재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

요약

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

초록

미세소관 네트워크는 소포 수송을 위한 트랙 역할을 하는 것부터 유사분열 동안 염색체 분리를 조절하기 위한 특수 어레이로 작동하는 것까지 광범위한 작업을 수행하기 위해 세포에 사용됩니다. 미세소관과 상호작용하는 단백질에는 활성력과 방향 운동을 생성할 수 있는 키네신 및 다인(dynein)과 같은 모터뿐만 아니라 필라멘트를 고차 네트워크로 가교결합하거나 필라멘트 역학을 조절하는 비모터 단백질이 포함됩니다. 현재까지 미세소관 관련 단백질에 대한 생물물리학적 연구는 소포 수송에 필요한 단일 운동 단백질의 역할에 압도적으로 초점을 맞추었으며, 키네신 및 다인인의 힘 생성 특성 및 기계화학적 조절을 밝히는 데 상당한 진전이 있었습니다. 그러나 유사분열 방추 내에서 필라멘트가 미끄러지는 동안과 같이 미세소관이 화물과 트랙 모두에서 작용하는 공정의 경우 관련된 가교 단백질 앙상블의 생물물리학적 조절에 대해서는 훨씬 덜 이해됩니다. 여기에서는 정제된 미세소관과 유사분열 단백질로 구성된 가교 미세소관 최소 네트워크 내에서 힘 생성 및 반응을 직접 프로빙하는 방법론에 대해 자세히 설명합니다. 미세소관 쌍은 관심 단백질에 의해 가교되고, 하나의 미세소관은 현미경 커버슬립에 고정되고, 두 번째 미세소관은 광학 트랩에 의해 조작됩니다. 동시 전반사 형광 현미경을 사용하면 필라멘트가 떨어져 힘을 생성할 때 이 미세소관 네트워크의 모든 구성 요소를 다채널 시각화할 수 있습니다. 또한 이러한 기술을 사용하여 키네신-5 앙상블이 가하는 미는 힘을 조사하는 방법과 유사분열 MAP PRC1에 의해 가교된 슬라이딩 미세소관 쌍 사이에서 점성 제동력이 어떻게 발생하는지 보여줍니다. 이러한 분석은 스핀들 조립 및 기능의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하며 뉴런 및 극성 상피 세포의 축삭 및 수상 돌기와 같은 다양한 맥락에서 조밀 한 미세 소관 네트워크 역학을 연구하는 데 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.

서문

세포는 미세소관 네트워크를 사용하여 소포 수송 ^1,2,3에서 유사분열 4,5,6 동안 염색체 분리에 이르기까지 다양한 기계적 작업을 수행합니다. 분자 운동 단백질 키네신 및 다인(dynein)과 같이 미세소관과 상호 작용하는 많은 단백질은 힘을 생성하고 기계적 부하에 의해 조절됩니다. 이러한 중요한 분자가 어떻게 기능하는지 더 잘 이해하기 위해 연구자들은 광학 트래핑 및 TIRF 현미경과 같은 단일 분자 생물 물리학 적 방법을 사용하여 무부하 스테핑 속도, 처리 성 및 개별 단백질에 대한 힘-속도 관계와 같은 중요한 매개 변수를 직접 모니터링했습니다. 가장 일반적으로 사용되는 실험 기하학은 구형 기하학과 크기가 모터 구동 수송을 받는 소포를 모방한 트래핑 비드에 모터 단백질을 직접 부착하는 것이었습니다. 키네신 -1 7,8,9, 키네신 -2 10,11,12, 키네 신 -3^{13,14,15,....}

프로토콜

1. 미세소관의 제조

참고: GFP 표지된 가교 단백질을 사용할 때 미세소관의 적색(예: 로다민) 및 원적색(예: 비오티닐화된 HiLyte647, 텍스트의 나머지 부분에서 비오티닐화된 원적색이라고 함)이 잘 작동합니다. 고품질 쿼드 밴드 전반사 형광(TIRF) 필터를 사용하여 이미징 중에 세 채널 간의 누화를 최소화할 수 있습니다.

1. GMPCPP 미세소관 종자 재고 준비
   1. 84 μL의 얼음처럼 차가운 1x BRB80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA; pH 6.8)에 표지되지 않은 동결 건조 튜불린 1 mg을 현탁시키고, DTT를 사용 직전에 최종 농도 1 mM에 첨가합니다. 60 μg의 형광단 표지된 동결건조된 튜불린을 1 mM DTT의 차가운 1x BRB80 6 μL에 현탁합니다. 60 μg의 비오틴 표지 동결건조된 튜불린을 1 mM DTT와 함께 6 μL의 차가운 1x BRB80에 현탁합니다.
   2. 표지 비율이 1:10인 비오티닐화 로다민 표지 튜불린 종자 스톡을 준비하려면 표지되지 않은 튜불린 84μL, 형광단 표지된 튜불린 6μL 및 10mM GMPCPP 스톡 용액 10μL를 0.5mL 튜브에 추가합니다. 부드럽게....

결과

생물 물리학 적 분석에 적합한 미세 소관 번들의 준비는 몇 가지 주요 기준이 충족되면 성공한 것으로 간주됩니다. 첫째, 세 가지 색상의 이미징은 중첩 영역을 우선적으로 장식하는 가교 단백질 농도를 가진 두 개의 정렬 된 미세 소관을 나타내야합니다 (그림 5B, C 및 그림 6B). 이상적으로, 로다민 미세소관의 중첩 가장자리와 .......

토론

미세소관 네트워크는 본질적으로 근본적으로 기계적인 광범위한 작업을 수행하기 위해 무수한 세포 유형에 사용됩니다. 세포가 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 어떻게 기능하는지 설명하려면 이러한 미크론 규모의 네트워크가 집합적으로 구축하는 나노미터 크기의 단백질에 의해 어떻게 구성되고 조절되는지 이해하는 것이 중요합니다. 광학 핀셋과 같은 생물물리학적 도구는 이 규모에서 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm	IPG Photonics	YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications	Chroma	TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate	Invitrogen	#MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade	Fisher Scientific	18-608-395
Alpha casein from bovine milk	Sigma	1002484390
ATP	Fisher Scientific	BP413-25
Benzonase	Novagen	70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000	Laysan Bio, Inc.	NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells	Millipore Sigma	71-400-3
Catalase	MP Biomedicals LLC	190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective	Nikon	N/A
Chloramphenicol	ACROS Organics	227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips	Fisher Scientific	C14784
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark	34120
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP3501
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
DTT	Fisher Scientific	BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath	LAUDA-Brinkmann	27709
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
EGTA	Millipore Corporation	32462-25GM
FIJI / Image J	https://fiji.sc/	N/A
Frosted Microscope Slides	Corning	12-553-10	75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase	MP Biomedicals LLC	195196	Type VII, without added oxygen
GMPCPP	Jena Biosciences	JBS-NU-405S	Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass	Thermo Scientific	3405
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Imidazole	Fisher Scientific	03196-500
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
Laboratory dessicator	Bel-Art	999320237	190mm plate size
Kanamycin Sulfate	Fischer Scientific	BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His	Gilbert Lab, RPI	N/A	doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe	Kimberley Clark	Z188956	lint-free tissue
Immersion Oil, Type B	Cargille	16484
Lens Tissue	ThorLabs	MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm)	Nikon	N/A
Lysozyme	MP Biomedicals LLC	100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate	Fisher Scientific	BP215-500
Microfuge 18	Beckman Coulter	367160
MPEG-SVA MW-5000	Laysan Bio, Inc.	NC0107576
Neutravadin	Invitrogen	PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope	Nikon	N/A	Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC	IDT	N/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG	IDT	N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm	Beckman Coulter	343755
Optima-TLX Ultracentrifuge	Beckman Coulter	361544
Paclitaxel (Taxol equivalent)	Thermo Fisher Scientific	P3456
PIPES	ACROS Organics	172615000
PMSF	Millipore	7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label	Cytoskeleton, Inc.	T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor	Cytoskeleton, Inc.	TL670M	far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine	Cytoskeleton, Inc.	TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein	Cytoskeleton, Inc.	T240
Potassium Acetate	Fisher Scientific	BP364-500
Prime 95B sCMOS camera	Photometric	N/A
Quadrant Detector Sensor Head	ThorLabs	PDQ80A
Quikchange Lightning Kit	Agilent Technologies	210518
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Square Cover Glasses	Corning	12-553-450	18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres	Polysciences Inc.	24162-1
Superose-6 Column	GE Healthcare	29-0915--96
TCEP	Thermo Scientific	77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor	Beckman Coulter	343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator)	Vevor	JPS-08A(DD)	304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution	Vector Laboratories	SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D	S.C. Johnson	SJN695237