JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשחזור צרורות מיקרוטובולים במבחנה וכימות ישיר של הכוחות המופעלים בתוכם באמצעות השמנה אופטית סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. בדיקה זו מאפשרת מדידה ברמה ננומטרית של הכוחות והתזוזות הנוצרים על ידי הרכבי חלבונים בתוך רשתות מיקרוטובולים פעילות.

Abstract

רשתות מיקרוטובולים משמשות בתאים כדי לבצע מגוון רחב של משימות, החל מפעולה כמסלולים להובלת שלפוחית ועד לעבודה כמערכים מיוחדים במהלך מיטוזה כדי לווסת את הפרדת הכרומוזומים. חלבונים המקיימים אינטראקציה עם מיקרוטובולים כוללים מנועים כגון קינסינים ודינאין, שיכולים ליצור כוחות פעילים ותנועה כיוונית, כמו גם חלבונים לא מוטוריים המקשרים חוטים לרשתות מסדר גבוה יותר או מווסתים את דינמיקת החוטים. עד כה, מחקרים ביופיזיים של חלבונים הקשורים למיקרוטובולים התמקדו באופן גורף בתפקידם של חלבונים מוטוריים בודדים הדרושים להובלת שלפוחית, והתקדמות משמעותית הושגה בהבהרת תכונות ייצור הכוח והוויסות המכנוכימי של קינסינים ודינינים. עם זאת, עבור תהליכים שבהם מיקרוטובולים פועלים הן כמטען והן כמסלול, כגון במהלך החלקת נימה בתוך הציר המיטוטי, הרבה פחות מובן על הרגולציה הביופיזית של הרכבים של חלבונים crosslinking המעורבים. כאן אנו מפרטים את המתודולוגיה שלנו לבדיקה ישירה של יצירת כוח ותגובה בתוך רשתות מינימליות של מיקרוטובולים מקושרים המשוחזרים ממיקרוטובולים מטוהרים וחלבונים מיטוטיים. זוגות מיקרוטובולים מוצלבים על ידי חלבונים בעלי עניין, מיקרוטובול אחד משותק לכיסוי מיקרוסקופ, והמיקרוטובול השני עובר מניפולציה על ידי מלכודת אופטית. מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של השתקפות פנימית מלאה בו זמנית מאפשרת הדמיה רב-ערוצית של כל מרכיבי רשת מיקרוטובולים זו כאשר החוטים מחליקים זה מזה כדי ליצור כוח. אנו גם מדגימים כיצד ניתן להשתמש בטכניקות אלה כדי לחקור כוחות דחיפה המופעלים על ידי הרכבי קינסין-5 וכיצד כוחות בלימה צמיגים נוצרים בין זוגות מיקרוטובולים מחליקים המקושרים על ידי המפה המיטוטית PRC1. מבחנים אלה מספקים תובנות על המנגנונים של הרכבה ותפקוד צירים וניתן להתאים אותם באופן רחב יותר לחקר מכניקת רשת מיקרוטובולים צפופה בהקשרים מגוונים, כגון האקסון והדנדריטים של נוירונים ותאי אפיתל קוטביים.

Introduction

תאים משתמשים ברשתות מיקרוטובולים כדי לבצע מגוון רחב של משימות מכניות, החל מהובלת שלפוחית 1,2,3 ועד הפרדת כרומוזומים במהלך מיטוזה 4,5,6. רבים מהחלבונים המקיימים אינטראקציה עם מיקרוטובולים, כגון החלבונים המוטוריים המולקולריים קינזין ודינאין, מייצרים כוחות ומווסתים על ידי עומסים מכניים. כדי להבין טוב יותר כיצד מולקולות קריטיות אלה מתפקדות, חוקרים השתמשו בשיטות ביופיזיקליות של מולקולה בודדת, כגון השמנה אופטית ומיקרוסקופיית TIRF, כדי לנטר ישירות פרמטרים קריטיים כגון קצבי דריכה שנפרקו, תהליכי וקשרי כוח-מהירות עבור חלבונים בודדים. הגיאומטריה הניסויית הנפוצה ביותר הייתה הצמדת חלבונים מוטוריים ישירות ללכידת חרוזים שהגיאומטריה הכדורית שלהם וגודלם מחקים שלפוחיות העוברות תחבורה מונעת מנוע. קינסינים רבים, כולל קינזין-1 7,8,9, קינזין-2 10,11,12, קינזין-3 13,14,15,16 קינזין-517,18, קינזין-8 19,20, כמו גם קומפלקסים של דיינין ודיינין21,22, 23,24,25, נחקרו בשיטות אלה.

בתהליכים תאיים רבים, לעומת זאת, חלבונים מוטוריים ולא מוטוריים משתמשים במיקרוטובולים הן כמסלול והן כמטען26,27. יתר על כן, בתרחישים אלה שבהם חוטי מיקרוטובול מקושרים יחדיו לחבילות מסדר גבוה יותר, חלבונים אלה מתפקדים כהרכבים ולא כיחידות בודדות. לדוגמה, בתוך חלוקת תאים סומטיים, רשתות נימה צפופות מארגנות את עצמן כדי לבנות את מנגנון הציר המיטוטי28,29,30. רשת מיקרוטובול הציר הבין-קוטבי היא דינמית מאוד ומסודרת במידה רבה עם קצוות מינוס המצביעים לעבר קטבי הציר וקצוות פלוס החופפים ליד קו המשווה של הציר. חוטים בתוך הציר מוצלבים על ידי חלבונים מוטוריים כגון קינזין-5 31,32,33, קינסין-12 34,35,36, וקינזין-1437,38,39, או על ידי חלבונים לא מוטוריים כגון PRC1 40,41,42,43 או NuMA 44,45, 46. לעתים קרובות הם נעים או חווים לחץ מכני במהלך תהליכים כגון שטף הקוטב או תוך תיאום ריכוז הכרומוזומים במהלך מטאפאזה או הפרדת כרומוזומים במהלך אנאפאזה 47,48,49,50,51,52. שלמות מנגנון הציר בקנה מידה מיקרוני באמצעות מיטוזה, אם כן, מסתמכת על איזון מוסדר בקפידה של כוחות דחיפה ומשיכה שנוצרו ומתקיימים על ידי רשת זו של חוטים אינטראקציה. עם זאת, הכלים הדרושים כדי לחקור את הוויסות המכני הזה ולהסביר כיצד הרכבי חלבונים פועלים בתיאום כדי לתאם תנועות מיקרוטובולים ולייצר את הכוחות הדרושים להרכבה נכונה של הציר פותחו רק לאחרונה, ואנחנו רק מתחילים להבין את הכללים הביופיזיקליים שמגדירים רשתות מיקרוטובולים דינמיות.

מטרתו של כתב יד זה היא להדגים את הצעדים הנדרשים כדי ליצור מחדש זוגות מיקרוטובולים צולבים במבחנה, לשתק את הצרורות הללו בתא מיקרוסקופיה המאפשר הדמיה פלואורסצנטית סימולטנית הן של המיקרוטובולים והן של חלבונים צולבים ומדידת כוח בקנה מידה ננומטרי, ולעבד נתונים אלה בחוזקה. אנו מפרטים את השלבים הדרושים לפולימריזציה יציבה של מיקרוטובולים בעלי תווית פלואורסצנטית, הכנת כיסויי מיקרוסקופים לחיבור, הכנת חרוזי פוליסטירן לניסויים בלכידה אופטית, והרכבת רשתות נימה צולבות המשמרות את פונקציונליות ה- in vivo שלהם תוך מתן אפשרות למניפולציה ביופיזית ישירה.

Protocol

1. הכנת מיקרוטובולים

הערה: כאשר משתמשים בחלבונים בעלי תווית GFP, אדומים (למשל, רודמין) ואדומים רחוקים (למשל, HiLyte647 שעברו ביוטינילציה, המכונים ביוטינילציה אדומה רחוקה בשאר הטקסט), תיוג פלואורופור אורגני של המיקרוטובולים פועל היטב. ניתן להשיג הצלבה מינימלית בין כל שלושת הערוצים במהלך ההדמיה על ידי שימוש במסנן פלואורסצנטי השתקפות פנימית (TIRF) בעל פס מרובע באיכות גבוהה.

  1. הכן את מלאי זרעי המיקרוטובול GMPCPP
    1. יש להשהות 1 מ"ג של טובולין ליופילי ללא תווית ב-84 מיקרוגרם של קירור כקרח 1x BRB80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA; pH 6.8), כאשר DTT נוסף לריכוז סופי של 1 mM ממש לפני השימוש. להשהות 60 מיקרוגרם של טובולין lyophilized עם תווית פלואורופור ב 6 μL של קר 1x BRB80 עם 1 mM DTT. השהה 60 מיקרוגרם של טובולין ליופילי עם תווית ביוטין ב-6 מיקרוגרם של BRB80 קר 1x עם 1 mM DTT.
    2. כדי להכין מלאי זרעי טובולין ללא ביו-ביוטינילציה עם תווית של 1:10, הוסף 84 μL של טובולין ללא תווית, 6 μL של טובולין עם תווית פלואורופור, ו-10 μL של 10 mM GMPCPP פתרון מלאי לצינור של 0.5 מ"ל. מערבבים היטב על ידי צנרת עדינה ושומרים על קרח.
      הערה: פילמור GMPCPP מועדף עבור בדיקות אלה מכיוון שהמיקרוטובולים יציבים יותר ונוחים למניפולציה ישירה עם המלכודת האופטית מאשר אם פולימרים עם GTP או אם הטקסול מושמט.
    3. כדי להכין מלאי זרעי טובולין עם תווית אדומה של ביוטיניל עם יחס תיוג פלואורסצנטי של 1:10, הוסף 80 μL של טובולין ללא תווית, 6 μL של טובולין המסומן בפלואורופור, 4 μL של טובולין המסומן בביוטין, ו-10 μL של תמיסת מלאי GMPCPP של 10 mM בצינור של 0.5 מ"ל. מערבבים היטב על ידי צנרת עדינה ושומרים על קרח. דגירה של מלאי הזרעים על קרח במשך 5 דקות.
    4. העבר את תמיסת הטובולין לצינור פוליקרבונט המתאים לצנטריפוגה במהירות גבוהה. צנטריפוגה של מלאי הזרעים ב ~ 350,000 x גרם במשך 5 דקות ב 2 °C כדי למנוע פילמור microtubule ולשחזר את supernatant עבור aliquoting. הריכוז המשוער הסופי של טובולין בשלב זה הוא ~ 50 μM.
    5. באמצעות צינורות PCR של 0.2 מ"ל, הכינו 2 μL aliquots של מלאי הזרעים והקפיא הבזק עם חנקן נוזלי. Aliquots ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F) עד 6 חודשים.
  2. פילמור מיקרוטובולים
    1. מכינים 500 מיקרוליטר של 1x BRB80 ומניחים על קרח. יש להניח על הקרח אחד מכל אחד מהביוטינילטים האדומים-רחוקים והלא-ביוטינילטים של זרעי רודמין.
    2. דגירה של מלאי הזרעים על קרח במשך 5 דקות. בסוף תקופת הדגירה, מיד להוסיף 26 μL של 1x BRB80 לכל צינור. אם רוצים מיקרוטובולים ארוכים יותר, הגדילו את הנפח של BRB80 ב-5-10 μL, בעוד שעבור מיקרוטובולים קצרים יותר, הפחיתו את הנפח לפימור ב-5 μL.
    3. דגרו את מלאי זרעי המיקרוטובול למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. שלב 298.5 μL של טמפרטורת החדר 1x BRB80 ו- 1.5 μL של תמיסת מלאי טקסול של 4 mM כדי לייצר תמיסת טקסול של 20 μM. הכינו 300 מיקרו-ליטר של 1x BRB80 ושמרו על שני הצינורות בטמפרטורת החדר.
    4. מחממים רוטור מתאים במהירות גבוהה ל -30 מעלות צלזיוס. ניתן לעשות זאת באולטרה-צנטריפוגה שולחנית המוגדרת ל-30 מעלות צלזיוס. מוציאים את המיקרוטובולים מאמבט המים ושומרים בטמפרטורת החדר על ספסל למשך 10-15 דקות.
  3. בירור מיקרוטובולים
    1. הוסף 100 μL של טמפרטורת החדר 1x BRB80 לתמיסת הצמיחה microtubule ומערבבים על ידי הזזת הצינור ~ 10 פעמים או פיפטציה עדינה. העבירו את תמיסת הגידול של המיקרוטובול לצינור צנטריפוגה מפוליקרבונט.
    2. סמן צד אחד של צינור הפוליקרבונט, אשר יפנה כלפי חוץ ביחס לסיבוב הצנטריפוגה. זה יסייע באיתור כדור microtubule, אשר יהיה בקושי גלוי בשל נפח קטן של חומר.
    3. צנטריפוגה של תמיסת המיקרוטובול ב~350,000 x g למשך 10 דקות ב-30 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, בדוק את הצינור המכיל את המיקרוטובולים עבור גלולה במידת האפשר. הסר את כל המיקרוליטרים האחרונים של נוזל בזהירות, מבלי להפריע את הכדור. אם הכדור אינו נראה בבירור, השתמש בסימון שנעשה כמדריך כדי למנוע הפרעה לאזור שבו נמצא הכדור.
    4. הוסף מיד 100 μL של 1x BRB80 + 20 μM טקסול לצינור microtubule. ניתן להוסיף זאת ישירות על הכדור; שיבוש הכדור בשלב זה אינו משפיע באופן משמעותי על תהליך ההבהרה.
    5. צנטריפוגה המיקרוטובולים שוב ב ~ 350,000 x g במשך 10 דקות, תוך הקפדה לוודא שהחלק המסומן של הצינור מכוון שוב כלפי חוץ ביחס לסיבוב הצנטריפוגה.
    6. הסר את כל המיקרוליטרים של התמיסה מלבד כמה כמו קודם, שוב נזהר כדי למנוע הפרעה גלולה microtubule. חזור על שלבים 1.3.4.-1.3.5. ולאחר מכן להשעות את גלולת microtubule ב 20-50 μL של 1x BRB80 + 20 μM טקסול.
    7. יש להחייתו מחדש על ידי העלאת רוב נפח ההשעיה והוצאתו בעדינות ישירות על הכדור, תוך חזרה על הפעולה 20-30x או עד להחייאת הכדור במלואו. זה צריך להיעשות בזהירות כדי לא לגזוז את microtubules על ידי pipetting נמרץ מדי. חיתוך קצה הפיפטה כדי להגדיל את גודל הפתח יכול גם הוא לעזור להפחית את הטיית המיקרוטובול.
    8. אחסנו את המיקרוטובולים בטמפרטורת החדר על ידי עטיפת הצינור בנייר כסף כדי להגן על הפלואורופורים מפני אור ושמירה על משטח הספסל. מיקרוטובולים ניתנים בדרך כלל לשימוש במשך 2-3 ימים לאחר ההבהרה.
  4. הערכת מיקרוטובולים באמצעות מיקרוסקופיה
    1. הכינו דילול של 1:10 של תמיסת המיקרוטובול המזוקקת על ידי ערבוב של 1 מיקרו-ליטר ו-9 מיקרו-ליטר של טמפרטורת החדר 1x BRB80. דמיינו מיד את התמיסה הזו על ידי הזרמת 10 μL על מגלשת מיקרוסקופ ולאחר מכן הנחת כיסוי מעל הטיפה כדי ליצור דלעת.
    2. ודא כי מיקרוטובולים באורכים הנעים בין 8-25 מיקרומטר בצפיפות גבוהה (כמה מאות לכל שדה ראייה מלא בשכבות ברשת צפופה) נראים לעין כאשר הם מוצגים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומטרה של פי 100 המתמקדת במשטח הכיסוי במגע עם דילול המיקרוטובול.

2. הכנת כיסויים פאסיביים

  1. כיסויי כביסה
    1. הניחו כיסויים בגודל 18 מ"מ x 18 מ"מ בארונות פלסטיק שאינם מגיבים, ולאחר מכן הכניסו כל ארון תקשורת לכוס של 100 מ"ל. הניחו מכסה אחד לכל חריץ במדפים, שכן יש צורך לנקות את שני צידי הכיסויים.
    2. סוניקט באמצעות סוניק אמבטיה במשך 5 דקות, תוך שימוש ב-50 מ"ל של התמיסות הבאות בסדר שניתן עבור כל מחזור סוניקציה: (1) מים שעברו דה-יוניזציה (עם התנגדות של 18.3 MΩ-cm), (2) תמיסת Micro-90 של 2%, (3) מים שעברו דה-יוניזציה, (4) מים טריים שהוכנו 0.1 M KOH, (5) מים שעברו דה-יוניזציה (איור 1A). ודאו שהכיסויים מכוסים במלואם בנוזל. בין מחזורי סוניקציה, יש לשטוף כל מדף של כיסויים במים שעברו דה-יוניזציה על ידי שימוש בפינצטה כדי לטבול את המדף למעלה ולמטה 10-20x במים שעברו דה-יוניזציה, להחליף את המים ולחזור על תהליך השטיפה פי 2.
    3. שטפו את הכיסויים 3x במים, ואז מלאו את הכוסות ב-100% אתנול והחזירו את המדפים לכוסות. העבירו את הכוסות למכסה אדים ופרשו מספיק מגבוני טישו כדי לפנות מקום לכל מדפי הכיסוי. לאחר מכן, להסיר את המדפים עם פינצטה ולהניח על מגבונים רקמות.
    4. באמצעות זרם גז חנקן יבש, יש לפוצץ את האתנול מהכיסויים ומהמדפים שלהם עד לייבוש. השליכו את שאריות האתנול מהכוסות ובאופן דומה ייבשו אותן באמצעות זרם גז החנקן היבש (איור 1A).
  2. פונקציונליזציה של פני השטח של אמינוסילן על כיסויים
    1. הכן (3-אמינופרופיל) תמיסת ריאגנטים מסוג טיאתוקסיסילן (APTES) על ידי הוספת 40 מ"ל של אצטון ו-400 μL של מגיב APTES לצינור חרוטי של 50 מ"ל, תוך סגירה הדוקה וערבוב על ידי היפוך 10x.
    2. הזיזו מתלה אחד של כיסויים לתוך הכוס היבשה המתאימה לו, ולאחר מכן טבלו באופן מלא בתמיסת APTES. דגירה במשך 5 דקות (איור 1A). הזיזו את המדף שטופל ב-APTES לכוס יבשה חדשה, והעבירו מתלה חדש לתוך ה-APTES כדי לדגור במשך 5 מטרים.
    3. יש לשטוף את המדף המטופל במים שעברו דה-יוניזציה על ידי טבילת המדף פי 10-20 כמתואר בשלב 2.1.2., ולהחליף את המים פי 5. חוזרים על הפעולה עד שכל הכיסויים מטופלים ונשטפים.
  3. PEGylation של משטח אמינוזילאן
    1. הכן שני פתרונות PEG, אחד של ~ 100 μL עם 25% w / v PEG ועוד אחד של ~ 10 μL עם 10% w / v ביוטין-PEG, שניהם תלויים ב 0.1 M NaHCO3 מוכן טרי, מספיק כדי לצפות 24 כיסויים. צנטריפוגה תמיסת 25% PEG ב 3,000 x גרם עבור 20 שניות פעם 0.1 M NaHCO3 מתווסף כדי להמיס לחלוטין את PEG; הפתרון עשוי להישאר מעונן. ערבבו את הביוטין-PEG באמצעות צינורות עדינים (איור 1B).
    2. הכינו תערובת של תמיסות PEG וביוטין-PEG, עם נפח גדול פי 33.3 של PEG לנפח אחד של ביוטין-PEG (לדוגמה, 100 μL של תמיסת PEG ו-3 μL של תמיסת ביוטין-PEG).
    3. במכסה אדים, הניחו כמה מגבונים סטריליים ונטולי מוך. הזיזו את מתלי הכיסוי על המגבונים והתייבשו עם זרם גז חנקן יבש כמו קודם. על מספר מגבונים חדשים ויבשים, הניחו את תלושי הכיסוי המיובשים כעת המסודרים בזוגות ותייגו כל אחד מהם בפינה הימנית התחתונה עם סמל אסימטרי כגון "b". סימון זה יהיה מול משטח הדגימה של הכיסוי ולא יפריע לניסוי (איור 1B).
    4. הפוך כיסוי אחד בכל זוג עם פינצטה. על כל כיסוי הפוך, יש להניח 6 μL של תערובת PEG/ביוטין-PEG ולהניח את הכיסוי השני על גביו, כך ששתי התוויות "b" פונות כלפי חוץ.
    5. יישרו את קצוות הכיסוי, והכניסו לתא לח ואטום כדי למנוע התייבשות. יש לדגום את הכיסויים בתא הלחות בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות.
    6. לאחר הדגירה, הסירו את הכיסויים מתא הלחות, הפרידו בזהירות את זוגות הכיסויים והחזירו אותם למדפים שלהם. שטפו כל מתלה במים שעברו דה-יוניזציה כבעבר, טבלו את המדפים בפינצטה פי 10-20 והחליפו את המים בסך הכל פי 5.
    7. מקם את כל הצדדים של הכיסויים עם הפנים לאותו כיוון, כך שלא יהיו שני משטחי כיסוי PEGylated זה מול זה. משטח ה-PEGylated יהיה דביק מאוד עד שהוא יתייבש לחלוטין, לכן יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע מהכיסויים לגעת. ייבשו כל מתלה וכיסויים כמו לפני כן באמצעות זרם גז חנקן יבש (איור 1B).
    8. לאחר שהכיסויים והמדפים שלהם מיובשים במלואם, אחסנו במייבש ואקום כדי למנוע התדרדרות של ציפוי פני השטח. מאוחסן כראוי תחת ואקום ועם חומר ייבוש כדי למנוע לחות לשבש את ציפוי PEG; ניתן להשתמש בכיסויים במשך כשבוע.

3. הכנת חרוזים מצופים קינזין

  1. בחירה והכנה של מבנה קינסין קפדני
    1. אקספרס וטיהור קינסין קפדני בונה על פי פרוטוקולים שפורסמו53,54. הקפאת פלאש 5 μL aliquots של 0.02 מ"ג / מ"ל קינזין פתרונות ולאחסן ב -80 °C למשך עד שנה אחת.
      הערה: לחלבוני קינזין מסוג Rigor יש מוטציה בנקודה G234A המונעת הידרוליזה של ATP. כאשר הם מצומדים למיקרובים, אינטראקציות זיקה גבוהות עם המיקרוטובול מאפשרות לחרוזים לשאת עומסים של 10-20 pN במשך מספר דקות. גרסאות מוטציה קפדניות של הקינזין-1 הומודימר K56053 והן של מבנה K43955 שעבר אופטימיזציה נוספת הופעלו גם הן בהצלחה במבחנים אלה54. מבנה משופר זה של K439 מכיל תחום דימריזציה EB1 לשיפור היציבות ותג C-terminal 6-His לקשירה ספציפית לנוגדן 6-He, כמתואר להלן.
  2. קשירת 6-נוגדן שלו לחרוזים מצופים סטרפטווידין
    1. הוסף חרוזי פוליסטירן מצופים סטרפטווידין בקוטר 50 μL בקוטר 1 מיקרומטר לצינור צנטריפוגה בגודל 0.5 מ"ל. סוניקט במשך 30 שניות.
    2. הוסף 10 μL של 200 mM DTT ל 790 μL של 1x BRB80. הוסף 10 μL של חרוזים סוניים ל 40 μL של זה 1x BRB80 + 2.5 mM DTT buffer.
    3. שלב 1 μL של נוגדן 6-His ביוטינילציה ו 49 μL של 1x BRB80 + 2.5 mM DTT; מערבולת לזמן קצר כדי לערבב.
    4. שלבו את 50 μL של תערובת חרוזים מדוללת ו-50 μL של דילול נוגדנים בצינור חדש. מניחים את הצינור בסיבוב צינור ב 4 מעלות צלזיוס וסובב במשך שעה אחת. סובבו את תערובת החרוזים במשך 10 דקות ב-3,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
    5. לפלוט את הסופר-נאטנט ולתלות מחדש את הכדור ב-100 μL של תמיסת קזאין של 2 מ"ג/מ"ל ב-BRB80 אחד. חזור על צנטריפוגה זו ו resuspension 2x.
  3. תוספת של קינזין קפדנות
    1. יש להשהות את הגלולה הסופית ב-100 מיקרו-ליטר של תמיסת קזאין במינון 2 מ"ג/מ"ל. בצינור צנטריפוגה של 0.5 מ"ל, שלב 5 μL של 0.02 מ"ג / מ"ל קינזין קפדנות ו -5 μL של חרוזים, ערבוב עדין על ידי הזזה קלה של הצינור ~ 10x.
    2. שמור הן את מתלה החרוזים K439 G234A והן את 6-חרוזי ה- שלו הנותרים על הרוטור ב- 4 מעלות צלזיוס כאשר אינם בשימוש. חרוזים חייבים להיות מוכנים טריים ולהשתמש באותו יום עבור הניסויים כפי שהם נוטים להתגבש ולאבד פעילות מעבר לזמן זה.

4. הרכבת תא המיקרוסקופיה

  1. הכנת שקופיות זכוכית ובניית קאמרית
    1. יש לשטוף זכוכית במיקרוסקופ בגודל 75 מ"מ על 25 מ"מ, תחילה במים טהורים במיוחד, לאחר מכן במנקה זכוכית אמוניה ללא פסים, ולאחר מכן פעם נוספת במים טהורים במיוחד. יש לנער כדי להסיר עודפי טיפות מים. ייבשו את השקופיות באמצעות זרם חנקן כך שלא יישארו פסים, הניחו את השקופיות על מגבת נייר (איור 2A).
    2. בעזרת מספריים, חותכים סרט דו צדדי לרצועות של ~ 2-3 מ"מ x 2.5 ס"מ (2 רצועות לכל תא יחיד ו -3 לכל תא כפול).
    3. באמצעות מלקחיים, הניחו שתי רצועות של סרט על מגלשת זכוכית אחת, כך שיש ~ 0.5 ס"מ של רווח ביניהם כדי לבנות תא אחד. עבור תאים כפולים, השתמשו באותו ריווח, אך עם שלוש רצועות של סרט הדבקה (איור 2B). נפח ערוץ המדגם בשיטה זו הוא כ 10 μL.
      הערה: ככל שהתאים(ים) רחבים יותר, כך גדל הסיכוי כי בועות ייווצרו כאשר פתרונות מוזרמים פנימה; עם זאת, תאים ברוחב של פחות מ-0.5 ס"מ עלולים להיות מאתגרים לשימוש בשל השטח המצומצם להדמיה.
    4. מגרדים לאורך כל רצועת סרט באמצעות מלקחיים, כך שהסרט נדבק היטב למגלשת הזכוכית.
    5. שחררו את הלחץ מהמייבש והשתמשו במלקחיים כדי להסיר כיסוי ביוטינילציה אחד ממדף אחסון. יש להניח כיסוי ביוטינילי אחד על גבי מגלשת הזכוכית באמצעות מלקחיים. יש לוודא שהצד הביוטינילי פונה פנימה, לכיוון מגלשת הזכוכית.
    6. באמצעות הקצה האחורי השטוח של המלקחיים, לחץ בעדינות על הזכוכית במקום שבו הכיסוי נוגע בסרט כדי לאטום היטב את התאים. יש להשתמש בלחץ קל כדי להבטיח שהכיסוי לא ייסדק (איור 2C).
    7. אחסנו את תאי המיקרוסקופיה המוגמרים במיכל אטום, הרחק מאור ישיר, עד לשימוש (איור 2D).
      הערה: מומלץ להשתמש בתאים באותו יום שבו הם מיוצרים, שכן הכיסויים הביוטינילטים מתפרקים כאשר הם נחשפים לאוויר.
  2. זרימה פנימה של ריאגנטים במיקרוסקופיה
    1. בנו תא לחות על ידי הצבת רקמה מקופלת נטולת מוך שהורטבה במים טהורים במיוחד בתחתית קופסת קצה פיפטה ריקה. יש לשמור את תאי הדגימה בתיבה זו בין שלבי זרימה כדי להפחית את אידוי הפתרונות מהערוץ.
    2. הציגו את כל הריאגנטים על ידי ניפוח הנוזל בקצה אחד של הערוץ ופתילת נוזל החוצה בקצה הנגדי. כדי לפתל, סובבו קצה אחד של הרקמה והניחו אותו בעדינות בצד היציאה של התא, כדי לאפשר לפעולה נימית להפיץ את הריאגנט בצורה הומוגנית (איור 3A). הביאו את כל הריאגנטים לטמפרטורת החדר רגע לפני הזרימה פנימה כדי למנוע דה-פולימריזציה של מיקרוטובולים.
    3. באמצעות קצה פיפטה זוויתי של 20 μL כך שהוא נוגע בצד הכניסה של תא אחד, זורמים באיטיות ב-10 μL של 0.5 מ"ג/מ"ל סטרפטווידין או נויטרווידין. השתמשו בקצות פיפטה קטנים יותר ובזרימה איטית וקבועה של ריאגנטים כדי להקטין את הסבירות להשגת בועות בתא (איור 3B).
    4. דגירה של המגלשה בתא הלחות למשך 4 דקות כאשר צד הכיסוי של התא פונה כלפי מטה. כיוון זה יאפשר לעצמים גדולים יותר, כגון מיקרוטובולים או חרוזים, לשקוע ליד פני השטח של PEGylated.
    5. יש לשטוף את התא באמצעות 20 מיקרוגרם של BRB80 1x, באמצעות רקמה נטולת מוך כדי לשאוב נוזלים. אם יש דליפה בחדר, להשליך את השקופית ולהתחיל עם אחד אחר; בועות קטנות המתרחשות בתא לא יפגעו בהדמיה.
    6. חזור על שלבי הזרימה, הדגירה וההדחה עם 10 μL של תמיסת חסימת קזאין של 0.5 מ"ג/מ"ל (איור 3C). לדלל מיקרוטובולים אדומים רחוקים ~1:20 ולהזרים 10 μL לתוך התא. דגרו במשך 5 דקות ושטפו את התא עם 20 מיקרו-ליטר של 1x BRB80 (איור 3D). הצפיפות האופטימלית של מיקרוטובולים אלה בשדה ראייה של 100 מיקרומטר על 100 מיקרומטר צריכה להיות 10-20; ויש להתאים את הדילול בשלב זה כדי להשיג יחס קשירת פני שטח זה.
    7. חזור על שלבי הזרימה, הדגירה וההדחה עם 10 μL של ריכוז מתאים (בדרך כלל 1-10 ננומטר) של מנוע crosslinking או חלבון לא מוטורי כדי לחקור (איור 3E).
    8. זרימה ב-10 μL של מיקרוטובולים של רודמין מדוללת לריכוז דומה לזה של המיקרוטובולים האדומים הרחוקים הקודמים. חזור על שלבי הדגירה וההדחה (איור 3F).
    9. שלבו 1 μL של חרוזים מצופים קינזין קשיחה ו-19 μL של מאגר תגובה הממוטב לפעילות חלבונים צולבת. לדוגמה, לניתוח פעילות קינזין-5, השתמש במאגר תגובה עם מפסק קשר TCEP של 1 mM, 0.2 מ"ג/מ"ל אלפא קזאין, 70 mM KCl, מערכת נטרול חמצן (4.5 מ"ג/מ"ל גלוקוז, 350 יחידות/מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 34 יחידות/מ"ל קטלאז), 1 mM DTT ו-ATP בריכוז הרצוי (למשל, 1 mM לתנאי מהירות קינזין מרביים) ב-1x BRB80 (איור 3G ). לניתוח של חלבונים לא מוטוריים, השמט ATP ושנה את ריכוז KCl כדי לווסת את חוזק האינטראקציה בין חלבון למיקרוטובול במבחנים אלה.
    10. אטמו את שני קצוות התא עם לק שקוף והמתינו עד שהלק יתייבש לפני ההדמיה (איור 3H). תא שנבנה בהצלחה לא יכלול דליפה ובועות מינימליות.

5. הדמיית חבילות מיקרוטובולים עם TIRF בשלושה צבעים

  1. השתמשו במכשיר מיקרוסקופ הפוך בעל יכולות הדמיה של TIRF, ולתוכו נבנתה מלכודת אופטית של קרן אחת (איור 4).
    הערה: עבור המחקרים המתוארים כאן, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך עם עדשת שמן 100x/NA1.49, מודול TIRF ושלושה לייזרים ב-488 ננומטר, 561 ננומטר ו-640 ננומטר עבור החלבון המתויג ב-GFP, מיקרוטובולים המסומנים ברודאמין ומיקרוטובולים בעלי תווית אדומה רחוקה, בהתאמה.
    1. יש להוסיף טיפה אחת של שמן טבילה על מכסה תא הדגימה. עודף שמן עלול לפגוע במטרה של המיקרוסקופ. כאשר צד הכיסוי של תא הדגימה פונה כלפי מטה, הנח את הדגימה להדמיה על פלטפורמת המיקרוסקופ.
    2. לאט לאט להעלות את המטרה כך שיהיה מגע בין הכיסוי לבין המטרה דרך השמן. התאם את הגובה האובייקטיבי כך שמשטח הכיסוי של תא הדגימה יהיה במוקד.
    3. הקלט תמונות במסגרת אחת של הדגימה בכל שלושת הערוצים. עבור הניסויים כאן, השתמש בחשיפה של 100-200 אלפיות השנייה כמשך הדמיה אופטימלי בכל שלושת הערוצים; זמני חשיפה ארוכים יותר עלולים לגרום להלבנת תמונות מוגברת.
    4. כוונן את עוצמת הלייזר כדי להשיג יחס אות לרעש טוב מהדגימות תוך מזעור הלבנת הצילום במשך 2-5 דקות כאשר החבילה הבודדת נבדקת. עבור הלייזר המשמש כאן (איור 4 ואיור 5), השתמש בעוצמת לייזר של 5 mW עבור ערוץ GFP ו- 3 mW עבור שני ערוצי המיקרוטובול כאופטימליים.
      הערה: צרורות שהורכבו בהצלחה צריכים לכלול מיקרוטובול אחד משותק על פני השטח בתעלה האדומה הרחוקה, אזור דו-קיום של כמה מיקרונים עם אות חלבון GFP משמעותי, ומיקרוטובול רודמין החופף לאזורים אלה ולאחר מכן מתרחב במרחק של כמה מיקרונים מהצרור (איור 5B,C ואיור 6 ). הדמיה חיה של מיקרוטובול הרודאמין אמורה לחשוף תנודות עדינות בקצה המיקרוטובול שאינו מקושר, מה שמעיד על כך שנימה זו אינה מחוברת לפני השטח או לחלבונים אחרים בחדר.
    5. שימו לב לתדירות של צרורות מיקרוטובולים לכל שדה ראייה. עבור מדגם מוכן בהצלחה, צריך להיות כ 3-4 חבילות microtubule נוכחים לכל 100 μL x 100 μL שדה ראייה לכל תא.

6. ביצוע ניסויי מלכודת אופטיים על צרורות מיקרוטובולים

  1. כיול טרום ניסיוני של תנאים
    1. כדי לבצע ניסויים אלה, השתמש במלכודת אופטית של קרן אחת עם קשיחות של 0.05-0.1 pN/nm. שלבו את אופטיקת הלכידה ואת הפוטודקטור הרגיש למיקום במיקרוסקופ הפוך בעל יכולת TIRF על-ידי הצגת מסנני מעבר קצרים ממש מתחת למטרה ומעל המעבה, בהתאמה (איור 4).
    2. בנוסף, הוסף שלב ננו-מיקום שעליו יושבת הדגימה כדי לאפשר למשתמש להזיז את המיקרוטובולים בדיוק בקנה מידה ננומטרי באופן מבוקר במהלך מבחנים אלה. המערכת המשמשת כאן להשגת נתונים מייצגים תוארה בעבודה שפורסמה 27,53,54,56,57.
      הערה: אם כי מעבר להיקף של פרוטוקול זה, קיימים משאבים מרובים המפרטים את הבנייה והכיול של השמנה אופטית שלקרן יחידה 58,59,60.
    3. שימו לב לצפיפות החרוזים בדגימה באמצעות שדה בהיר או ערוץ DIC והמטרה פי 100 במיקרוסקופ. השתמש במיקרוסקופיית brightfield רק כדי לזהות חרוזים ולתפעל אותם, ולא כדי להקליט בו-זמנית עם רכישת תמונה פלואורסצנטית. מרווחים את החרוזים כך שיהיו במרחק מינימלי של 10 מיקרומטר זה מזה בממוצע, וודאו שהם נקיים מכל סוג של כליאה או חיבור של פני השטח ואינם מחוברים זה לזה או להתקבצות אחרת.
    4. ודא שהמיקרוטובולים האדומים הרחוקים מחוברים היטב לפני השטח של הכיסוי, ללא תנועה בראונית נראית לעין, כגון תנועות לאורך ציר המיקרוטובול או קצוות חופשיים של מיקרוטובולים המשתנים בתמיסה.
    5. ודא שהמיקרוטובולים של הרודמין מחוברים למיקרוטובולים שעברו ביוטינילציה באמצעות המפה הצולבת והם משתנים באופן ניכר בקצוות החופשיים שלהם. חיבור פני השטח של מיקרוטובולים שאינם ביוטינילטים מצביע לעתים קרובות על כך שייתכן ש-PEGylation לא הצליח או שהציפוי PEG התדרדר.
  2. מדידות הזזה של מיקרוטובולים עם הנעה מוטורית
    1. להביע ולטהר את החלבון המוטורי המעניין בעקבות פרוטוקולים שפורסמו. לדוגמה, חלבוני קינזין-5 המתויגים באורך מלא של GFP טוהרו בהצלחה ונעשה בהם שימוש במבחנים אלה 53,61, כמו גם קינזין-1262 וקינזין-14 63 ללא תווית. הרכיבו ודמיינו חבילות של חלבונים מוטוריים כמתואר לעיל בשלבים 4 ו-5.
    2. צלם באמצעות המלכודת האופטית חרוז יחיד חינם בתמיסה המציגה תנועה בראונית. התאימו את אופטיקת ההשמנה לפי הצורך כדי להזיז את החרוז לאמצע שדה הראייה. ודא שתבנית ההפרעה המוחזרת מקרן ההשמנה סימטרית והתאם את אופטיקת ההשמנה כדי לפתור אסימטריות של קרן.
    3. הזיזו את שלב הדגימה כך שהקצה החופשי של מיקרוטובול רודאמין בתוך צרור יהיה ישירות מתחת לחרוז והחרוז יהיה במרחק של כמה מיקרונים מאזור החפיפה המכיל חלבונים צולבים כדי למזער את ההלבנה הנגרמת על ידי קרן מלכודת. מנמיכים את החרוז בציר Z עד שהוא מתנגש במיקרוטובול. הקפידו להוריד את החרוז בעדינות, ואל תדחפו את החרוז כנגד משטח הכיסוי, שכן הדבר עלול לגרום להידבקות למשטח הכיסוי.
    4. כבו לרגע את המלכודת כדי לצפות עם ערוץ השדה הבהיר בתנועתיות החרוז המחובר למיקרוטובול המחליק. בעת ביצוע בדיקות חלבון מוטוריות, החרוז המצורף ינוע בכיוון כאשר המיקרוטובולים יחליקו זה מזה. הפעל מחדש את ההשמנה ולכוד שוב את החרוז.
    5. התחל להקליט נתוני פלואורסצנטיות בשלושת הערוצים (488 ננומטר, 561 ננומטר, 640 ננומטר) בקצב של 1-2 פריימים לשנייה באמצעות עוצמת הלייזר וזמני החשיפה שהיו ממוטבים בשלב 5 לעיל.
    6. באמצעות תוכנת מחשב הלכידה, רשום נתוני מתח מהפוטודקטור הרגיש למיקום (אותות עוצמת X, Y ו- SUM), שלב הננו-מיקום (קואורדינטות X, Y ו- Z) ומצב תריס המצלמה TIRF. התחל להפוך את ערכי מתח המלכודת הללו לדיגיטליים באמצעות לוח קליטת נתוני כניסה מתח ייעודי הנשלט על ידי תוכנה מתאימה (כגון קוד LabView שנכתב בהתאמה אישית) בקצב של 1-10 קילוהרץ, בהתאם לדרישות הניסוי.
    7. עקוב אחר אות הכוח בעת רכישת הנתונים ושים לב לכל חריגה שעלולה להפריע לאיסוף נתונים מוצלח.
      הערה: האנומליות כוללות אך אינן מוגבלות ל-(1) חרוזים אחרים הנעים לתוך המלכודת, (2) החרוז שנמלט מהמלכודת בטרם עת, ו-(3) צניחה פתאומית של כוח וכישלון להפעיל מחדש את הכוח נגד המלכודת, מה שמעיד על בעיות עם מולקולות הקינזין הקפדניות על פני השטח של החרוז.
    8. לאחר המדידה, השביתו את המלכודת כדי לשחרר את החרוז וחזרו על הפעולה עם חרוז חדש ומיקרוטובול חדש עד שיושג המספר הנדרש של חזרות ניסיוניות.
  3. מדידות התנגדות פסיביות של crosslinking
    1. לבטא ולטהר את החלבונים הלא-מוטוריים המעניינים בעקבות פרוטוקולים שפורסמו. לדוגמה, PRC1 43,54,57 באורך מלא עם תווית GFP ומבנה56 חתוך של NuMA דימרי הופעלו בהצלחה במבחנים אלה. הרכב והצג באופן חזותי את החבילות המקושרות כמתואר לעיל בשלבים 4 ו- 5.
    2. זהה צרור מיקרוטובולים מתאים המכיל רק שני מיקרוטובולים, אחד ביוטינילציה עם חיבור מלא לפני השטח ומיקרוטובול אחד שאינו ביוטינילציה שהוא חופשי חלקית בתמיסה; זה נותן קצה חופשי לחיבור חרוז ומבטיח שהחרוז לא מחובר למיקרוטובול הקשור לפני השטח ומיושר על ציר X או Y, כך שתנועת הבמה תהיה לאורך ציר אחד בלבד.
    3. השתמש במלכודת האופטית כדי ללכוד חרוז חופשי העובר תנועה בראונית. לאחר לכידת החרוז, העבירו בזהירות את החרוז אל צרור המיקרוטובולים שנבחר, כדי להבטיח שלא יימשכו חרוזים אחרים למלכודת בתהליך. ודא שהחרוז נמצא במרחק של כמה מיקרונים מאזור החפיפה המכיל חלבונים צולבים כדי למזער את ההלבנה של תג GFP.
    4. מנמיכים בזהירות את החרוז בציר Z עד שהוא יוצר מגע עם קצה הקטע החופשי של מיקרוטובול הרודמין. משכו כלפי מעלה בעדינות ועברו בניצב לציר המיקרוטובול כדי לבדוק את החיבור על ידי התבוננות בכיפוף המיקרוטובול של הרודמין ומעקב אחר מיקום החרוז. אם לא מחוברים, חוזרים על החבטה העדינה של החרוז על המיקרוטובול עד לחיבור.
    5. יישרו מחדש בזהירות את המיקרוטובול של הרודמין לאורך ציר המיקרוטובול של המיקרוטובול המחובר לפני השטח על ידי הזזת שלב הננו-מיקום והגדרת הפרמטרים למשיכה אוטומטית של צרור המיקרוטובולים. קבעו את הכיוון לאורך הציר המקביל של המיקרוטובולים, קבעו את מהירות המשיכה הרצויה (25-200 ננומטר לשנייה הוא טווח מהירויות שימושי), ואת זמן המשיכה הרצוי (כ-30 שניות עד 2 דקות) בהתאם לאורך החפיפה.
    6. התחל להקליט נתוני פלואורסצנציה בשלושת הערוצים (488 ננומטר, 561 ננומטר, 640 ננומטר) בקצב של 1-2 פריימים לשנייה. השתמש בעוצמות לייזר ובזמני חשיפה הממוטבים בשלב 5 לעיל.
    7. התחל תנועה אוטומטית של הבמה ותעד נתוני השמנה מהגלאי, הבמה ומצב המצלמה TIRF הרגישים למיקום. עקוב אחר כל הגורמים שעלולים להפריע לאיסוף הנתונים, הכוללים אך אינם מוגבלים ל- (1) חרוז נוסף שנכנס למלכודת, (2) אובדן מוקדם של קישור צולב של מיקרוטובול, או (3) ניתוק חרוזים מהמיקרוטובול של הרודמין.
    8. השביתו את המלכודת כדי לשחרר את החרוז וחזרו על הניסוי כרצונכם. תא דגימה טיפוסי יכול לשמש במשך כ -30 דקות לפני השפלה של צרורות ואובדן של פעילות חלבון מתרחשת.
      הערה: השפעות ההשפלה ישתנו בהתאם לשימוש ב-crosslinker, אך הן יכולות להתבטא בהיווצרות פונקטה סטטית על המיקרוטובולים או על פני השטח, אובדן תנודות מיקרוטובולים המצביעות על קשירה לא ספציפית, או חוסר יכולת לחבר ביציבות חרוזים למיקרוטובולים.

7. ניתוח נתונים וקורלציה של תמונות פלואורסצנטיות עם רשומות השמנה אופטיות

הערה: כדי למטב את איסוף הנתונים, כדאי להשתמש בשתי מערכות בקרת מחשב נפרדות: אחת עבור תוכנת ההשמנה האופטית והשנייה עבור ההדמיה הפלואורסצנטית. הגדרה זו מאפשרת קליטת נתונים במהירות גבוהה הן באופנים ניסיוניים והן מבטלת עיכובים של ננו-שניות ומיקרו-שניות בביצוע הפעולה המוצגים לנתונים, שיכולים להתעורר בעת שימוש במעבד יחיד.

  1. הפוך את נתוני ההשמנה האופטית לדיגיטליים בקצב המותאם לחלבוני ההצלבה של המנוע או המנוע שאינם מנועים ולקצבי הדריכה הצפויים שלהם (למשל, בדרך כלל בין 1-10 קילוהרץ).
  2. הקלט אותות מתח X, Y ו- SUM מהפוטודקטור הרגיש למיקום, כמו גם את נתוני המיקום X, Y ו- Z של שלב מיקום הננו באמצעות תוכנה ייעודית לשליטה במלכודת האופטית ודגימת אותות המתח הדיגיטליים מרכיבים אלה.
  3. הקלט את האות הדיגיטלי במצב פתיחת תריס מהמצלמה באמצעות ערוץ כניסת מתח נוסף בלוח איסוף נתוני ההשמנה האופטי. זה מאפשר קורלציה של נתוני ההדמיה הפלואורסצנטית עם עקבות זמן ההשמנה האופטית. התחל לאסוף נתונים עם ההשמנה האופטית לפני תחילת ההדמיה כך שאות המצלמה מהמסגרת הראשונה יירשם כראוי.
  4. ממוצע נתוני סדרות הזמן הגולמי הנרכשים בקצבי דגימה גבוהים באמצעות שיטת סינון מתאימה, כגון חלון הזזה, מסנן חציוני או מסנן גאוס, בהתאם לצרכים.
  5. כמת את נתוני סדרת הזמן של התמונה הפלואורסצנטית באמצעות שיטות כגון ניתוח קווים, שבו מחושב ערך עוצמת הפיקסלים לאורך אזור המיקרוטובול. מתוך מסלולים אלה ניתן לזהות, לזהות את קצוות microtubule, ולכן, את אזורי החפיפה. בנוסף, השתמש בעוצמת הפלואורסצנטיות מתעלת החלבון crosslinker כדי לחשב לוקליזציה, ריכוז וצפיפות חלבונים.
  6. מתאם של כוח ונתוני תמונה הוא תוצר חיוני של מערכת ניסויית זו. לדוגמה, בחר וממוצע את כל נקודות נתוני הכוח בתוך אזור חשיפה נתון של מצלמה (מסומן על-ידי קפיצת האות הדיגיטלית המתאימה בערוץ המצלמה) כדי להשוות ישירות למסגרת התמונה הפלואורסצנטית המתאימה. לאחר מכן, חלץ את הקשרים בין גודל הכוח לבין מספר החלבונים המקושרים, אורך חפיפה או התפלגות crosslinker.

תוצאות

הכנת חבילות מיקרוטובול המתאימות לניתוח ביופיזי נחשבת מוצלחת אם מתקיימים כמה מהקריטריונים המרכזיים. ראשית, הדמיה בשלושה צבעים אמורה לחשוף שני מיקרוטובולים מיושרים עם ריכוז של חלבון crosslinking המקשט באופן מועדף את אזור החפיפה (איור 5B,C ואיור 6B

Discussion

רשתות מיקרוטובולים משמשות מספר עצום של סוגי תאים כדי לבצע מגוון רחב של משימות שהן מכניות במהותן. כדי לתאר כיצד תאים מתפקדים הן במצב בריא והן במצב של מחלות, חיוני להבין כיצד רשתות בקנה מידה מיקרוני אלה מאורגנות ומווסתות על-ידי חלבונים בגודל ננומטר שבונים אותן יחד. כלים ביופיזיקליים כגון פי?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות על תמיכה מ- R21 AG067436 (ל- JP ו- SF), T32 AG057464 (ל- ET), ו- Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (ל- SF).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nmIPG PhotonicsYLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applicationsChromaTRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin ConjugateInvitrogen#MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC gradeFisher Scientific18-608-395
Alpha casein from bovine milkSigma1002484390
ATPFisher ScientificBP413-25
BenzonaseNovagen70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio, Inc.NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta CellsMillipore Sigma71-400-3
CatalaseMP Biomedicals LLC190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objectiveNikonN/A
ChloramphenicolACROS Organics227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslipsFisher ScientificC14784
Delicate Task WipersKimberly-Clark34120
Dextrose AnhydrousFisher ScientificBP3501
D-SucroseFisher ScientificBP220-1
DTTFisher ScientificBP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 BathLAUDA-Brinkmann27709
EDTAFisher ScientificBP118-500
EGTAMillipore Corporation32462-25GM
FIJI / Image Jhttps://fiji.sc/N/A
Frosted Microscope SlidesCorning12-553-1075mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose OxidaseMP Biomedicals LLC195196Type VII, without added oxygen
GMPCPPJena BiosciencesJBS-NU-405SCan be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover GlassThermo Scientific3405
HEPESFisher ScientificBP310-500
ImidazoleFisher Scientific03196-500
IPTGFisher ScientificBP1755-10
Laboratory dessicatorBel-Art999320237190mm plate size
Kanamycin SulfateFischer ScientificBP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6HisGilbert Lab, RPIN/Adoi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
KimwipeKimberley ClarkZ188956lint-free tissue
Immersion Oil, Type BCargille16484
Lens TissueThorLabsMC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm)NikonN/A
LysozymeMP Biomedicals LLC100834
Magnesium Acetate TetrahydrateFisher ScientificBP215-500
Microfuge 18Beckman Coulter367160
MPEG-SVA MW-5000Laysan Bio, Inc.NC0107576
NeutravadinInvitrogenPI31000
Nikon Ti-E inverted microscopeNikonN/ANikon LuN4 Laser
Ni-NTA ResinThermo Scientific88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		IDTN/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		IDTN/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mmBeckman Coulter343755
Optima-TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361544
Paclitaxel (Taxol equivalent)Thermo Fisher ScientificP3456
PIPESACROS Organics172615000
PMSFMillipore7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin labelCytoskeleton, Inc.T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 FluorCytoskeleton, Inc.TL670Mfar red labelled
Porcine Tubulin, RhodamineCytoskeleton, Inc.TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin ProteinCytoskeleton, Inc.T240
Potassium AcetateFisher ScientificBP364-500
Prime 95B sCMOS cameraPhotometricN/A
Quadrant Detector Sensor HeadThorLabsPDQ80A
Quikchange Lightning KitAgilent Technologies210518
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Square Cover GlassesCorning12-553-45018 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin MicrospheresPolysciences Inc.24162-1
Superose-6 ColumnGE Healthcare29-0915--96
TCEPThermo Scientific77720
TLA-100 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator)VevorJPS-08A(DD)304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solutionVector LaboratoriesSP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-DS.C. JohnsonSJN695237

References

  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-mediated transport. Traffic. 20 (11), 851-866 (2019).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Helmke, K. J., Heald, R., Wilbur, J. D. Interplay between spindle architecture and function. International Review of Cell and Molecular Biology. 306, (2013).
  5. Elting, M. W., Suresh, P., Dumont, S. The spindle: integrating architecture and mechanics across scales. Trends in Cell Biology. 28 (11), 896-910 (2018).
  6. Kapoor, T. Metaphase spindle assembly. Biology. 6 (1), 8 (2017).
  7. Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
  8. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  9. Schnitzer, M. J., Visscher, K., Block, S. M. Force production by single kinesin motors. Nature Cell Biology. 2 (10), 718-723 (2000).
  10. Andreasson, J. O. L., Shastry, S., Hancock, W. O., Block, S. M. The mechanochemical cycle of mammalian kinesin-2 KIF3A/B under load. Current Biology. 25 (9), 1166-1175 (2015).
  11. Bensel, B. M. The mechanochemistry of the kinesin-2 kif3ac heterodimer is related to strain-dependent kinetic properties of kif3a and kif3c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15632-15641 (2020).
  12. Gilbert, S. P., Guzik-Lendrun, S., Rayment, I. Kinesin-2 motors: kinetics and biophysics. Journal of Biological Chemistry. 293 (12), 4510-4518 (2018).
  13. Okada, Y., Higuchi, H., Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through binding to tubulin. Nature. 424 (6948), 574-577 (2003).
  14. Budaitis, B. G., et al. Pathogenic mutations in the kinesin-3 motor KIF1A diminish force generation and movement through allosteric mechanisms. Journal of Cell Biology. 220 (4), 202004227 (2021).
  15. Tomishige, M., Klopfenstein, D. R., Vale, R. D. Conversion of Unc104/KIF1A kinesin into a processive motor after dimerization. Science. 297 (5590), 2263-2267 (2002).
  16. Siddiqui, N., et al. Force generation of KIF1C is impaired by pathogenic mutations. bioRxiv. , (2021).
  17. Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
  18. Valentine, M. T., Gilbert, S. P. To step or not to step? How biochemistry and mechanics influence processivity in Kinesin and Eg5. Current Opinion in Cell Biology. 19 (1), 75-81 (2007).
  19. Jannasch, A., Bormuth, V., Storch, M., Howard, J., Schäffer, E. Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state. Biophysical Journal. 104 (11), 2456-2464 (2013).
  20. Bormuth, V., Varga, V., Howard, J., Schäffer, E. Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules. Science. 325 (5942), 870-873 (2009).
  21. Gennerich, A., Carter, A. P., Reck-Peterson, S. L., Vale, R. D. Force-induced bidirectional stepping of cytoplasmic dynein. Cell. 131 (5), 952-965 (2007).
  22. Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J., Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature. 427 (6975), 649-652 (2004).
  23. Redwine, W. B., et al. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. eLife. 6, 28257 (2017).
  24. Belyy, V., Hendel, N. L., Chien, A., Yildiz, A. Cytoplasmic dynein transports cargos via load-sharing between the heads. Nature Communications. 5 (1), 5544 (2014).
  25. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  26. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  27. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  28. Dumont, S., Mitchison, T. J. Force and length in the mitotic spindle. Current Biology. 19 (17), 749-761 (2009).
  29. McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Biophysics of mitosis. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (2), 147-207 (2012).
  30. McIntosh, J., Hays, T. A brief history of research on mitotic mechanisms. Biology. 5 (4), 55 (2016).
  31. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Seminars in Cell and Developmental Biology. 21 (3), 255-259 (2010).
  32. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  33. Vukušić, K., Ponjavić, I., Buđa, R., Risteski, P., Tolić, I. M. Microtubule-sliding modules based on kinesins EG5 and PRC1-dependent KIF4A drive human spindle elongation. Developmental Cell. 56 (9), 1253-1267 (2021).
  34. Sturgill, E. G., Ohi, R. Kinesin-12 differentially affects spindle assembly depending on its microtubule substrate. Current Biology. 23 (14), 1280-1290 (2013).
  35. Drechsler, H., McHugh, T., Singleton, M. R., Carter, N. J., McAinsh, A. D. The Kinesin-12 Kif15 is a processive track-switching tetramer. eLife. 3, 01724 (2014).
  36. Tanenbaum, M. E., et al. Kif15 Cooperates with Eg5 to promote bipolar spindle assembly. Current Biology. 19 (20), 1703-1711 (2009).
  37. Mountain, V., et al. Cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 147 (2), 351-365 (1999).
  38. Norris, S. R., et al. Microtubule minus-end aster organization is driven by processive HSET-tubulin clusters. Nature Communications. 9 (1), 2659 (2018).
  39. Cai, S., Weaver, L. N., Ems-McClung, S. C., Walczak, C. E. Proper organization of microtubule minus ends is needed for midzone stability and cytokinesis. Current Biology. 20 (9), 880-885 (2010).
  40. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
  41. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  42. Zhu, C., Lau, E., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E., Jiang, W. Spatiotemporal control of spindle midzone formation by PRC1 in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6196-6201 (2006).
  43. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  44. Elting, M. W., Prakash, M., Udy, D. B., Dumont, S. Mapping load-bearing in the mammalian spindle reveals local kinetochore fiber anchorage that provides mechanical isolation and redundancy. Current Biology. 27 (14), 2112-2122 (2017).
  45. Fant, X., Merdes, A., Haren, L. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA. International Review of Cytology. 238, 1-57 (2004).
  46. Merdes, A., Heald, R., Samejima, K., Earnshaw, W. C., Cleveland, D. W. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMA). Journal of Cell Biology. 149 (4), 851-861 (2000).
  47. Maddox, P., Straight, A., Coughlin, P., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Direct observation of microtubule dynamics at kinetochores in Xenopus extract spindles: Implications for spindle mechanics. Journal of Cell Biology. 162 (3), 377-382 (2003).
  48. Maddox, P., Desai, A., Oegema, K., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Poleward microtubule flux is a major component of spindle dynamics and anaphase A in mitotic Drosophila embryos. Current Biology. 12 (19), 1670-1674 (2002).
  49. LaFountain, J. R., Cohan, C. S., Siegel, A. J., LaFountain, D. J. Direct visualization of microtubule flux during metaphase and anaphase in crane-fly spermatocytes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5724-5732 (2004).
  50. Pavin, N., Tolić, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  51. Vukušić, K., Tolić, I. M. Anaphase B: Long-standing models meet new concepts. Seminars in Cell and Developmental Biology. 117, 127-139 (2021).
  52. Vukušić, K., et al. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes. Developmental Cell. 43 (1), 11-23 (2017).
  53. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  54. Gaska, I., Armstrong, M. E., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts like a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 367-378 (2020).
  55. Woll, K. A., et al. An allosteric propofol-binding site in kinesin disrupts kinesin-mediated processive movement on microtubules. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11283-11295 (2018).
  56. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  57. Alfieri, A., Gaska, I., Forth, S. Two modes of PRC1-mediated mechanical resistance to kinesin-driven microtubule network disruption. Current Biology. 31 (12), 2495-2506 (2021).
  58. Koch, M. D., Shaevitz, J. W. Introduction to optical tweezers. Methods in Molecular Biology. 1486, 3-24 (2017).
  59. Sarshar, M., Wong, W. T., Anvari, B. Comparative study of methods to calibrate the stiffness of a single-beam gradient-force optical tweezers over various laser trapping powers. Journal of Biomedical Optics. 19 (11), 115001 (2014).
  60. Van Mameren, J., Wuite, G. J. L., Heller, I. Introduction to optical tweezers: Background, system designs, and commercial solutions. Methods in Molecular Biology. 783, 1-20 (2011).
  61. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9, 51131 (2020).
  62. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology:CB. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  65. . SMART - Servier Medical ART Available from: https://smart.servier.com/ (2022)
  66. Gaska, I., Armstrong, M., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts as a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 1-14 (2020).
  67. Janson, M. E., De Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  68. Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
  69. Powers, A. F., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  70. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  71. Fong, K. K., et al. Direct measurement of the strength of microtubule attachment to yeast centrosomes. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1853-1861 (2017).
  72. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
  73. Memet, E., et al. Microtubules soften due to cross-sectional flattening. eLife. 7, 34695 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved