显微镜来识别和操作磁珠，而不能同时记录荧光图像采集。将磁珠平均间隔至少为10μm，并确保它们不受任何类型的表面限制或附着，并且不会相互附着或以其他方式聚集。
    4. 确保生物素化的远红色微管牢固地附着在盖玻片的表面上，没有可见的布朗运动，例如沿微管轴的运动或微管的自由端在溶液中波动。
    5. 确保罗丹明微管通过交联MAP连接到生物素化的微管上，并且在其自由端明显波动。非生物素化微管的表面附着通常表明聚乙二醇化可能不成功或PEG涂层已降解。
  2. 电机驱动微管滑动测量
    1. 按照公布的方案表达和纯化感兴趣的运动蛋白。例如，全长GFP标记的驱动蛋白-5蛋白已成功纯化并用于这些测定53，61，以及未标记的驱动蛋白-12 62和驱动蛋白-14 63。组装和可视化运动蛋白交联束，如上述步骤4和5中所述。
    2. 用光学陷阱捕获溶液中表现出布朗运动的游离单个珠子。根据需要调整陷印光学元件，将磁珠移动到视野中间。确保来自捕获光束的反射干涉图案是对称的，并调整捕获光学器件以解决任何光束不对称问题。
    3. 移动样品台，使束内罗丹明微管的自由端直接位于磁珠下方，并且磁珠距离含有交联蛋白的重叠区域几微米，以最大限度地减少捕获束诱导的光漂白。降低Z轴上的珠子，直到它与微管碰撞。注意轻轻降低珠子，不要将珠子推到盖玻片表面，因为这会导致粘附在盖玻片表面。
    4. 短暂关闭陷阱，用明场通道观察附着在滑动微管上的珠子的运动性。在进行运动蛋白测定时，附着的磁珠将随着微管滑动而定向移动。重新激活陷阱并再次捕获珠子。
    5. 使用上述步骤5中优化的激光功率和曝光时间，以每秒1-2帧的速率开始在三个（488 nm，561 nm，640 nm）通道中记录荧光数据。
    6. 使用捕获计算机软件，记录来自位置敏感光电探测器（X，Y和SUM强度信号），纳米定位平台（X，Y和Z坐标）和TIRF相机快门状态的电压数据。根据实验要求，使用由适当软件（如自定义编写的LabView代码）控制的专用电压输入数据采集板，以1-10 kHz的速率开始对这些陷阱电压值进行数字化。
    7. 在获取数据时监控力信号，并密切注意任何可能干扰成功数据收集的异常情况。
      注意:异常包括但不限于（1）其他珠子移动到陷阱中，（2）珠子过早逃离陷阱，以及（3）力突然骤降，随后无法重新对陷阱发起力，表明磁珠表面的严谨驱动蛋白分子存在问题。
    8. 测量后，停用陷阱以释放磁珠并用新珠子和新微管重复，直到达到所需的实验重复次数。
  3. 被动交联电阻测量
    1. 按照公布的方案表达和纯化感兴趣的非运动交联蛋白。例如，全长GFP标记的PRC143，54，57和二聚体NuMA截短构建体56已成功用于这些测定。按照上述步骤4和5中所述组装和可视化交联束。
    2. 确定一个合适的微管束，该微管束仅包含两个微管，一个具有全表面附着的生物素化，另一个非生物素化的微管在溶液中部分游离;这提供了连接磁珠的自由端，并保证磁珠不附着在表面结合的微管上，并且在X轴或Y轴上对齐，使得载物台运动仅沿一个轴。
    3. 使用光学陷阱捕获经历布朗运动的自由珠子。一旦磁珠被捕获，小心地将磁珠移动到选定的微管束上，确保在此过程中没有其他磁珠被拉入陷阱。确保磁珠距离含有交联蛋白的重叠区域几微米，以尽量减少GFP标签的光漂白。
    4. 小心地降低Z轴上的珠子，直到它与罗丹明微管的自由段的边缘接触。轻轻向上拉并垂直于微管轴移动，通过观察罗丹明微管弯曲并跟随珠子位置来检查附着。如果未附着，则重复珠子在微管上的轻轻撞击，直到附着。
    5. 通过移动纳米定位平台，沿着表面附着微管的微管轴小心地重新对齐罗丹明微管，并设置自动拉动微管束的参数。沿微管平行轴设置方向，根据重叠长度设置所需的拉动速度（25-200 nm / s是有用的速度范围）和所需的拉力时间（约30 s至2分钟）。
    6. 开始以每秒1-2帧的速度在三个（488 nm，561 nm，640 nm）通道中记录荧光数据。使用上述步骤5中优化的激光功率和曝光时间。
    7. 启动自动载物台运动，并记录来自位置敏感探测器、载物台和 TIRF 相机状态的捕获数据。监测可能干扰数据收集的任何因素，包括但不限于（1）另一个珠子进入陷阱，（2）微管交联过早丢失，或（3）磁珠从罗丹明微管中脱离。
    8. 停用陷阱以释放珠子并根据需要重复实验。典型的样品室可以使用约30分钟，然后束降解并发生蛋白质活性损失。
      注意:降解效果因使用的交联剂而异，但可以表现为在微管或表面上形成静态点，微管波动的丧失表明非特异性结合，或无法稳定地将珠子附着到微管上。

7. 数据分析和荧光图像与光学陷阱记录的相关性

注意:为了优化数据收集，最好使用两个独立的计算机控制系统:一个用于光学捕获软件，另一个用于荧光成像。此设置允许在两种实验模式下进行高速数据采集，并消除了在操作执行中引入数据的纳秒和微秒延迟，这些延迟在使用单个CPU时可能出现。

  1. 以针对所采用的电机或非运动交联蛋白及其预期的步进速率（例如，通常在 1-10 kHz 之间）优化的速率数字化光学捕获数据。
  2. 使用专用软件记录来自位置敏感光电探测器的 X、Y 和 SUM 电压信号，以及纳米定位平台的 X、Y 和 Z 位置数据，用于控制光阱并对来自这些组件的数字电压信号进行采样。
  3. 使用光学捕获数据采集板上的附加电压输入通道记录来自相机的快门打开状态数字信号。这允许荧光成像数据与光学捕获时间轨迹相关联。在开始成像之前，使用光学陷阱开始数据收集，以便正确记录来自第一帧的相机信号。
  4. 根据需要，使用适当的滤波方法（如滑动窗口、中值滤波器或高斯滤波器）对以高采样率采集的原始时间序列数据求平均值。
  5. 使用诸如线扫描分析的方法量化荧光图像时间序列数据，其中沿微管区域的长度计算像素强度值。从这些线扫描轨迹中，识别微管边缘，从而识别重叠区域。此外，使用交联剂蛋白质通道的荧光强度来计算蛋白质定位、浓度和密度。
  6. 力和图像数据的相关性是该实验系统的基本输出。例如，选择并平均给定相机曝光区域内的所有力数据点（由相机通道中相应的数字信号尖峰指示），以直接与相应的荧光图像帧进行比较。随后，提取力大小与交联蛋白数量、重叠长度或交联剂分布之间的关系。

结果

如果满足几个关键标准，则认为制备适合生物物理分析的微管束是成功的。首先，三种颜色的成像应显示两个排列的微管，其中交联蛋白的浓度优先装饰重叠区域（图5B，C和图6B）。理想情况下，罗丹明微管的重叠边缘和自由端之间的距离应至少为5μm，以便在捕获束和荧光标记的蛋白质之间提供足够的物理空间。其次，在缺乏...

讨论

微管网络被无数细胞类型用于完成广泛的任务，这些任务本质上基本上是机械的。为了描述细胞在健康和疾病状态下的功能，了解这些微米级网络如何由共同构建它们的纳米级蛋白质组织和调节至关重要。光学镊子等生物物理工具非常适合以这种规模探测关键蛋白质的机械化学。为了反映微管网络功能的多样性，已经探索了使用光学镊子的复杂实验几何形状，包括微管尖端动力学的力依赖性分析<...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者希望感谢R21 AG067436（对JP和SF），T32 AG057464（对ET）和伦斯勒理工学院科学学院启动基金（对SF）的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nmIPG PhotonicsYLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applicationsChromaTRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin ConjugateInvitrogen#MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC gradeFisher Scientific18-608-395
Alpha casein from bovine milkSigma1002484390
ATPFisher ScientificBP413-25
BenzonaseNovagen70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio, Inc.NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta CellsMillipore Sigma71-400-3
CatalaseMP Biomedicals LLC190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objectiveNikonN/A
ChloramphenicolACROS Organics227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslipsFisher ScientificC14784
Delicate Task WipersKimberly-Clark34120
Dextrose AnhydrousFisher ScientificBP3501
D-SucroseFisher ScientificBP220-1
DTTFisher ScientificBP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 BathLAUDA-Brinkmann27709
EDTAFisher ScientificBP118-500
EGTAMillipore Corporation32462-25GM
FIJI / Image Jhttps://fiji.sc/N/A
Frosted Microscope SlidesCorning12-553-1075mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose OxidaseMP Biomedicals LLC195196Type VII, without added oxygen
GMPCPPJena BiosciencesJBS-NU-405SCan be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover GlassThermo Scientific3405
HEPESFisher ScientificBP310-500
ImidazoleFisher Scientific03196-500
IPTGFisher ScientificBP1755-10
Laboratory dessicatorBel-Art999320237190mm plate size
Kanamycin SulfateFischer ScientificBP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6HisGilbert Lab, RPIN/Adoi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
KimwipeKimberley ClarkZ188956lint-free tissue
Immersion Oil, Type BCargille16484
Lens TissueThorLabsMC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm)NikonN/A
LysozymeMP Biomedicals LLC100834
Magnesium Acetate TetrahydrateFisher ScientificBP215-500
Microfuge 18Beckman Coulter367160
MPEG-SVA MW-5000Laysan Bio, Inc.NC0107576
NeutravadinInvitrogenPI31000
Nikon Ti-E inverted microscopeNikonN/ANikon LuN4 Laser
Ni-NTA ResinThermo Scientific88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		IDTN/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		IDTN/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mmBeckman Coulter343755
Optima-TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361544
Paclitaxel (Taxol equivalent)Thermo Fisher ScientificP3456
PIPESACROS Organics172615000
PMSFMillipore7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin labelCytoskeleton, Inc.T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 FluorCytoskeleton, Inc.TL670Mfar red labelled
Porcine Tubulin, RhodamineCytoskeleton, Inc.TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin ProteinCytoskeleton, Inc.T240
Potassium AcetateFisher ScientificBP364-500
Prime 95B sCMOS cameraPhotometricN/A
Quadrant Detector Sensor HeadThorLabsPDQ80A
Quikchange Lightning KitAgilent Technologies210518
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Square Cover GlassesCorning12-553-45018 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin MicrospheresPolysciences Inc.24162-1
Superose-6 ColumnGE Healthcare29-0915--96
TCEPThermo Scientific77720
TLA-100 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator)VevorJPS-08A(DD)304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solutionVector LaboratoriesSP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-DS.C. JohnsonSJN695237

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