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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para reconstituir feixes de microtúbulos in vitro e quantificar diretamente as forças exercidas dentro deles usando aprisionamento óptico simultâneo e microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Este ensaio permite a medição em nível de nanoescala das forças e deslocamentos gerados por conjuntos de proteínas dentro de redes ativas de microtúbulos.

Resumo

As redes de microtúbulos são empregadas nas células para realizar uma ampla gama de tarefas, que vão desde atuar como trilhas para o transporte de vesículas até trabalhar como matrizes especializadas durante a mitose para regular a segregação cromossômica. As proteínas que interagem com os microtúbulos incluem motores como cinesinas e dineína, que podem gerar forças ativas e movimento direcional, bem como proteínas não motoras que reticulam filamentos em redes de ordem superior ou regulam a dinâmica do filamento. Até o momento, os estudos biofísicos de proteínas associadas a microtúbulos se concentraram esmagadoramente no papel das proteínas motoras únicas necessárias para o transporte de vesículas, e progressos significativos foram feitos na elucidação das propriedades geradoras de força e regulação mecanoquímica de cinesinas e dineínas. No entanto, para processos em que os microtúbulos atuam tanto como carga quanto como trilha, como durante o deslizamento do filamento dentro do fuso mitótico, muito menos se entende sobre a regulação biofísica dos conjuntos das proteínas de reticulação envolvidas. Aqui, detalhamos nossa metodologia para sondar diretamente a geração de força e a resposta dentro de redes mínimas de microtúbulos reticulados reconstituídas a partir de microtúbulos purificados e proteínas mitóticas. Os pares de microtúbulos são reticulados por proteínas de interesse, um microtúbulo é imobilizado para uma tampa de microscópio e o segundo microtúbulo é manipulado por uma armadilha óptica. A microscopia de fluorescência de reflexão interna total simultânea permite a visualização multicanal de todos os componentes desta rede de microtúbulos à medida que os filamentos se afastam para gerar força. Também demonstramos como essas técnicas podem ser usadas para sondar forças de empurrão exercidas por conjuntos de cinesina-5 e como forças de frenagem viscosas surgem entre pares de microtúbulos deslizantes reticulados pelo MAP mitótico PRC1. Esses ensaios fornecem insights sobre os mecanismos de montagem e função do fuso e podem ser mais amplamente adaptados para estudar a mecânica da rede de microtúbulos densos em diversos contextos, como o axônio e os dendritos dos neurônios e das células epiteliais polares.

Introdução

As células empregam redes de microtúbulos para realizar uma ampla variedade de tarefas mecânicas, que vão desde o transporte de vesículas 1,2,3 até a segregação cromossômica durante a mitose 4,5,6. Muitas das proteínas que interagem com os microtúbulos, como as proteínas motoras moleculares cinesina e dineína, geram forças e são reguladas por cargas mecânicas. Para entender melhor como essas moléculas críticas funcionam, os pesquisadores empregaram métodos biofísicos de molécula única, como aprisionamento óptico e microscopia TIRF, para monitorar diretamente parâmetros críticos, como taxas de passo descarregadas, processividade e relações força-velocidade para proteínas individuais. A geometria experimental mais comumente usada tem sido anexar proteínas motoras diretamente a contas de aprisionamento cuja geometria e tamanho esféricos imitam vesículas submetidas a transporte acionado por motor. Numerosas cinesinas, incluindo cinesina-1 7,8,9, cinesina-2 10,11,12, cinesina-3 13,14,15,16 cinesina-517,18, cinesina-8 19,20, bem como dineína e complexos de dineína21,22, 23,24,25, têm sido estudados com esses métodos.

Em muitos processos celulares, no entanto, proteínas motoras e não motoras utilizam microtúbulos tanto como esteira quanto como carga26,27. Além disso, nesses cenários em que os filamentos de microtúbulos são reticulados em feixes de ordem superior, essas proteínas funcionam como conjuntos em vez de unidades únicas. Por exemplo, dentro de células somáticas em divisão, redes de filamentos densos se auto-organizam para construir o aparelho fusiforme mitótico28,29,30. A rede de microtúbulos do fuso interpolar é altamente dinâmica e é amplamente organizada com extremidades inferiores apontando para os polos do fuso e extremidades superiores sobrepostas perto do equador do fuso. Os filamentos dentro do fuso são reticulados por proteínas motoras como a cinesina-5 31,32,33, a cinesina-12 34,35,36 e a cinesina-1437,38,39, ou por proteínas não motoras como a PRC1 40,41,42,43 ou a NuMA 44,45, 46. Eles frequentemente se movem ou experimentam estresse mecânico durante processos como o fluxo em direção aos polos ou durante a coordenação da centralização cromossômica durante a metáfase ou segregação cromossômica durante a anáfase 47,48,49,50,51,52. A integridade do aparelho fusiforme em escala mícron através da mitose, portanto, depende de um equilíbrio cuidadosamente regulado de forças de empurrar e puxar geradas e sustentadas por essa rede de filamentos que interagem. No entanto, as ferramentas necessárias para investigar essa regulação mecânica e explicar como os conjuntos de proteínas funcionam em conjunto para coordenar os movimentos dos microtúbulos e produzir as forças necessárias para montar adequadamente o fuso só recentemente foram desenvolvidas, e estamos apenas começando a entender as regras biofísicas que definem as redes dinâmicas de microtúbulos.

O objetivo deste manuscrito é demonstrar as etapas necessárias para reconstituir pares de microtúbulos reticulados in vitro, imobilizar esses feixes em uma câmara de microscopia que permita a visualização simultânea por fluorescência dos microtúbulos e proteínas reticuladas e medição de força em nanoescala, e processar esses dados de forma robusta. Detalhamos as etapas necessárias para polimerizar de forma estável os microtúbulos marcados com fluorescência, preparar as tampas do microscópio para fixação, preparar contas de poliestireno para experimentos de aprisionamento óptico e montar redes de filamentos reticulados que preservam sua funcionalidade in vivo , permitindo a manipulação biofísica direta.

Protocolo

1. Preparação de microtúbulos

NOTA: Ao empregar proteínas de reticulação marcadas com GFP, vermelho (por exemplo, rodamina) e vermelho-distante (por exemplo, HiLyte biotinilado647, referido como biotinilado muito vermelho no resto do texto), a marcação de fluoróforo orgânico dos microtúbulos funciona bem. O crosstalk mínimo entre os três canais pode ser alcançado durante a imagem usando um filtro de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) de banda quádrupla de alta qualidade.

  1. Preparar estoques de sementes de microtúbulos GMPCPP
    1. Suspender 1 mg de tubulina liofilizada não marcada em 84 μL de 1x BRB80 gelado (PIPES 80 mM, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA; pH 6,8), com TDT adicionado a uma concentração final de 1 mM imediatamente antes do uso. Suspender 60 μg de tubulina liofilizada marcada com fluoróforo em 6 μL de frio 1x BRB80 com 1 mM de TDT. Suspender 60 μg de tubulina liofilizada marcada com biotina em 6 μL de frio 1x BRB80 com 1 mM de TDT.
    2. Para preparar o estoque de sementes de tubulina não biotinilada marcada com rodamina com uma proporção de rotulagem de 1:10, adicione 84 μL de tubulina não marcada, 6 μL de tubulina marcada com fluoróforo e 10 μL de solução de estoque GMPCPP de 10 mM a um tubo de 0,5 mL. Misture bem pipetando suavemente e mantenha no gelo.
      NOTA: A polimerização GMPCPP é preferida para estes ensaios, uma vez que os microtúbulos são mais estáveis e passíveis de manipulação direta com o purgador óptico do que se polimerizados com GTP ou se o taxol for omitido.
    3. Para preparar o estoque de sementes de tubulina biotinilada com marcação vermelha distante com uma proporção de marcação fluorescente de 1:10, adicione 80 μL de tubulina não marcada, 6 μL de tubulina marcada com fluoróforo, 4 μL de tubulina marcada com biotina e 10 μL de solução de estoque GMPCPP de 10 mM em um tubo de 0,5 mL. Misture bem pipetando suavemente e mantenha no gelo. Incubar o estoque de sementes no gelo por 5 min.
    4. Transfira a solução de tubulina para um tubo de policarbonato apropriado para centrifugação de alta velocidade. Centrifugar o estoque de sementes a ~350.000 x g por 5 min a 2 °C para evitar a polimerização de microtúbulos e recuperar o sobrenadante para alíquota. A concentração final estimada de tubulina nesta fase é de ~50 μM.
    5. Usando tubos de PCR de 0,2 mL, prepare alíquotas de 2 μL do estoque de sementes e congele com nitrogênio líquido. As alíquotas podem ser armazenadas a -80 °C por até 6 meses.
  2. Polimerização de microtúbulos
    1. Prepare 500 μL de 1x BRB80 e coloque no gelo. Coloque uma de cada uma das alíquotas de sementes de rodamina biotiniladas muito vermelhas e não biotiniladas no gelo para descongelar.
    2. Incube os estoques de sementes no gelo por 5 min. Ao final do período de incubação, adicione imediatamente 26 μL de 1x BRB80 a cada tubo. Se microtúbulos mais longos forem desejados, aumente o volume de BRB80 em 5-10 μL, enquanto, para microtúbulos mais curtos, reduza o volume para polimerização em 5 μL.
    3. Incubar as reservas de sementes de microtúbulos durante 1 h a 37 °C em banho-maria. Combine 298,5 μL de temperatura ambiente 1x BRB80 e 1,5 μL de solução de estoque de taxol de 4 mM para produzir uma solução de taxol de 20 μM. Prepare 300 μL de 1x BRB80 e mantenha ambos os tubos à temperatura ambiente.
    4. Aqueça um rotor de alta velocidade apropriado a 30 °C. Isso pode ser feito em uma ultracentrífuga de mesa ajustada para 30 °C. Remova os microtúbulos do banho-maria e mantenha à temperatura ambiente em uma bancada por 10-15 min.
  3. Clarificação dos microtúbulos
    1. Adicione 100 μL de temperatura ambiente 1x BRB80 à solução de crescimento de microtúbulos e misture agitando o tubo ~10 vezes ou pipetando suavemente. Transfira a solução de crescimento de microtúbulos para um tubo de centrífuga de policarbonato.
    2. Marque um lado do tubo de policarbonato, que estará voltado para fora em relação à rotação da centrífuga. Isso ajudará na localização do pellet de microtúbulos, que será pouco visível devido ao pequeno volume de material.
    3. Centrifugar a solução de microtúbulos a ~350.000 x g durante 10 min a 30 °C. Após a centrifugação, inspecione o tubo que contém os microtúbulos em busca de um pellet, se possível. Remova todos, exceto os microlitros finais de líquido com cuidado, sem perturbar o pellet. Se o pellet não estiver claramente visível, use a marcação feita como um guia para evitar perturbar a área onde o pellet está localizado.
    4. Adicione imediatamente 100 μL de 1x taxol BRB80 + 20 μM ao tubo de microtúbulos. Isso pode ser adicionado diretamente ao pellet; A interrupção do pellet nesta fase não afeta significativamente o processo de clarificação.
    5. Centrifugar os microtúbulos novamente a ~350.000 x g por 10 min, tendo o cuidado de garantir que a seção marcada do tubo seja novamente orientada para fora em relação à rotação da centrífuga.
    6. Remova todos, exceto alguns microlitros de solução como antes, novamente tendo o cuidado de evitar interromper o pellet de microtúbulos. Repita as etapas 1.3.4.-1.3.5. e, em seguida, ressuspender o pellet de microtúbulos em 20-50 μL de 1x BRB80 + 20 μM taxol.
    7. Ressuspeite pipetando a maior parte do volume de ressuspensão e ejetando-o suavemente diretamente no pellet, repetindo 20-30x ou até que o pellet seja totalmente ressuspenso. Isso deve ser feito com cuidado para não cisalhar os microtúbulos por pipetagem excessivamente vigorosa. Cortar a ponta da pipeta para aumentar o tamanho da abertura também pode ser útil para reduzir o cisalhamento dos microtúbulos.
    8. Armazene os microtúbulos à temperatura ambiente, envolvendo o tubo em papel alumínio para proteger os fluoróforos da luz e mantendo-os na bancada. Os microtúbulos são geralmente utilizáveis por 2-3 dias após a clarificação.
  4. Avaliação de microtúbulos através de microscopia
    1. Preparar uma diluição 1:10 da solução de microtúbulos clarificada misturando 1 μL de microtúbulos e 9 μL de temperatura ambiente 1x BRB80. Fotografe imediatamente esta solução pipetando 10 μL numa lâmina de microscópio e, em seguida, colocando uma tampa sobre a gota para formar uma abóbora.
    2. Certifique-se de que os microtúbulos que variam em comprimentos de 8-25 μm a uma alta densidade (várias centenas por campo de visão completo em camadas em uma malha densa) sejam visíveis quando visualizados usando microscopia de fluorescência e uma objetiva de 100x focada na superfície da tampa em contato com a diluição dos microtúbulos.

2. Preparação de folhas de cobertura passivadas

  1. Folhas de cobertura de lavagem
    1. Coloque as tampas de 18 mm x 18 mm em racks de plástico não reativos e, em seguida, coloque cada rack em um copo de 100 mL. Coloque uma tampa por ranhura nas estantes, pois é necessária a limpeza de ambos os lados das tampas.
    2. Sonicate usando um sonicator de banho por 5 min, usando 50 mL das seguintes soluções na ordem dada para cada ciclo de sonicação: (1) água deionizada (com resistividade de 18,3 MΩ-cm), (2) solução Micro-90 a 2%, (3) água deionizada, (4) KOH 0,1 M recém-preparada, (5) água deionizada (Figura 1A). Certifique-se de que as folhas de cobertura estão totalmente cobertas de líquido. Entre os ciclos de sonicação, lave cada rack de folhas de cobertura em água deionizada usando pinças para mergulhar o rack para cima e para baixo 10-20x em água deionizada, substitua a água e repita o processo de enxágue 2x.
    3. Lave as tampas 3x em água, depois recarregue os copos com 100% de etanol e devolva as prateleiras aos béqueres. Mova os copos para um exaustor e coloque lenços de papel suficientes para abrir espaço para todos os racks de deslizamento de cobertura. Em seguida, retire as prateleiras com uma pinça e coloque sobre os lenços de papel.
    4. Usando um fluxo de gás nitrogênio seco, sopre o etanol das tampas e suas prateleiras até secar. Descarte o etanol restante dos copos e seque-os da mesma forma usando a corrente seca de gás nitrogênio (Figura 1A).
  2. Funcionalização da superfície do aminosilano em coberturas
    1. Preparar a solução reagente de (3-Aminopropil)tietoxisilano (APTES) adicionando 40 mL de acetona e 400 μL de reagente APTES a um tubo cônico de 50 mL, tampando firmemente e misturando invertendo 10x.
    2. Mova um rack de tampas para o copo seco correspondente e, em seguida, submerja totalmente na solução APTES. Incubar por 5 min (Figura 1A). Mova o rack tratado com APTES para um novo copo seco e mova um novo rack para o APTES para incubar por 5 m.
    3. Lave o rack tratado com água desionizada mergulhando o rack 10-20x, conforme descrito na Etapa 2.1.2., substituindo a água 5x. Repetir até que todas as folhas de cobertura tenham sido tratadas e lavadas.
  3. PEGilação da superfície do aminosilano
    1. Preparar duas soluções de PEG, uma de ~100 μL com 25% p/v de PEG e outra de ~10 μL com 10% p/v de biotina-PEG, ambas suspensas em NaHCO3 0,1 M recém-preparado, suficientes para revestir 24 coberturas. Centrifugar a solução de PEG a 25% a 3.000 x g por 20 s uma vez que 0,1 M de NaHCO3 é adicionado para dissolver completamente o PEG; a solução pode permanecer turva. Misture a biotina-PEG por pipetagem suave (Figura 1B).
    2. Preparar uma mistura das soluções de PEG e biotina-PEG, com 33,3 vezes o volume de PEG para 1 volume de biotina-PEG (por exemplo, 100 μL de solução de PEG e 3 μL de solução de biotina-PEG).
    3. Em um exaustor, coloque vários lenços estéreis e sem fiapos. Mova as prateleiras de deslizamento de cobertura para os lenços umedecidos e seque com um fluxo de gás nitrogênio seco como antes. Em vários lenços novos e secos, coloque as folhas de cobertura agora totalmente secas dispostas em pares e rotule cada uma no canto inferior direito com um símbolo assimétrico, como "b". Essa marcação será oposta à superfície da amostra da folha de cobertura e não interferirá no experimento (Figura 1B).
    4. Vire uma tampa em cada par com uma pinça. Em cada folha de cobertura invertida, coloque 6 μL de mistura PEG/biotina-PEG e coloque a segunda folha de cobertura por cima, de modo a que ambas as etiquetas "b" estejam viradas para fora.
    5. Alinhe as bordas da tampa e coloque em uma câmara umidificada e hermética para evitar a secagem. Incubar as coberturas na câmara de humidade à temperatura ambiente durante 3 h.
    6. Após a incubação, remova as tampas da câmara de umidade, separe cuidadosamente os pares de tampas e coloque-as de volta em suas prateleiras. Lave cada rack em água deionizada como antes, mergulhando os racks usando pinças 10-20x e substituindo a água um total de 5x.
    7. Coloque todos os lados PEGylated das tampas voltadas para a mesma direção de modo que não haja duas superfícies de deslizamento de cobertura PEGylated voltadas uma para a outra. A superfície PEGylated será muito pegajosa até secar completamente, por isso tome cuidado extra para evitar que as tampas se toquem. Secar cada rack e cobrir as folhas como antes usando um fluxo seco de gás nitrogênio (Figura 1B).
    8. Uma vez que as tampas e suas prateleiras estejam totalmente secas, armazene em um exsicador a vácuo para evitar a degradação do revestimento da superfície. Devidamente armazenado sob vácuo e com dessecante para evitar que a umidade interrompa o revestimento PEG; Os deslizamentos de cobertura podem ser usados por aproximadamente 1 semana.

3. Preparação de contas revestidas de cinesina

  1. Seleção e preparação do construto rigor cinesina
    1. Expressar e purificar construtos de quinesina de rigor de acordo com protocolos publicados53,54. Congelar rapidamente alíquotas de 5 μL de soluções de quinesina 0,02 mg/mL e armazenar a -80 °C por até 1 ano.
      NOTA: As proteínas de quinesina de rigor têm uma mutação pontual G234A que impede a hidrólise de ATP. Quando conjugadas a microesferas, interações de alta afinidade com o microtúbulo permitem que as contas sustentem cargas de 10-20 pN por vários minutos. Versões mutantes de rigor do homodímero K56053 e de uma construção K439 55 K439 comumente empregada e uma construção K43955 otimizada também foram empregadas com sucesso nesses ensaios54. Esta construção K439 melhorada contém um domínio de dimerização EB1 para melhorar a estabilidade e uma etiqueta C-terminal 6-His para ligação específica a um anticorpo 6-His, conforme descrito abaixo.
  2. Ligação 6-Seu anticorpo a contas revestidas de treptavidina
    1. Adicionar 50 μL de esferas de poliestireno revestidas com estreptavidina de 1 μm de diâmetro a um tubo de centrífuga de 0,5 ml. Sonicate por 30 s.
    2. Adicione 10 μL de 200 mM de TDT a 790 μL de 1x BRB80. Adicione 10 μL de grânulos sonicados a 40 μL deste buffer de TDT de 1x BRB80 + 2,5 mM.
    3. Combinar 1 μL de anticorpo biotinilado 6-His e 49 μL de 1x BRB80 + 2,5 mM TDT; vórtice brevemente para misturar.
    4. Combinar os 50 μL de mistura de grânulos diluídos e 50 μL de diluição de anticorpos num novo tubo. Colocar o tubo num rotador de tubos a 4 °C e rodar durante 1 h. Gire a mistura de grânulos por 10 min a 3.000 x g a 4 °C.
    5. Pipetar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 100 μL de 2 mg/mL de solução de caseína em 1x BRB80. Repita esta centrifugação e ressuspensão 2x.
  3. Adição de rigor cinesina
    1. Ressuspender o pellet final em 100 μL de 2 mg/ml de solução de caseína. Em um tubo de centrífuga de 0,5 mL, combine 5 μL de quinesina de rigor de 0,02 mg/mL e 5 μL de contas, misturando suavemente agitando levemente o tubo ~10x.
    2. Mantenha a suspensão do talão K439 G234A e os restantes 6-His esferas no rotor a 4 °C quando não estiverem a ser utilizados. As contas devem ser preparadas frescas e usadas no mesmo dia para os experimentos, pois tendem a se aglomerar e perder atividade além desse tempo.

4. Montagem da câmara de microscopia

  1. Preparação de lâminas de vidro e construção de câmaras
    1. Enxaguar as lâminas de vidro do microscópio de 75 mm x 25 mm primeiro com água ultrapura, seguido de um limpador de vidro sem estrias de amônia e, em seguida, mais uma vez com água ultrapura. Agite para remover o excesso de gotículas de água. Secar as lâminas com uma corrente de nitrogênio para que não restem estrias e deitá-las em uma toalha de papel (Figura 2A).
    2. Com uma tesoura, corte a fita dupla face em tiras de ~2-3 mm x 2,5 cm (2 tiras por câmara única e 3 por câmara dupla).
    3. Usando fórceps, coloque duas tiras de fita adesiva em uma lâmina de vidro para que haja ~ 0,5 cm de espaço entre elas para construir uma única câmara. Para câmaras duplas, use o mesmo espaçamento, mas com três tiras de fita adesiva (Figura 2B). O volume do canal de amostra usando este método é de aproximadamente 10 μL.
      NOTA: Quanto mais larga a(s) câmara(s), maior a probabilidade de que as bolhas se formem quando as soluções forem fluídas; no entanto, câmaras com menos de 0,5 cm de largura podem ser difíceis de usar devido à área reduzida para imagens.
    4. Raspe o comprimento de cada tira de fita usando pinça para que a fita seja firmemente aderida à lâmina de vidro.
    5. Libere a pressão do exsicador e use pinças para remover uma tampa biotinilada de um rack de armazenamento. Coloque uma tampa biotinilada em cima da lâmina de vidro usando pinças. Certifique-se de que o lado biotinilado está voltado para dentro, em direção à lâmina de vidro.
    6. Usando a extremidade traseira plana da pinça, pressione suavemente o vidro onde a tampa toca a fita para selar com segurança as câmaras. Deve ser utilizada uma pressão ligeira para garantir que a derrapagem da cobertura não racha (figura 2C).
    7. Armazenar as câmaras de microscopia acabadas em um recipiente hermético, longe da luz direta, até o uso (Figura 2D).
      NOTA: Recomenda-se o uso de câmaras no mesmo dia em que são feitas, pois as coberturas biotiniladas se degradam quando expostas ao ar.
  2. Fluxo de reagentes de microscopia
    1. Construa uma câmara de umidade colocando um tecido dobrado sem fiapos umedecido com água ultrapura no fundo de uma caixa de ponta de pipeta vazia. As câmaras de amostra devem ser mantidas nesta caixa entre as etapas de entrada para reduzir a evaporação das soluções do canal.
    2. Introduza todos os reagentes pipetando o líquido em uma extremidade do canal e absorvendo o líquido na extremidade oposta. Para o wick, torça uma extremidade do tecido e coloque-a suavemente no lado de saída da câmara, permitindo a ação capilar para distribuir homogeneamente o reagente (Figura 3A). Leve todos os reagentes à temperatura ambiente antes de fluir para evitar a despolimerização dos microtúbulos.
    3. Usando uma ponta de pipeta angular de 20 μL para que ela esteja tocando o lado de entrada de uma câmara, flua lentamente em 10 μL de estreptavidina 0,5 mg/mL ou Neutravidina. Use pontas de pipeta menores e um fluxo lento e constante de reagentes para diminuir a probabilidade de obtenção de bolhas na câmara (Figura 3B).
    4. Incubar a lâmina na câmara de humidade durante 4 minutos com o lado da tampa da câmara virado para baixo. Essa orientação permitirá que objetos maiores, como microtúbulos ou contas, afundem perto da superfície PEGylated.
    5. Lavar a câmara usando 20 μL de 1x BRB80, usando um tecido sem fiapos para extrair líquidos. Se houver um vazamento presente na câmara, descarte o slide e comece com outro; pequenas bolhas que ocorrem na câmara não afetarão negativamente a imagem.
    6. Repetir as etapas de entrada, incubação e descarga com 10 μL de solução bloqueadora de caseína de 0,5 mg/mL (Figura 3C). Diluir microtúbulos vermelhos distantes biotinilados ~1:20 e fluir 10 μL para a câmara. Incubar por 5 min e lavar a câmara com 20 μL de 1x BRB80 (Figura 3D). A densidade ideal desses microtúbulos dentro de um campo de visão de imagem de 100 μm x 100 μm deve ser de 10-20; e a diluição nesta fase deve ser ajustada para atingir esta relação de ligação superficial.
    7. Repita as etapas de entrada, incubação e descarga com 10 μL de uma concentração apropriada (tipicamente 1-10 nM) de proteína motora ou não motora a ser estudada (Figura 3E).
    8. Fluxo em 10 μL de microtúbulos de rodamina diluídos a uma concentração semelhante à dos microtúbulos vermelhos distantes biotinilados anteriores. Repita as etapas de incubação e descarga (Figura 3F).
    9. Combine 1 μL de esferas revestidas de quinesina de rigor e 19 μL de tampão de reação otimizado para a atividade proteica de reticulação. Por exemplo, para análise da atividade da cinesina-5, use tampão de reação com disjuntor de ligação TCEP de 1 mM, caseína alfa 0,2 mg/mL, KCl 70 mM, sistema de eliminação de oxigênio (4,5 mg/mL de glicose, 350 unidades/mL de glicose oxidase, 34 unidades/mL catalase), 1 mM DTT e ATP na concentração desejada (por exemplo, 1 mM para condições de velocidade máxima de cinesina) em 1x BRB80 (Figura 3G ). Para análise de proteínas não motoras, omita ATP e varie a concentração de KCl para modular a força de interação proteína-microtúbulo nesses ensaios.
    10. Selar ambas as bordas da câmara com esmalte transparente e esperar até que o esmalte seque antes da imagem (Figura 3H). Uma câmara construída com sucesso não terá vazamento presente e bolhas mínimas.

5. Pacotes de microtúbulos de imagem com TIRF de 3 cores

  1. Empregar um instrumento de microscópio invertido que tenha recursos de imagem TIRF e no qual uma armadilha óptica de feixe único tenha sido construída (Figura 4).
    NOTA: Para os estudos aqui descritos, um microscópio invertido foi usado com uma lente objetiva de óleo 100x/NA1.49, módulo TIRF e três lasers a 488 nm, 561 nm e 640 nm para a proteína marcada com GFP, microtúbulos marcados com rodamina e microtúbulos biotinilados marcados com vermelho distante, respectivamente.
    1. Adicionar uma gota de óleo de imersão na tampa da câmara de amostragem. O excesso de óleo pode danificar a objetiva do microscópio. Com o lado da tampa da câmara de amostra voltado para baixo, coloque a amostra a ser fotografada na plataforma do microscópio.
    2. Lentamente, traga a objetiva para cima para que haja contato entre a tampa e a objetiva através do óleo. Ajuste a altura objetiva de modo que a superfície de deslizamento da tampa da câmara de amostra esteja em foco.
    3. Grave imagens de quadro único da amostra em todos os três canais. Para os experimentos aqui, use 100-200 ms de exposição como uma duração de imagem ideal em todos os três canais; tempos de exposição mais longos podem resultar em aumento do fotobranqueamento.
    4. Ajuste a potência do laser para obter uma boa relação sinal-ruído das amostras, minimizando o fotobranqueamento ao longo de 2-5 minutos quando o feixe individual é ensaiado. Para o laser aqui utilizado (Figura 4 e Figura 5), use uma potência de laser de 5 mW para o canal GFP e 3 mW para ambos os canais de microtúbulos como ideal.
      NOTA: Os feixes montados com sucesso devem consistir em um microtúbulo imobilizado de superfície no canal vermelho distante, uma região coextensiva de vários mícrons com sinal significativo de proteína GFP e um microtúbulo de rodamina sobrepondo essas regiões e, em seguida, estendendo vários mícrons para longe do feixe (Figura 5B, C e Figura 6 ). A imagem ao vivo do microtúbulo de rodamina deve revelar flutuações sutis na extremidade do microtúbulo não reticulado, indicando que esse filamento está desanexado à superfície ou a outras proteínas na câmara.
    5. Observe a frequência de feixes de microtúbulos por campo de visão. Para uma amostra preparada com sucesso, deve haver aproximadamente 3-4 feixes de microtúbulos presentes por campo de visão de 100 μL x 100 μL por câmara.

6. Realização de experimentos de armadilha óptica em feixes de microtúbulos

  1. Calibração pré-experimental das condições
    1. Para realizar esses experimentos, use um purgador óptico de feixe único com uma rigidez de 0,05-0,1 pN/nm. Incorporar a óptica de aprisionamento e o fotodetector sensível à posição em um microscópio invertido compatível com TIRF, introduzindo filtros passa-curta logo abaixo da objetiva e acima do condensador, respectivamente (Figura 4).
    2. Além disso, adicione um estágio de nanoposicionamento no qual a amostra se senta para permitir que o usuário mova os microtúbulos com precisão em escala nanométrica de maneira controlada durante esses ensaios. O sistema aqui utilizado para aquisição de dados representativos foi descrito em trabalhos publicados 27,53,54,56,57.
      NOTA: Embora além do escopo deste protocolo, vários recursos estão disponíveis que detalham a construção e calibração de um purgador óptico de feixe único58,59,60.
    3. Observe a densidade de contas na amostra usando um campo brilhante ou canal DIC e a objetiva de 100x no microscópio. Use a microscopia de campo brilhante apenas para identificar e manipular contas e não para gravar simultaneamente com a aquisição de imagens de fluorescência. Espalhe as contas para estar a um mínimo de 10 μm umas das outras, em média, e certifique-se de que elas estejam livres de qualquer tipo de confinamento ou fixação da superfície e não estejam presas umas às outras ou de outra forma agrupadas.
    4. Certifique-se de que os microtúbulos vermelhos distantes biotinilados estejam firmemente presos à superfície da tampa, sem movimento browniano visível, como movimentos ao longo do eixo dos microtúbulos ou extremidades livres dos microtúbulos flutuando em solução.
    5. Certifique-se de que os microtúbulos de rodamina estão ligados aos microtúbulos biotinilados através do MAP de reticulação e estão visivelmente flutuando em suas extremidades livres. A fixação superficial de microtúbulos não biotinilados geralmente indica que a PEGilação pode ter sido malsucedida ou que o revestimento de PEG se degradou.
  2. Medições deslizantes de microtúbulos com acionamento por motor
    1. Expressar e purificar a proteína motora de interesse seguindo protocolos publicados. Por exemplo, proteínas quinesina-5 marcadas com GFP de comprimento total foram purificadas e empregadas com sucesso nesses ensaios 53,61, bem como cinesina-1262 e cinesina-1463 não marcadas. Monte e visualize feixes reticulados motor-proteína, conforme descrito acima nas etapas 4 e 5.
    2. Capture com a armadilha óptica um único grânulo livre em solução que esteja exibindo movimento browniano. Ajuste a óptica do purgador conforme necessário para mover o talão para o meio do campo de visão. Certifique-se de que o padrão de interferência refletido do feixe do purgador seja simétrico e ajuste a óptica do purgador para resolver quaisquer assimetrias do feixe.
    3. Mova o estágio da amostra de modo que a extremidade livre de um microtúbulo de rodamina dentro de um feixe esteja diretamente abaixo do talão e o talão esteja a vários mícrons de distância da região de sobreposição contendo proteínas de reticulação para minimizar o fotobranqueamento induzido pelo feixe de armadilha. Abaixe o talão no eixo Z até colidir com o microtúbulo. Tome cuidado para abaixar o talão suavemente e não empurre o talão contra a superfície da tampa, pois isso pode causar aderência à superfície da tampa.
    4. Desligue brevemente a armadilha para observar com o canal de campo brilhante a motilidade do grânulo ligado ao microtúbulo deslizante. Ao realizar ensaios de proteína motora, o grânulo anexado se moverá direcionalmente à medida que os microtúbulos se separarem. Reative a armadilha e capture o talão novamente.
    5. Comece a gravar dados de fluorescência nos três canais (488 nm, 561 nm, 640 nm) a uma taxa de 1-2 quadros por s usando a potência do laser e os tempos de exposição que foram otimizados na etapa 5 acima.
    6. Usando o software de computador de aprisionamento, registre dados de tensão do fotodetector sensível à posição (sinais de intensidade X, Y e SUM), do estágio de nanoposicionamento (coordenadas X, Y e Z) e do estado do obturador da câmera TIRF. Comece a digitalizar esses valores de tensão de interceptação usando uma placa de aquisição de dados de entrada de tensão dedicada controlada por software apropriado (como código LabView personalizado) a uma taxa de 1-10 kHz, dependendo dos requisitos experimentais.
    7. Monitore o sinal de força à medida que os dados são adquiridos e preste muita atenção a quaisquer anomalias que possam interferir na coleta de dados bem-sucedida.
      NOTA: As anomalias incluem, mas não estão limitadas a: (1) outras contas que se movem para a armadilha, (2) o talão que escapa prematuramente da armadilha e (3) quedas súbitas de força e subsequente falha em reiniciar a força contra a armadilha, indicando problemas com as moléculas de cinesina de rigor na superfície do talão.
    8. Após a medição, desative a armadilha para liberar o talão e repita com um novo talão e um novo microtúbulo até que o número necessário de repetições experimentais seja alcançado.
  3. Medições passivas de resistência à reticulação
    1. Expressar e purificar as proteínas de reticulação não motoras de interesse seguindo protocolos publicados. Por exemplo, o PRC143,54,57 rotulado com GFP de comprimento total e um construto truncado NuMA dimérico 56 foram empregados com sucesso nesses ensaios. Monte e visualize os feixes reticulados conforme descrito acima nas etapas 4 e 5.
    2. Identificar um feixe de microtúbulos adequado que contenha apenas dois microtúbulos, um biotinilado com fixação total da superfície e um microtúbulo não biotinilado que seja parcialmente livre em solução; isso dá uma extremidade livre para anexar um talão e garante que o grânulo não esteja ligado ao microtúbulo ligado à superfície e esteja alinhado no eixo X ou Y, de modo que o movimento do palco seja ao longo de apenas um eixo.
    3. Use a armadilha óptica para capturar uma conta livre em movimento browniano. Uma vez que o talão tenha sido preso, mova cuidadosamente o talão para o feixe de microtúbulos selecionado, garantindo que nenhum outro grânulo seja puxado para a armadilha no processo. Certifique-se de que o talão esteja a vários mícrons de distância da região de sobreposição contendo proteínas de reticulação para minimizar o fotobranqueamento da etiqueta GFP.
    4. Abaixe cuidadosamente o talão no eixo Z até que ele entre em contato com a borda do segmento livre do microtúbulo de rodamina. Puxe para cima suavemente e mova-se perpendicularmente ao eixo dos microtúbulos para verificar a fixação, observando a flexão do microtúbulo de rodamina e seguindo a posição do talão. Se não estiver ligado, repita o solavanco suave do talão no microtúbulo até ser ligado.
    5. Realinhe cuidadosamente o microtúbulo de rodamina ao longo do eixo do microtúbulo ligado à superfície, movendo o estágio de nanoposicionamento e configure os parâmetros para a tração automatizada do feixe de microtúbulos. Defina a direção ao longo do eixo paralelo dos microtúbulos, defina a velocidade de tração desejada (25-200 nm/s é uma faixa útil de velocidades) e o tempo de tração desejado (aproximadamente 30 s a 2 min), dependendo do comprimento de sobreposição.
    6. Comece a gravar dados de fluorescência nos três canais (488 nm, 561 nm, 640 nm) a uma taxa de 1-2 quadros por segundo. Use potências de laser e tempos de exposição otimizados na etapa 5 acima.
    7. Inicie o movimento automatizado do palco e registre os dados de aprisionamento do detector, do palco e do estado da câmera TIRF sensíveis à posição. Monitore quaisquer fatores que possam interferir na coleta de dados, que incluem, entre outros, (1) outra conta entrando na armadilha, (2) perda prematura de reticulação de microtúbulos ou (3) descolamento de contas do microtúbulo de rodamina.
    8. Desative a armadilha para liberar o talão e repita o experimento conforme desejado. Uma câmara de amostra típica pode ser usada por aproximadamente 30 minutos antes que ocorra a degradação dos feixes e a perda de atividade proteica.
      NOTA: Os efeitos de degradação variam de acordo com o reticulante usado, mas podem se manifestar como a formação de puncta estático nos microtúbulos ou na superfície, a perda de flutuações de microtúbulos indicando ligação não específica ou a incapacidade de anexar contas de forma estável aos microtúbulos.

7. Análise de dados e correlação de imagens de fluorescência com registros de armadilhas ópticas

NOTA: Para otimizar a coleta de dados, é benéfico empregar dois sistemas de controle de computador separados: um para o software de interceptação óptica e outro para a imagem de fluorescência. Essa configuração permite a aquisição de dados de alta velocidade em ambas as modalidades experimentais e elimina atrasos de nano e microssegundos na execução da operação introduzidos nos dados, que podem surgir ao usar uma única CPU.

  1. Digitalize os dados de aprisionamento óptico a uma taxa otimizada para as proteínas de reticulação motoras ou não motoras empregadas e suas taxas esperadas de passo (por exemplo, tipicamente entre 1-10 kHz).
  2. Registre os sinais de tensão X, Y e SUM do fotodetector sensível à posição, bem como os dados posicionais X, Y e Z do estágio de nanoposicionamento usando software dedicado para controlar a armadilha óptica e coletar amostras dos sinais de tensão digital desses componentes.
  3. Grave o sinal digital de estado aberto do obturador da câmera com um canal de entrada de tensão adicional na placa de aquisição de dados de aprisionamento óptico. Isso permite a correlação dos dados de imagem de fluorescência com os traços de tempo de aprisionamento óptico. Inicie a coleta de dados com o purgador óptico antes do início da imagem para que o sinal da câmera do primeiro quadro seja registrado corretamente.
  4. Calcule a média dos dados brutos de séries temporais adquiridos a altas taxas de amostragem usando um método de filtragem apropriado, como janela deslizante, filtro mediano ou filtro gaussiano, dependendo das necessidades.
  5. Quantifique os dados da série temporal da imagem de fluorescência usando métodos como a análise de varredura de linhas, em que o valor da intensidade do pixel ao longo do comprimento da região dos microtúbulos é calculado. A partir dessas linhas, podem trajetórias identificar as bordas dos microtúbulos e, portanto, as regiões de sobreposição. Além disso, use a intensidade de fluorescência do canal de proteína reticulante para calcular a localização, concentração e densidade da proteína.
  6. A correlação de dados de força e imagem é um resultado essencial deste sistema experimental. Por exemplo, selecione e faça a média de todos os pontos de dados de força dentro de uma determinada região de exposição da câmera (indicada pelo pico de sinal digital correspondente no canal da câmera) para comparar diretamente com o quadro de imagem de fluorescência correspondente. Posteriormente, extraia as relações entre a magnitude da força e o número de proteínas de reticulação, comprimento de sobreposição ou distribuição de reticulação.

Resultados

A preparação de feixes de microtúbulos adequados para análise biofísica é considerada bem-sucedida se vários dos principais critérios forem atendidos. Primeiramente, a imagem em três cores deve revelar dois microtúbulos alinhados com concentração de proteína reticulada decorando preferencialmente a região de sobreposição (Figura 5B,C e Figura 6B). Idealmente, a distância entre a borda de sobreposição e a extre...

Discussão

As redes de microtúbulos são empregadas por uma miríade de tipos de células para realizar uma ampla gama de tarefas que são fundamentalmente de natureza mecânica. A fim de descrever como as células funcionam em estados saudáveis e de doença, é fundamental entender como essas redes em escala mícron são organizadas e reguladas pelas proteínas do tamanho de nanômetros que as constroem coletivamente. Ferramentas biofísicas, como pinças ópticas, são adequadas para sondar a mecanoquímica de proteínas-chave ...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores desejam reconhecer o apoio do R21 AG067436 (para JP e SF), T32 AG057464 (para ET) e Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (para SF).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nmIPG PhotonicsYLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applicationsChromaTRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin ConjugateInvitrogen#MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC gradeFisher Scientific18-608-395
Alpha casein from bovine milkSigma1002484390
ATPFisher ScientificBP413-25
BenzonaseNovagen70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio, Inc.NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta CellsMillipore Sigma71-400-3
CatalaseMP Biomedicals LLC190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objectiveNikonN/A
ChloramphenicolACROS Organics227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslipsFisher ScientificC14784
Delicate Task WipersKimberly-Clark34120
Dextrose AnhydrousFisher ScientificBP3501
D-SucroseFisher ScientificBP220-1
DTTFisher ScientificBP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 BathLAUDA-Brinkmann27709
EDTAFisher ScientificBP118-500
EGTAMillipore Corporation32462-25GM
FIJI / Image Jhttps://fiji.sc/N/A
Frosted Microscope SlidesCorning12-553-1075mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose OxidaseMP Biomedicals LLC195196Type VII, without added oxygen
GMPCPPJena BiosciencesJBS-NU-405SCan be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover GlassThermo Scientific3405
HEPESFisher ScientificBP310-500
ImidazoleFisher Scientific03196-500
IPTGFisher ScientificBP1755-10
Laboratory dessicatorBel-Art999320237190mm plate size
Kanamycin SulfateFischer ScientificBP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6HisGilbert Lab, RPIN/Adoi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
KimwipeKimberley ClarkZ188956lint-free tissue
Immersion Oil, Type BCargille16484
Lens TissueThorLabsMC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm)NikonN/A
LysozymeMP Biomedicals LLC100834
Magnesium Acetate TetrahydrateFisher ScientificBP215-500
Microfuge 18Beckman Coulter367160
MPEG-SVA MW-5000Laysan Bio, Inc.NC0107576
NeutravadinInvitrogenPI31000
Nikon Ti-E inverted microscopeNikonN/ANikon LuN4 Laser
Ni-NTA ResinThermo Scientific88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		IDTN/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		IDTN/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mmBeckman Coulter343755
Optima-TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361544
Paclitaxel (Taxol equivalent)Thermo Fisher ScientificP3456
PIPESACROS Organics172615000
PMSFMillipore7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin labelCytoskeleton, Inc.T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 FluorCytoskeleton, Inc.TL670Mfar red labelled
Porcine Tubulin, RhodamineCytoskeleton, Inc.TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin ProteinCytoskeleton, Inc.T240
Potassium AcetateFisher ScientificBP364-500
Prime 95B sCMOS cameraPhotometricN/A
Quadrant Detector Sensor HeadThorLabsPDQ80A
Quikchange Lightning KitAgilent Technologies210518
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Square Cover GlassesCorning12-553-45018 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin MicrospheresPolysciences Inc.24162-1
Superose-6 ColumnGE Healthcare29-0915--96
TCEPThermo Scientific77720
TLA-100 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator)VevorJPS-08A(DD)304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solutionVector LaboratoriesSP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-DS.C. JohnsonSJN695237

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