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要約

ここでは、微小管束を in vitroで 再構成し、光学トラップと全反射蛍光顕微鏡を同時に使用して、微小管束に及ぼされる力を直接定量化するためのプロトコルを紹介します。このアッセイは、活性微小管ネットワーク内のタンパク質アンサンブルによって生成される力と変位のナノスケールレベルの測定を可能にします。

要約

微小管ネットワークは、小胞輸送のトラックとして機能することから、染色体分配を調節するための有糸分裂中の特殊なアレイとして機能することまで、幅広いタスクを実行するために細胞で使用されます。微小管と相互作用するタンパク質には、キネシンやダイニンなどの能動や方向性運動を発生させるモーターや、フィラメントを高次ネットワークに架橋したり、フィラメントのダイナミクスを調節したりする非モータータンパク質などがあります。これまで、微小管関連タンパク質の生物物理学的研究は、小胞輸送に必要な単一モータータンパク質の役割に圧倒的に焦点を当てており、キネシンやダイニンの力発生特性やメカノケミカル制御の解明は大きく進歩してきました。しかしながら、微小管が有糸分裂紡錘体内でのフィラメントスライド中など、貨物およびトラックの両方として作用するプロセスについては、関与する架橋タンパク質のアンサンブルの生物物理学的調節についてはほとんど理解されていない。ここでは、精製された微小管と有糸分裂タンパク質から再構成された架橋微小管最小ネットワーク内の力の生成と応答を直接調査するための方法論について詳しく説明します。微小管対は目的のタンパク質によって架橋され、1つの微小管は顕微鏡カバーガラスに固定化され、2番目の微小管は光トラップによって操作されます。同時全反射蛍光顕微鏡法により、フィラメントがスライドして力を発生させるときに、この微小管ネットワークのすべてのコンポーネントのマルチチャンネル視覚化が可能になります。また、これらの技術を使用して、キネシン-5アンサンブルによって加えられる押し力と、有糸分裂MAP PRC1によって架橋された滑り微小管ペア間で粘性のあるブレーキ力がどのように発生するかを示します。これらのアッセイは、紡錘体の組み立てと機能のメカニズムに関する洞察を提供し、ニューロンや極性上皮細胞の軸索や樹状突起など、さまざまな状況で高密度の微小管ネットワーク力学を研究するために、より広く適応させることができます。

概要

細胞は微小管ネットワークを使用して、小胞輸送1,2,3から有糸分裂中の染色体分配4,5,6に至るまで、さまざまな機械的タスクを実行します。分子モータータンパク質のキネシンやダイニンなど、微小管と相互作用するタンパク質の多くは力を発生させ、機械的負荷によって調節されます。これらの重要な分子がどのように機能するかをよりよく理解するために、研究者は光学トラップやTIRF顕微鏡などの単一分子生物物理学的方法を使用して、個々のタンパク質の無負荷ステッピング速度、処理性、力と速度の関係などの重要なパラメーターを直接監視しています。最も一般的に使用されている実験幾何学は、球状の形状とサイズがモーター駆動の輸送を受けている小胞を模倣するトラッピングビーズにモータータンパク質を直接付着させることでした。キネシン-1 7,8,9、キネシン-2 10,11,12、キネシン-313,14,15,16キネシン-517,18、キネシン-8 19,20、ならびにダイニンおよびダイニン錯体21,22を含む多数のキネシン、23、24、25は、これらの方法で検討されている。

しかし、多くの細胞プロセスでは、モータータンパク質と非モータータンパク質は、トラックとカーゴの両方として微小管を使用します26,27。さらに、微小管フィラメントが高次バンドルに架橋されているこれらのシナリオでは、これらのタンパク質は単一のユニットではなくアンサンブルとして機能します。例えば、分裂した体細胞内で、高密度フィラメントネットワークが自己組織化して有糸分裂紡錘体装置28、29、30を構築する。極間紡錘体微小管ネットワークは非常にダイナミックで、マイナス端が紡錘体極を向いており、プラス端が紡錘体赤道付近で重なり合うように大きく配置されています。紡錘体内のフィラメントは、キネシン-5 31,32,33、キネシン-12 34,35,36、およびキネシン-1437,38,39などのモータータンパク質、またはPRC1 40,41,42,43またはNuMA 44,45などの非モータータンパク質によって架橋されています。46。それらは、極方向のフラックスなどのプロセス中、または中期または後期47,48,49,50,51,52中の染色体分離中の染色体中心を調整している間に、頻繁に移動または機械的ストレスを経験します。したがって、有糸分裂によるミクロンスケールのスピンドル装置の完全性は、相互作用するフィラメントのこのネットワークによって生成および維持される押し力と引っ張り力の慎重に調整されたバランスに依存しています。しかし、この機械的制御を調査し、タンパク質アンサンブルがどのように連携して微小管の動きを調整し、紡錘体を適切に組み立てるのに必要な力を生み出すかを説明するために必要なツールは最近開発されたばかりであり、動的微小管ネットワークを定義する生物物理学的規則を理解し始めたばかりです。

この原稿の目的は、架橋微小管ペアを in vitroで再構成し、微小管と架橋タンパク質の両方の蛍光視覚化とナノスケールの力測定を同時に可能にする顕微鏡チャンバーにこれらのバンドルを固定化し、これらのデータを堅牢に処理するために必要な手順を実証することです。蛍光標識された微小管を安定して重合するために必要な手順、取り付け用の顕微鏡カバーガラスの準備、光学トラップ実験用のポリスチレンビーズの準備、および生体 内機能を維持し ながら直接生物物理学的操作を可能にする架橋フィラメントネットワークの組み立てに必要な手順を詳しく説明します。

プロトコル

1.微小管の調製

注:GFP標識架橋タンパク質を使用する場合、微小管の有機フルオロフォア標識は、赤色(ローダミンなど)および遠赤色(ビオチン化HiLyte647など、本文の残りの部分ではビオチン化遠赤色と呼ばれます)が適しています。高品質のクワッドバンド全反射蛍光(TIRF)フィルタを使用することで、イメージング中に3つのチャンネル間のクロストークを最小限に抑えることができます。

  1. GMPCPP微小管種子ストックの準備
    1. 1 mgの非標識凍結乾燥チューブリンを84 μLの氷冷1x BRB80(80 mM PIPES、1 mM MgCl2、1 mM EGTA、pH 6.8)に懸濁し、使用直前にDTTを最終濃度1 mMまで添加します。60 μgの蛍光色素標識凍結乾燥チューブリンを、1 mM DTTを含む6 μLの冷熱1x BRB80に懸濁します。60 μgのビオチン標識凍結乾燥チューブリンを、1 mM DTTを含む6 μLの冷熱1x BRB80に懸濁します。
    2. 標識比1:10の非ビオチン化ローダミン標識チューブリンシードストックを調製するには、非標識チューブリン84 μL、フルオロフォア標識チューブリン6 μL、および10 μLの10 mM GMPCPPストック溶液を0.5 mLチューブに加えます。穏やかにピペッティングしてよく混ぜ、氷の上に保ちます。
      注:これらのアッセイでは、GTPで重合した場合やタキソールを省略した場合よりも微小管が安定しており、光学トラップによる直接操作に適しているため、GMPCPP重合が好ましい。
    3. 蛍光標識比が1:10のビオチン化遠赤色標識チューブリンシードストックを調製するには、0.5 mLチューブに80 μLの非標識チューブリン、6 μLの蛍光色素標識チューブリン、4 μLのビオチン標識チューブリン、および10 μLの10 mM GMPCPPストック溶液を加えます。穏やかにピペッティングしてよく混ぜ、氷の上に保ちます。種子ストックを氷上で5分間インキュベートします。
    4. チューブリン溶液を高速遠心分離に適したポリカーボネートチューブに移します。種ストックを~350,000 x g で2°Cで5分間遠心分離して微小管の重合を防ぎ、上清を回収して分注します。この段階でのチューブリンの最終的な推定濃度は~50μMです。
    5. 0.2 mL PCRチューブを使用して、2 μLのシードストックを調製し、液体窒素で瞬間凍結します。アリコートは-80°Cで最大6ヶ月間保存できます。
  2. 微小管の重合
    1. 1x BRB80を500 μL調製し、氷上に置きます。ビオチン化ファーレッドと非ビオチン化ローダミンシードストックのアリコートをそれぞれ1つずつ氷上に置いて解凍します。
    2. 種子ストックを氷上で5分間インキュベートします。インキュベーション期間の終了時に、直ちに26 μLの1x BRB80を各チューブに加えます。より長い微小管が必要な場合は、BRB80の容量を5〜10μL増加させ、一方、より短い微小管の場合は、重合用の容量を5μL減らします。
    3. 微小管シードストックを水浴中37°Cで1時間インキュベートします。室温1x BRB80 298.5 μLと4 mMタキソールストック溶液1.5 μLを組み合わせて、20 μMタキソール溶液を生成します。300 μLの1x BRB80を準備し、両方のチューブを室温に保ちます。
    4. 適切な高速ローターを30°Cに温めます。 これは、30°Cに設定された卓上超遠心分離機で行うことができます。 微小管を水浴から取り出し、ベンチトップ上で室温で10〜15分間保ちます。
  3. 微小管の解明
    1. 微小管増殖溶液に室温1x BRB80を100 μL加え、チューブを~10回フリックするか、穏やかにピペッティングして混合します。微小管成長溶液をポリカーボネート製遠沈管に移します。
    2. 遠心分離機の回転に対して外側を向くポリカーボネートチューブの片側に印を付けます。これは、少量の材料のためにほとんど見えない微小管ペレットを見つけるのに役立ちます。
    3. 微小管溶液を~350,000 x g で30°Cで10分間遠心分離します。 遠心分離後、可能であれば微小管を含むチューブにペレットがないか検査します。ペレットを乱すことなく、最後の数マイクロリットルの液体を除くすべてを慎重に取り除きます。ペレットがはっきりと見えない場合は、ペレットが配置されている場所を邪魔しないように、ガイドとして作成されたマーキングを使用してください。
    4. 直ちに100 μLの1x BRB80 + 20 μMタキソールを微小管チューブに加えます。これはペレットに直接加えることができます。この段階でのペレットの破壊は、清澄化プロセスに大きな影響を与えません。
    5. 微小管を~350,000 x g で10分間遠心分離し、チューブのマークされた部分が遠心分離機の回転に対して再び外側を向くように注意します。
    6. 以前と同様に、数マイクロリットルを除くすべての溶液を取り除き、微小管ペレットを破壊しないように注意します。手順 1.3.4.-1.3.5 を繰り返します。次に、微小管ペレットを1x BRB80 + 20 μMタキソールの20〜50 μLに再懸濁します。
    7. 再懸濁量の大部分をピペッティングし、ペレットに直接静かに排出し、20〜30倍、またはペレットが完全に再懸濁されるまで繰り返すことにより、再懸濁します。これは、過度に激しいピペッティングによって微小管を剪断しないように注意して行う必要があります。ピペットチップを切断して開口部のサイズを大きくすることも、微小管のせん断を減らすのに役立ちます。
    8. 微小管を室温で保存するには、チューブをホイルで包み、蛍光色素を光から遮蔽し、ベンチトップに置いてください。微小管は、一般に清澄化後2〜3日間使用できます。
  4. 顕微鏡による微小管の評価
    1. 1 μLの微小管と9 μLの室温1x BRB80を混合することにより、清澄化された微小管溶液の1:10希釈液を調製します。10 μLを顕微鏡スライドにピペッティングし、液滴の上にカバーガラスを置いてスカッシュを形成することにより、この溶液をすぐに画像化します。
    2. 蛍光顕微鏡と微小管希釈液と接触するカバーガラス表面に焦点を当てた100倍の対物レンズを使用して視覚化したときに、高密度で8〜25 μmの長さの微小管(高密度メッシュワークで層状に層状にされた全視野あたり数百)が見えることを確認します。

2.不動態化カバーガラスの準備

  1. カバーガラスの洗浄
    1. 18 mm x 18 mmのカバーガラスを非反応性プラスチックラックに入れ、各ラックを100 mLビーカーに入れます。カバースリップの両側をクリーニングする必要があるため、ラックのスロットごとに 1 つのカバーガラスを配置します。
    2. (1)脱イオン水(18.3MΩ-cmの抵抗率)、(2)2%マイクロ90溶液、(3)脱イオン水、(4)新たに調製された0.1M KOH、(5)脱イオン水(図1A)。カバーガラスが液体で完全に覆われていることを確認してください。超音波処理サイクルの間に、ピンセットを使用して脱イオン水でカバーガラスの各ラックをすすぎ、脱イオン水にラックを上下に10〜20倍浸し、水を交換し、すすぎプロセスを2回繰り返します。
    3. カバーガラスを水で3回すすぎ、ビーカーに100%エタノールを補充し、ラックをビーカーに戻します。ビーカーをヒュームフードに移動し、すべてのカバースリップラック用のスペースを確保するのに十分なティッシュワイプを配置します。次に、ピンセットでラックを取り外し、ティッシュワイプの上に置きます。
    4. 乾燥した窒素ガス流を使用して、カバーガラスとそのラックからエタノールを乾くまで吹き飛ばします。ビーカーから残りのエタノールを処分し、同様に乾燥窒素ガス流を使用して乾燥させます(図1A)。
  2. カバーガラス上のアミノシラン表面機能化
    1. 40 mLのアセトンと400 μLのAPTES試薬を50 mLのコニカルチューブに加え、しっかりとキャッピングし、10倍反転させて混合することにより、(3-アミノプロピル)チエトキシシラン(APTES)試薬溶液を調製します。
    2. カバーガラスの1つのラックを対応するドライビーカーに移動し、APTES溶液に完全に沈めます。5分間インキュベートします(図1A)。APTES処理されたラックを新しいドライビーカーに移動し、新しいラックをAPTESに移動して5 mインキュベートします。
    3. ステップ2.1.2の説明に従ってラックを10〜20x浸し、水を5x交換して、処理したラックを脱イオン水ですすぎます。すべてのカバーガラスが処理され、洗浄されるまで繰り返します。
  3. アミノシラン表面のペグ化
    1. 24枚のカバーガラスをコーティングするのに十分な、25%w/v PEGを含む~100 μLと10%w/vビオチン-PEGを含む~10 μLの2つのPEG溶液を調製します。25% PEG溶液を3,000 x gで20秒間遠心分離し、0.1 M NaHCO3を加えてPEGを完全に溶解します。溶液は曇ったままかもしれません。穏やかなピペッティングによってビオチン-PEGを混合します(図1B)。
    2. PEG溶液とビオチン-PEG溶液の混合物を、1容量のビオチン-PEGに対して33.3倍の容量のPEGとともに調製します(例:100 μLのPEG溶液と3 μLのビオチン-PEG溶液)。
    3. ヒュームフードに、滅菌された糸くずの出ないワイプをいくつか配置します。カバースリップラックをワイプに移動し、前と同じように乾燥窒素ガス流でブロードライします。いくつかの新しい乾いたワイプで、完全に乾燥したカバーガラスをペアで配置し、右下隅にそれぞれに「b」などの非対称記号のラベルを付けます。このマーキングはカバーガラスのサンプル表面の反対側にあり、実験を妨げません(図1B)。
    4. ピンセットで各ペアのカバーガラスを1つずつ裏返します。裏返した各カバーガラスに、6 μLのPEG/ビオチン-PEG混合物を置き、両方の「b」ラベルが外側を向くように2番目のカバーガラスを上に置きます。
    5. カバーガラスの端を合わせ、乾燥を防ぐために加湿された気密チャンバーに入れます。カバーガラスを湿度チャンバー内で室温で3時間インキュベートします。
    6. インキュベーション後、湿度チャンバーからカバーガラスを取り外し、カバーガラスペアを慎重に分離して、ラックに戻します。前と同じように各ラックを脱イオン水で洗い、ピンセットを使用してラックを10〜20倍浸し、水を合計5倍交換します。
    7. カバーガラスのすべてのPEG化側面を同じ方向に向けて配置し、2つのPEG化カバーガラス面が互いに向き合わないようにします。PEG化表面は完全に乾くまで非常に粘着性があるため、カバーガラスが触れないように特に注意してください。各ラックとカバーガラスを、前と同じように乾燥窒素ガス流を使用して乾燥させます(図1B)。
    8. カバーガラスとそのラックが完全に乾いたら、表面コーティングの劣化を防ぐために真空デシケーターに保管してください。湿気がPEGコーティングを破壊するのを防ぐために、真空下で乾燥剤で適切に保管されます。カバーガラスは約1週間使用できます。

3. キネシンコートビーズの作製

  1. 厳密キネシン構築物の選択と調製
    1. 公開されたプロトコル53,54に従って厳密キネシン構築物を発現および精製する。0.02 mg/mLのキネシン溶液5 μLアリコートをフラッシュフリーズし、-80°Cで最長1年間保存します。
      注:リゴールキネシンタンパク質には、ATP加水分解を妨げるG234A点変異があります。マイクロビーズに結合させると、微小管との親和性の高い相互作用により、ビーズは10〜20 pNの荷重を数分間維持できます。一般的に使用されるキネシン-1ホモダイマーK56053 およびさらに最適化されたK439構築物55 の両方の厳密な変異バージョンも、これらのアッセイ54において成功裏に採用されている。この改良されたK439構築物は、安定性を高めるEB1二量体化ドメインと、以下に説明するように、6-His抗体に特異的に結合するためのC末端6-Hisタグを含んでいます。
  2. ストレプトアビジンコートビーズへの6-His抗体の結合
    1. 直径1 μmのストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズ50 μLを0.5 mLの遠沈管に加えます。30秒間超音波処理します。
    2. 1x BRB80の790 μLに10 μLの200 mM DTTを追加します。この1x BRB80 + 2.5 mM DTTバッファーの40μLに10μLの超音波処理ビーズを追加します。
    3. 1 μLのビオチン化6-His抗体と49 μLの1x BRB80 + 2.5 mM DTTを組み合わせます。簡単に渦を混ぜます。
    4. 50 μLの希釈ビーズ混合物と50 μLの抗体希釈液を新しいチューブに入れます。チューブを4°Cのチューブローテーターに入れ、1時間回転させます。ビーズ混合物を4°Cで3,000 x g で10分間スピンダウンします。
    5. 上清をピペットで除去し、ペレットを1x BRB80中の2 mg/mLカゼイン溶液100 μLに再懸濁します。この遠心分離と再懸濁を2回繰り返します。
  3. 厳密キネシンの添加
    1. 最終ペレットを100 μLの2 mg/mLカゼイン溶液に再懸濁します。0.5 mLの遠沈管で、0.02 mg/mLのリゴールキネシン5 μLとビーズ5 μLを混ぜ合わせ、チューブを軽くフリック~10倍にして穏やかに混合します。
    2. K439 G234Aビーズ懸濁液と残りの6-Hisビーズの両方を、使用しないときはローターに4°Cで保管してください。ビーズは、この時間を超えると凝集して活動を失う傾向があるため、新鮮に準備し、実験に同じ日に使用する必要があります。

4.顕微鏡チャンバーの組み立て

  1. スライドガラスの準備とチャンバー構造
    1. 75 mm x 25 mmの顕微鏡スライドガラスを最初に超純水で洗い流し、次にノンストリークアンモニアdガラスクリーナー、次にもう一度超純水ですすぎます。振って余分な水滴を取り除きます。窒素気流を使用してスライドを乾燥させ、縞が残らないようにし、スライドをペーパータオルの上に置きます(図2A)。
    2. はさみで両面テープを~2-3 mm x 2.5 cmの短冊状に切ります(1つのチャンバーごとに2つのストリップとダブルチャンバーごとに3つのストリップ)。
    3. 鉗子を使用して、1つのスライドガラスに2本のテープを敷き、それらの間に~0.5cmのスペースを確保して1つのチャンバーを構成します。ダブルチャンバーの場合は、同じ間隔を使用しますが、3本のテープを使用します(図2B)。この方法を使用したサンプルチャネルの容量は約10μLです。
      注意: チャンバーが広いほど、溶液が流入したときに気泡が発生する可能性が高くなります。ただし、幅が0.5 cm未満のチャンバーは、イメージングの面積が小さくなるため、使用が困難な場合があります。
    4. テープがスライドガラスにしっかりと接着されるように、鉗子を使用してテープの各ストリップの長さをこすります。
    5. デシケーターから圧力を解放し、鉗子を使用して、ビオチン化カバーガラスを収納ラックから1つ取り外します。鉗子を使用して、スライドガラスの上にビオチン化カバーガラスを1つ置きます。ビオチン化面がスライドガラスに向かって内側を向いていることを確認してください。
    6. 鉗子の平らな後端を使用して、カバーガラスがテープに触れる場所でガラスをそっと押して、チャンバーをしっかりと密閉します。カバーガラスにひびが入らないように、軽い圧力を使用する必要があります(図2C)。
    7. 完成した顕微鏡チャンバーは、使用するまで直射日光を避けて密閉容器に保管してください(図2D)。
      注:ビオチン化カバーガラスは空気にさらされると劣化するため、チャンバーは製造したのと同じ日に使用することをお勧めします。
  2. 顕微鏡用試薬の流入
    1. 空のピペットチップボックスの底に超純水で湿らせた折りたたまれた糸くずの出ないティッシュを置き、湿度チャンバーを構築します。サンプルチャンバーは、流入ステップの間にこのボックスに保管して、チャネルからの溶液の蒸発を減らす必要があります。
    2. チャネルの一方の端で液体をピペッティングし、もう一方の端で液体を吸い取って、すべての試薬を導入します。ウィックするには、組織の一方の端をひねり、チャンバーの出口側にそっと置き、毛細管現象で試薬を均一に分配させます(図3A)。微小管の解重合を防ぐために、流入する直前にすべての試薬を室温に戻します。
    3. 20 μLの角度付きピペットチップを使用して、1つのチャンバーの入口側に触れるようにし、10 μLの0.5 mg/mLストレプトアビジンまたはニュートラアビジンをゆっくりと流します。より小さなピペットチップと試薬のゆっくりとした一定の流入を使用して、チャンバー内に気泡が発生する可能性を減らします(図3B)。
    4. チャンバーのカバーガラス側を下に向けて、湿度チャンバー内のスライドを4分間インキュベートします。この方向により、微小管やビーズなどのより大きな物体がPEG化表面の近くに沈むことができます。
    5. 20 μLの1x BRB80を使用してチャンバーを洗い流し、糸くずの出ないティッシュを使用して液体を引き出します。チャンバー内に漏れがある場合は、スライドを破棄し、別のスライドから始めます。チャンバー内で発生する小さな気泡は、イメージングに悪影響を与えることはありません。
    6. 10 μLの0.5 mg/mLカゼインブロッキング溶液でフローイン、インキュベーション、およびフラッシュのステップを繰り返します(図3C)。ビオチン化遠赤色微小管を~1:20に希釈し、チャンバー内に10 μLを流入します。5分間インキュベートし、チャンバーを20 μLの1x BRB80で洗い流します(図3D)。100 μm x 100 μmのイメージング視野内のこれらの微小管の最適密度は10〜20である必要があります。そして、この段階での希釈は、この表面結合比を達成するために調整する必要があります。
    7. 研究対象の適切な濃度(通常は1〜10 nM)の架橋モーターまたは非モータータンパク質10 μLを使用して、フローイン、インキュベーション、およびフラッシュのステップを繰り返します(図3E)。
    8. 以前のビオチン化遠赤色微小管と同様の濃度に希釈した10 μLのローダミン微小管を流します。インキュベーションとフラッシュのステップを繰り返します(図3F)。
    9. 1 μLのリゴールキネシンコーティングビーズと、架橋タンパク質活性に最適化された19 μLの反応バッファーを組み合わせます。例えば、キネシン-5活性の分析には、1 mM TCEPボンドブレーカー、0.2 mg/mLアルファカゼイン、70 mM KCl、酸素消去システム(4.5 mg/mLグルコース、350単位/mLグルコースオキシダーゼ、34単位/mLカタラーゼ)、1 mM DTT、およびATPを所望の濃度(例えば、最大キネシン速度条件の場合は1 mM)で1x BRB80(図3G)の反応バッファーを使用します。).非モータータンパク質の分析では、ATPを省略し、KClの濃度を変化させて、これらのアッセイでタンパク質-微小管相互作用強度を調節します。
    10. チャンバーの両端を透明なマニキュアで密封し、ポリッシュが乾くまで待ってからイメージングします(図3H)。正常に構築されたチャンバーは、漏れがなく、気泡が最小限に抑えられます。

5. 3色TIRFによる微小管束のイメージング

  1. TIRFイメージング機能を備えた倒立顕微鏡装置を使用し、その中にシングルビーム光トラップを構築します(図4)。
    注:ここで説明する研究では、GFPタグ付きタンパク質、ローダミン標識微小管、ビオチン化遠赤色標識微小管について、それぞれ100倍/NA1.49油対物レンズ、TIRFモジュール、および488 nm、561 nm、および640 nmの3つのレーザーを備えた倒立顕微鏡を使用しました。
    1. サンプルチャンバーのカバーガラスに液浸オイルを1滴加えます。過度の油は顕微鏡対物レンズを損傷する可能性があります。サンプルチャンバーのカバーガラス側を下に向けて、イメージングするサンプルを顕微鏡プラットフォームに置きます。
    2. カバーガラスと対物レンズの両方がオイルを介して接触するように、対物レンズをゆっくりと持ち上げます。サンプルチャンバーのカバーガラス面に焦点が合うように対物レンズの高さを調整します。
    3. サンプルのシングルフレーム画像を3チャンネルすべてに記録します。ここでの実験では、3つのチャネルすべてで最適なイメージング期間として100〜200ミリ秒の露出を使用します。露光時間を長くすると、光退色が増加する可能性があります。
    4. レーザー出力を調整して、個々のバンドルがアッセイされるときの2〜5分間の光退色を最小限に抑えながら、サンプルからの良好な信号対雑音比を達成します。ここで使用するレーザー(図4および図 5)では、GFPチャネルに 5 mW、両方の微小管チャネルに3 mWのレーザー出力を最適に使用します。
      注:正常に組み立てられたバンドルは、遠赤色チャネルにある1つの表面固定微小管、有意なGFPタンパク質シグナルを持つ数ミクロンの共拡張領域、およびこれらの領域と重なり合い、バンドルから数ミクロン離れたローダミン微小管で構成される必要があります(図5B、C、および図6).ローダミン微小管のライブイメージングは、非架橋微小管末端の微妙な変動を明らかにし、このフィラメントがチャンバー内の表面または他のタンパク質に付着していないことを示しているはずです。
    5. 視野ごとの微小管束の頻度を観察します。正常に調製されたサンプルの場合、チャンバーあたり100 μL x 100 μLの視野あたり約3〜4個の微小管束が存在する必要があります。

6. 微小管束の光トラップ実験

  1. 実験前の条件のキャリブレーション
    1. これらの実験を実行するには、剛性が0.05〜0.1 pN / nmのシングルビーム光トラップを使用します。対物レンズのすぐ下とコンデンサーの上にそれぞれショートパスフィルターを導入することにより、トラップ光学系と位置感度光検出器をTIRF対応の倒立顕微鏡に組み込みます(図4)。
    2. さらに、サンプルが置かれているナノポジショニングステージを追加して、ユーザーがこれらのアッセイ中に制御された方法でナノメートルスケールの精度で微小管を移動できるようにします。代表データを取得するためにここで用いられるシステムは、公開された著作物27、53、54、56、57に記載されている。
      注:このプロトコルの範囲を超えていますが、シングルビーム光トラップ58,59,60の構築とキャリブレーションを詳述する複数のリソースが利用可能です。
    3. 明視野またはDICチャンネルと顕微鏡上の100倍対物レンズを使用して、サンプル中のビーズの密度を観察します。明視野顕微鏡はビーズの識別と操作にのみ使用し、蛍光画像取得と同時に記録することはできません。ビーズを互いに平均10μm以上離して間隔を空け、表面閉じ込めや付着がなく、互いに付着したり、クラスター化したりしないようにします。
    4. ビオチン化遠赤色微小管がカバーガラスの表面にしっかりと付着し、微小管軸に沿った動きや溶液中で変動する微小管の自由端など、目に見えるブラウン運動がないことを確認します。
    5. ローダミン微小管が架橋MAPを介してビオチン化微小管に付着し、自由末端で目に見えて変動していることを確認します。非ビオチン化微小管の表面付着は、PEG化が失敗したか、PEGコーティングが劣化した可能性があることを示すことがよくあります。
  2. モーター駆動微小管摺動測定
    1. 公開されているプロトコルに従って、目的のモータータンパク質を発現および精製します。例えば、完全長GFPタグ付きキネシン-5タンパク質は、これらのアッセイ53,61、ならびに非標識キネシン-1262およびキネシン-1463において首尾よく精製および採用されている。上記のステップ4および5で説明したように、モータータンパク質架橋バンドルを組み立てて視覚化します。
    2. ブラウン運動を示す溶液中の遊離シングルビーズを光学トラップで捕捉する。必要に応じてトラップ光学系を調整して、ビードを視野の中央に移動します。トラップビームからの反射干渉パターンが対称であることを確認し、トラップ光学系を調整してビームの非対称性を解決します。
    3. トラップビームによる光退色を最小限に抑えるために、バンドル内のローダミン微小管の自由端がビーズの真下にあり、ビーズが架橋タンパク質を含むオーバーラップ領域から数ミクロン離れるようにサンプルステージを移動します。微小管に衝突するまでZ軸のビードを下げます。ビードを軽く下げるように注意し、カバーガラスの表面にビードを押し付けないでください。
    4. トラップを短時間オフにして、明視野チャネルでスライド微小管に取り付けられたビーズの運動性を観察します。モータータンパク質アッセイを行う場合、微小管がスライドするにつれて、取り付けられたビーズが方向に移動します。トラップを再度アクティブにして、ビーズを再度キャプチャします。
    5. 上記の手順5で最適化されたレーザー出力と露光時間を使用して、3つのチャネル(488 nm、561 nm、640 nm)で1〜2フレーム/秒の速度で蛍光データの記録を開始します。
    6. トラッピングコンピュータソフトウェアを使用して、位置感知光検出器(X、Y、およびSUM強度信号)、ナノポジショニングステージ(X、Y、およびZ座標)、およびTIRFカメラのシャッター状態からの電圧データを記録します。実験要件に応じて、適切なソフトウェア(カスタム記述のLabViewコードなど)によって制御される専用の電圧入力データ集録ボードを使用して、これらのトラップ電圧値のデジタル化を開始します。
    7. データが取得されるときに力信号を監視し、データ収集の成功を妨げる可能性のある異常に細心の注意を払ってください。
      注:異常には、(1)トラップに移動する他のビーズ、(2)トラップから早期に逃げるビーズ、および(3)突然の力の急降下とその後のトラップに対する力の再開始の失敗が含まれますが、これらに限定されませんビーズの表面の厳密キネシン分子の問題を示します。
    8. 測定後、トラップを無効にしてビーズを解放し、必要な実験反復回数が達成されるまで新しいビーズと新しい微小管で繰り返します。
  3. 受動架橋抵抗測定
    1. 公開されているプロトコルに従って、目的の非モーター架橋タンパク質を発現および精製します。例えば、完全長GFP標識PRC143、54、57および二量体NuMA切断構築物56が、これらのアッセイにおいて首尾よく採用されている。上記のステップ4と5で説明したように、架橋バンドルを組み立てて視覚化します。
    2. 2つの微小管のみを含む適切な微小管束を特定します.1つは全面付着でビオチン化され、もう1つは溶液中に部分的に遊離しているビオチン化されていない微小管です。これにより、ビードを取り付けるための自由端が得られ、ビーズが表面結合微小管に取り付けられず、X軸またはY軸のいずれかに整列し、ステージモーションが1つの軸のみに沿って行われることが保証されます。
    3. 光学トラップを使用して、ブラウン運動を受けているフリービードをキャプチャします。ビーズがトラップされたら、ビーズを選択した微小管束に慎重に移動し、その過程で他のビーズがトラップに引き込まれないようにします。GFPタグの光退色を最小限に抑えるために、架橋タンパク質を含むオーバーラップ領域からビーズが数ミクロン離れていることを確認してください。
    4. ローダミン微小管の自由セグメントの端に接触するまで、Z軸のビーズを慎重に下げます。ゆっくりと引き上げ、微小管軸に対して垂直に動かし、ローダミン微小管の曲がりを観察し、ビードの位置を追跡して、付着を確認します。取り付けられていない場合は、ビーズを微小管に軽くぶつけて取り付けるまで繰り返します。
    5. ナノポジショニングステージを移動して、表面付着微小管の微小管軸に沿ってローダミン微小管を慎重に再調整し、微小管束の自動引っ張りのパラメータを設定します。微小管の平行軸に沿った方向を設定し、オーバーラップの長さに応じて、希望のプル速度(25〜200 nm / sが有用な速度範囲です)、および希望のプル時間(約30秒から2分)を設定します。
    6. 3つのチャンネル(488 nm、561 nm、640 nm)の蛍光データを毎秒1〜2フレームの速度で記録し始めます。上記の手順5で最適化されたレーザー出力と露光時間を使用します。
    7. 自動ステージモーションを開始し、位置感知検出器、ステージ、およびTIRFカメラの状態からトラップデータを記録します。(1)トラップに入る別のビーズ、(2)微小管架橋の早期喪失、または(3)ローダミン微小管からのビーズの剥離を含むがこれらに限定されない、データ収集を妨げる可能性のある要因を監視します。
    8. トラップを無効にしてビードを解放し、必要に応じて実験を繰り返します。一般的なサンプルチャンバーは、バンドルの分解とタンパク質活性の損失が発生する前に、約30分間使用できます。
      注:分解効果は使用する架橋剤によって異なりますが、微小管または表面のいずれかに静的な点状突起が形成されたり、非特異的結合を示す微小管変動が失われたり、ビーズを微小管に安定して付着させたりできないこととして現れる可能性があります。

7. 蛍光画像の解析と光トラップ記録の相関

注:データ収集を最適化するには、光学トラップソフトウェア用と蛍光イメージング用の2つの別々のコンピュータ制御システムを採用することが有益です。このセットアップにより、両方の実験モダリティで高速データ取得が可能になり、単一のCPUを使用する場合に発生する可能性のあるデータに導入される操作実行のナノ秒およびマイクロ秒の遅延が排除されます。

  1. 使用するモーターまたは非モーター架橋タンパク質とそれらの予想されるステッピング速度(通常は1〜10kHz)に最適化されたレートで光学トラップデータをデジタル化します。
  2. 位置検出型光検出器からのX、Y、SUM電圧信号、およびナノ位置決めステージのX、Y、Z位置データを、光トラップを制御し、これらのコンポーネントからのデジタル電圧信号をサンプリングするための専用ソフトウェアを使用して記録します。
  3. カメラからのシャッターオープン状態のデジタル信号を、光トラップデータ収集ボード上の追加の電圧入力チャンネルで記録します。これにより、蛍光イメージングデータと光トラップタイムトレースとの相関が可能になります。最初のフレームからのカメラ信号が適切に記録されるように、イメージングを開始する前に光学トラップでデータ収集を開始します。
  4. 必要に応じて、スライディングウィンドウ、メディアンフィルター、ガウスフィルターなどの適切なフィルタリング方法を使用して、高いサンプリングレートで取得した生の時系列データを平均します。
  5. ラインスキャン解析などの方法を用いて蛍光画像の時系列データを定量し、ここで微小管領域の長さに沿った画素強度値が算出される。これらの線から軌道をスキャンし、微小管のエッジ、したがってオーバーラップ領域を特定します。さらに、架橋剤タンパク質チャネルからの蛍光強度を使用して、タンパク質の局在、濃度、および密度を計算します。
  6. 力と画像データの相関は、この実験システムの重要な出力です。例えば、所与のカメラ露光領域内のすべての力データ点(カメラチャネル内の対応するデジタル信号スパイクによって示される)を選択して平均化し、対応する蛍光画像フレームと直接比較する。続いて、力の大きさと架橋タンパク質の数、オーバーラップ長、または架橋剤分布との関係を抽出します。

結果

生物物理学的分析に適した微小管束の調製は、いくつかの重要な基準が満たされれば成功したと見なされます。まず、3色でイメージングすると、オーバーラップ領域を優先的に装飾する架橋タンパク質の濃度を持つ2つの整列した微小管が明らかになります(図5B、C、および図6B)。理想的には、ローダミン微小管のオーバー...

ディスカッション

微小管ネットワークは、本質的に機械的である幅広いタスクを実行するために、無数の細胞タイプによって採用されています。細胞が健康な状態と病気の状態の両方でどのように機能するかを説明するためには、これらのミクロンスケールのネットワークが、それらを集合的に構築するナノメートルサイズのタンパク質によってどのように組織化および制御されているかを理解することが重?...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

著者らは、R21 AG067436(JPおよびSFへ)、T32 AG057464(ETへ)、およびレンセラー工科大学科学学校スタートアップファンド(SFへ)からの支援に感謝したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nmIPG PhotonicsYLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applicationsChromaTRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin ConjugateInvitrogen#MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC gradeFisher Scientific18-608-395
Alpha casein from bovine milkSigma1002484390
ATPFisher ScientificBP413-25
BenzonaseNovagen70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio, Inc.NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta CellsMillipore Sigma71-400-3
CatalaseMP Biomedicals LLC190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objectiveNikonN/A
ChloramphenicolACROS Organics227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslipsFisher ScientificC14784
Delicate Task WipersKimberly-Clark34120
Dextrose AnhydrousFisher ScientificBP3501
D-SucroseFisher ScientificBP220-1
DTTFisher ScientificBP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 BathLAUDA-Brinkmann27709
EDTAFisher ScientificBP118-500
EGTAMillipore Corporation32462-25GM
FIJI / Image Jhttps://fiji.sc/N/A
Frosted Microscope SlidesCorning12-553-1075mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose OxidaseMP Biomedicals LLC195196Type VII, without added oxygen
GMPCPPJena BiosciencesJBS-NU-405SCan be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover GlassThermo Scientific3405
HEPESFisher ScientificBP310-500
ImidazoleFisher Scientific03196-500
IPTGFisher ScientificBP1755-10
Laboratory dessicatorBel-Art999320237190mm plate size
Kanamycin SulfateFischer ScientificBP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6HisGilbert Lab, RPIN/Adoi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
KimwipeKimberley ClarkZ188956lint-free tissue
Immersion Oil, Type BCargille16484
Lens TissueThorLabsMC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm)NikonN/A
LysozymeMP Biomedicals LLC100834
Magnesium Acetate TetrahydrateFisher ScientificBP215-500
Microfuge 18Beckman Coulter367160
MPEG-SVA MW-5000Laysan Bio, Inc.NC0107576
NeutravadinInvitrogenPI31000
Nikon Ti-E inverted microscopeNikonN/ANikon LuN4 Laser
Ni-NTA ResinThermo Scientific88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		IDTN/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		IDTN/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mmBeckman Coulter343755
Optima-TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361544
Paclitaxel (Taxol equivalent)Thermo Fisher ScientificP3456
PIPESACROS Organics172615000
PMSFMillipore7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin labelCytoskeleton, Inc.T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 FluorCytoskeleton, Inc.TL670Mfar red labelled
Porcine Tubulin, RhodamineCytoskeleton, Inc.TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin ProteinCytoskeleton, Inc.T240
Potassium AcetateFisher ScientificBP364-500
Prime 95B sCMOS cameraPhotometricN/A
Quadrant Detector Sensor HeadThorLabsPDQ80A
Quikchange Lightning KitAgilent Technologies210518
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Square Cover GlassesCorning12-553-45018 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin MicrospheresPolysciences Inc.24162-1
Superose-6 ColumnGE Healthcare29-0915--96
TCEPThermo Scientific77720
TLA-100 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator)VevorJPS-08A(DD)304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solutionVector LaboratoriesSP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-DS.C. JohnsonSJN695237

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