JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يهدف البروتوكول إلى أن يكون بمثابة مخطط للجامعات والمنظمات الأخرى التي تفكر في إجراء اختبار واسع النطاق لفيروس SARS-CoV-2 أو تطوير خطط التأهب لتفشي الفيروس في المستقبل.

Abstract

يعد تحديد الأفراد المعديين وعزلهم إلى جانب الحجر الصحي للمخالطين عن كثب أمرا بالغ الأهمية لإبطاء انتشار COVID-19. يوفر الاختبار الواسع النطاق في قدرة الترصد أو الفحص للحاملين لكوفيد-19 الذين لا تظهر عليهم أعراض بيانات عن انتشار الفيروس وقدرة المتابعة على اختبار الأفراد بسرعة أثناء الفاشيات المشتبه فيها. يستخدم برنامج الكشف المبكر عن COVID-19 في جامعة ولاية ميشيغان اختبارات واسعة النطاق في قدرة المراقبة أو الفحص منذ خريف عام 2020. تستفيد الطرق التي تم تكييفها هنا من الموثوقية وحجم العينة الكبير وفوائد الجمع الذاتي للعاب ، مقترنة بمخطط تجميع ثنائي الأبعاد فعال من حيث التكلفة يحافظ على الكاشف. تم تصميم العملية لتكون قابلة للتكيف مع نقص الإمدادات ، مع استبدال العديد من مكونات المجموعات والفحص بسهولة. يمكن تكييف العمليات الموضحة لجمع عينات SARS-CoV-2 ومعالجتها لاختبار مسببات الأمراض الفيروسية المستقبلية التي يتم التعبير عنها بشكل موثوق في اللعاب. من خلال توفير هذا المخطط للجامعات أو المنظمات الأخرى ، يمكن وضع خطط التأهب لتفشي الفيروسات في المستقبل.

Introduction

تسبب جائحة COVID-19 ، الناجم عن فيروس SARS-CoV-2 ، في وفاة أكثر من 6.2 مليون شخص حتى الآن ، مع ارتفاع الأرقام كل يوم1. المعيار الذهبي لاختبار SARS-CoV-2 هو PCR الكمي في الوقت الفعلي (RT-q) ، مع بادئات مصممة لاستهداف الجينوم الفيروسي ، مثل جينات نيوكليوكابسيد ، والمغلف ، والارتفاع ، وجينات بوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمدةعلى الحمض النووي الريبي 2. في بداية الجائحة، كانت القدرة الكافية لاختبار SARS-CoV-2 تفتقر بشدة. نشأ من نقص المقايسات التي تم التحقق من صحتها ، ومكونات الاختبار ، والموظفين السريريين ، والبنية التحتية غير المستعدة للتوسع بسرعة لاستيعاب الاختبارات الجماعية على مستوى الوباء. بسبب النقص ، غالبا ما تطلب مراكز الاختبار إحالة الطبيب ليكون مؤهلا للاختبار. أدى هذا النقص إلى تأخير الموافقة على الاختبار ، وطوابير طويلة لجمع عينات البلعوم الأنفي غير المريحة ، وأوقات انتظار طويلة للحصول على النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، بسبب هذه القيود ، لم تستطع جهود الاختبار استيعاب الناقلات التي تظهر عليها أعراض أو خفيفة أو بدون أعراض تنشر SARS-CoV-2 عن غير علم. من المحتمل أن يكون الافتقار إلى الاختبارات التي يسهل الوصول إليها وواسع النطاق قد ساهم في انتشار COVID-19 بشكل غير منضبط.

يمكن إجراء اختبار فاصل واسع النطاق إما كمراقبة أو فحص. يمكن استخدام كلاهما لمراقبة معدلات الإيجابية المحلية في مناطق انتقال العدوى عالية الكثافة أو عالية الخطورة ويمكن استخدامها لاتخاذ قرارات الصحة العامة. يهدف اختبار الترصد إلى رصد وقوع المرض وانتشاره بين السكان ولا يستخدم للتشخيصالفردي 3. عادة ما يتم إلغاء تحديد نتائج الترصد ولا يتم إعادتها إلى المشاركين. لا يلزم أن تكون المختبرات التي تجري اختبارات المراقبة معتمدة سريريا ، ولا يطلب منها استخدام اختبار معتمد من إدارة الغذاء والدواء. يسمح الفحص بإعادة النتائج إلى المشاركين الفرديين ، ولكن يجب أن يكون لدى مختبرات الفحص في الولايات المتحدة شهادة تعديلات تحسين المختبرات السريرية (CLIA) وأن تفي بجميع متطلبات CLIA المعمول بها.

بدأ برنامج الكشف المبكر بجامعة ولاية ميشيغان (MSU) في سبتمبر 2020 وعالج أكثر من 350,000 عينة. نشأ البرنامج من جهود مجموعة بحثية لتصميم اختبار SARS-CoV-2 شديد الحساسية والذي لا يتطلب إمدادات اختبار عالية الطلب4،5،6،7،8. كانت الأهداف هي مساعدة المختبرات السريرية على زيادة السعة وتطوير عمليات مرنة لاستيعاب نقص الإمدادات مع تطوير استراتيجية فحص لوضع خطة العودة إلى العمل لكلية الطب البشري بجامعة ولاية ميشيغان. ركزت الجهود الأولية على طرق الجمع والاستخراج والقياس الكمي البديلة ل SARS-CoV-2. أدى ارتفاع الطلب والنقص اللاحق في مسحات البلعوم الأنفي إلى تقييم عينات الأنف الأمامية التي تم جمعها باستخدام مسحات الخد ، وأدى نقص الكاشف إلى تطوير طريقة استخراج عينات مقتبسة من التقارير المبكرة من ووهان ، الصين9. لزيادة الحساسية للكشف عن SARS-CoV-2 في عينات الأنف الأمامي ، تم استبدال تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بالقطرات ب RT-qPCR6،7. على الرغم من أن PCR الرقمي المتقطرات حساس للغاية ويمكن أن يوفر قيما مطلقة مع قراءة نقطة النهاية ، فقد تم تحديد أن استخدامه لم يكن ممكنا للاختبار على نطاق واسع بسبب عدم وجود أجهزة موثوقة عالية الإنتاجية للتكنولوجيا. بالإضافة إلى ذلك ، كان الجمع الذاتي لعينات الأنف الأمامية بناء على مستويات RNase P البشري متغيرا للغاية ، مما يشير إلى أنه لم يكن موثوقا به بما فيه الكفاية للاختبار الشامل.

بديل لمسحات البلعوم الأنفي والأمامي هو جمع اللعاب. تم اكتشاف فيروسات الجهاز التنفسي مثل SARS-CoV و H1N1 و MERS تاريخيا في اللعاب10،11،12،13. ثبت أن هذا صحيح لاحقا بالنسبة ل SARS-CoV-214،15،16،17. أظهرت المقارنة المباشرة بين عينات اللعاب والبلعوم الأنفي أن اللعاب ينتج عتيرا فيروسيا أعلى من مسحات البلعوم الأنفي في العينات المتطابقة ، وأن اللعاب أقل تنوعا مع جمع العينات المتكرر14. كما تم الإبلاغ عن أن اللعاب أكثر حساسية في بعض المتغيرات ، مثل Omicron ، مقارنة ب Delta16. ومن المزايا الإضافية لجمع اللعاب السهولة النسبية للجمع الذاتي خارج الموقع دون إمدادات عالية الطلب، والقدرة على إعادة اختبار العينة بشكل متكرر إذا لزم الأمر، وإلغاء متطلبات التوظيف في الموقع لجمع العينات، وتجنب قوائم انتظار المشاركين التي يمكن أن تزيد من احتمالية انتقال الفيروس. تم تطوير مجموعة اللعاب المجمعة في المختبر كتعاون بين مطوري فحوصات المختبر ، والخبراء في كلية التعبئة والتغليف ، وخبراء العلامات التجارية للجامعة ، ومسؤولي السلامة ، وشركاء التصنيع الخارجيين الذين أنتجوا الصندوق ونظام العلامات.

في حين أن عينات اللعاب توفر مادة أولية وراثية وافرة ويوفر RT-qPCR نتائج حساسة وموثوقة ، فإن تكلفة الكواشف (التمهيدي / المجسات والمزيج الرئيسي) جعلت الاختبار على نطاق واسع للعينات الفردية مسعى مكلفا على أساس فردي ، لكل عينة. نظرا لأن التمهيدي / المجسات والمزيج الرئيسي هما أغلى مكونات العملية ، كان الهدف هو البحث عن حلول من شأنها أن تمتد من استخدامها وبالتالي تقلل من تكلفة العينة. تم اقتراح تحسين حجم تجمع العينة بشكل منهجي بناء على الإصابة في المجتمع وحساسية الفحص لاختبار SARS-CoV-218. ومع ذلك ، عندما تشير المجمعات من أي حجم إلى وجود SARS-CoV-2 ، يجب إعادة اختبار جميع المشاركين في المجموعة ، مما يؤدي إلى ضياع الوقت وزيادة فرص الانتشار. لمعالجة هذه القيود ، تم استخدام طريقة تجميع ثنائية الأبعاد ، مثل العملية التي اقترحها Zilinskas وآخرون19 لإجراء التمرير الأول في ظل قيود اختبار المراقبة. في هذه العملية ، يتم وضع 96 عينة فردية في صفيحة مكونة من 96 بئرا تتكون من 12 عمودا وثمانية صفوف. يتم تضمين كل عينة في مجموعة من ثمانية ومجموعة من 12 على لوحين مختلفين للتفاعل. ينتج عن هذا تمثيل كل عينة بشكل فريد مع التجمعين. يحدد تفكيك التجمعات بناء على الإحداثيات العينات الإيجابية المحتملة. العينات في أحواض التجمعات التي لم يكتشف فيها SARS-CoV-2 ، لا تنتقل من اختبار الترصد إلى الفحص. وفي الوقت نفسه ، يتم إعادة استخراج عينات من الأفراد الذين ثبتت إصابتهم في عملية الترصد من خلال عملية فحص معتمدة من CLIA. إذا تأكدت النتيجة إيجابية ، يتم إعطاء الأفراد نتيجتهم ، وإحالتهم إلى مكتب الطبيب الجامعي ، والبدء في تتبع المخالطين ، ويتم إخطار إدارة الصحة. في المجموع ، يتم اختبار عينة الفرد في ثلاثة ردود فعل منفصلة قبل إعلان إصابتها ، مرتين في مجمعات المراقبة ومرة واحدة كشاشة تأكيدية واحدة ، مما يقلل من فرص الإيجابية الكاذبة. يستخدم تجميع العينات كواشف أقل ~ 80٪ من تشغيل العينات بشكل فردي ، مما يؤدي إلى تكلفة ~ 12 دولارا لكل عينة.

بالإضافة إلى مجموعة اللعاب واستراتيجية التجميع وعملية تطوير الفحص ، طور الفريق أيضا خطة لوجستية لتوزيع المجموعات وجمع العينات والإبلاغ عن النتائج. يلتقط المشاركون في البرنامج مجموعتهم ، ويسجلون الرمز الأبجدي الرقمي الفريد على أنبوبهم ، وينتجون عينتهم ويودعونها في أحد صناديق التسليم العديدة حيث يتم التقاطها يوميا ونقلها إلى المختبر. يقوم المختبر بمعالجة العينات ، ويقوم المشرف الفني بمراجعة النتائج وتحميلها ، ويتم إخطار المشاركين للتحقق من بوابة النتائج. هذه العملية لها وقت استجابة من 24 إلى 48 ساعة من وقت إيداع العينة. كان التعاون من جميع أجزاء المؤسسة مفتاحا لتنفيذ ناجح واسع النطاق لعملية الترصد والفحص الهجينة هذه. تهدف الإجراءات والأوصاف التالية لبرنامج الاختبار والبنية التحتية المطلوبة إلى أن تكون مخططات حول كيفية توسيع نطاق الاختبار لأغراض الترصد و / أو الفحص المستقبلية.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسات التي أجريت لتحسين طرق برنامج الكشف المبكر من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة ولاية ميشيغان. تم استنساخ جميع الأرقام بعينات مفتعلة وهي تمثل النتائج البشرية المرصودة. لا توجد بيانات أو معلومات أو نتائج معروضة في المخطوطة من أي مشارك في برنامج الكشف المبكر بجامعة ولاية ميشيغان.

1. إنتاج مجموعة

ملاحظة: أثناء تجميع المجموعة، ارتد الأقنعة والقفازات وواقي العين ومعاطف المختبر في جميع الأوقات لمنع تلوث مكونات المجموعة.

  1. تحضير مكونات المجموعة
    1. باستخدام علامة دائمة ، ارسم خطا يشير إلى 1 مل على الأنبوب المخروطي سعة 25 مل. باستخدام علامة دائمة ، ارسم خطا يشير إلى 1 مل على ماصة النقل.
    2. أضف أربعة حبات خزفية إلى أنبوب العينة سعة 5 مل. Pipet 1 مل من محلول تثبيت الحمض النووي الريبي في أنبوب العينة وأغلق الأنبوب. قم بإرفاق ملصق الحديد الذي يتكون من رمز تعريف فريد لعينة الأنبوب مع الرمز الشريطي لمصفوفة البيانات في الأعلى والمعرف المتكرر بالرمز الأبجدي الرقمي على الجانب.
      ملاحظة: الخرز الخزفي خال من RNase / DNase ولا يحتاج إلى مزيد من التعقيم.
  2. ضع أنبوبا مخروطيا سعة 25 مل ، وأنبوب عينة سعة 5 مل ، وماصة نقل ، وكيس صغير للمخاطر البيولوجية في صندوق المجموعة (الشكل التكميلي 1).
    ملاحظة: لا تحتاج الأنابيب المخروطية إلى أن تكون خالية من DNase / RNase. يتم الحفاظ على سلامة العينة بواسطة محلول تثبيت الحمض النووي الريبي.

2. استخدامات المجموعة لجمع العينات الذاتية

  1. وفقا لتعليمات المجموعة ، اطلب من المشاركين عدم تناول الطعام أو الشراب قبل 30 دقيقة من تقديم عينة. اطلب من المشاركين البصق في الأنبوب المخروطي سعة 25 مل حتى يتم جمع 1 مل من اللعاب (الخط المحدد).
  2. باستخدام الماصة ، انقل 1 مل من اللعاب (حتى الخط المحدد) إلى أنبوب عينة سعة 5 مل يحتوي على محلول تثبيت الحمض النووي الريبي وخرز السيراميك. أغلق أنبوب العينة ورجه لمدة 15 ثانية.
  3. اطلب من المشاركين تسجيل الرمز الأبجدي الرقمي المخصص للعينة على الموقع المخصص. بمجرد الانتهاء من ذلك ، اطلب منهم وضع أنبوب العينة في كيس صغير من المخاطر البيولوجية وإيداعه في صندوق التجميع.

3. أخذ العينة والتحضير لعزل الحمض النووي الريبي

ملاحظة: تتم جميع الخطوات في خزانة السلامة الحيوية أو دلو أجهزة الطرد المركزي بغطاء احتواء حيوي.

  1. تطهير العينات وفحصها بصريا لمراقبة الجودة أثناء وجودها في كيس الخطر البيولوجي.
  2. رفض العينة إذا كانت العينة (الشكل 1): ذات لون غير طبيعي (أي أخضر أو أزرق) أو تحتوي على جزيئات طعام أو دم. العينة تتسرب أو مفقودة الخرز. العينة لها حجم متوقع غير صحيح (<1.5 مل أو >3 مل) ؛ لا يحتوي العينة على رمز شريطي أو رمز أبجدي رقمي مرفق.
    1. إذا تم رفض العينة، فقم بمسح العينة ضوئيا وتسجيلها في ملف رفض مع ملاحظة حول سبب رفض العينة. إذا تم رفض العينة لأنه لا يحتوي على معرفات، فقم بتسجيل العينة على أنها لا يوجد رمز شريطي في ملف الرفض.
  3. إذا لم يتم رفض العينة ، فقم بقطع كيس الخطر البيولوجي بالمقص وإزالة أنبوب العينة. قم بدوامة الأنبوب لمدة 15 ثانية ثم ضع أنبوب العينة في محول أنبوب لجهاز طرد مركزي دلو متأرجح.
  4. بمجرد امتلاء محولات الأنبوب، قم بتأمين غطاء الاحتواء الحيوي فوق دلو جهاز الطرد المركزي ونقله إلى جهاز الطرد المركزي. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 4,100 × جم لمدة دقيقتين وإعادة العينات إلى خزانة السلامة الحيوية.
    ملاحظة: يستخدم الطرد المركزي لحبيبات الحطام وإجبار المزيد من المواد اللزجة في اللعاب إلى قاع الأنبوب. هذا يلغي الحاجة إلى بروتيناز K في هذه العملية. يتكون التشغيل الكامل من 768 عينة (ثماني ألواح 96 بئرا مليئة بالعينة بعد عزل الحمض النووي الريبي).
  5. دون إزعاج المواد المحببة ، قم بنقل أنابيب العينة إلى رف أنبوب مكون من 96 فتحة مسمى مسبقا بمعرف التشغيل الذي يتضمن رقم الحامل (1-8) والتاريخ والمجموعة المقابلة التي سيتم تجميع / تقييم العينات معها (معرف للإشارة إلى المجموعة ، أي المجموعة A هي التشغيل الأول في اليوم).
  6. عندما تكون رفوف الأنبوب ذات 96 فتحة ممتلئة أو لا توجد عينات متبقية ، باستخدام ماسح ضوئي للباركود محمول باليد ، قم بمسح الأنابيب في ملف خريطة لوحة (الملف التكميلي 1 لتجمعات السباحة الكاملة ؛ الملف التكميلي 2 لمسابح نصف الحجم). في حالة عدم عمل الرمز الشريطي ، استخدم الرمز الأبجدي الرقمي الموجود على الأنبوب لتسجيل العينة.
    ملاحظة: مطلوب قناع لمنع مسح الرموز الشريطية المجاورة. يمكن صنع القناع عن طريق قطع ثقب في ورق غير شفاف ، ثم تصفيحه. ستظهر الرموز الشريطية الممسوحة ضوئيا في ملف خريطة اللوحة في نفس الاتجاه كما هو الحال في الرف المكون من 96 فتحة.
  7. رش أنابيب العينة في الرف بنسبة 70٪ من الإيثانول وجففها بمنشفة ورقية.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي مسح الأنابيب بدلا من التربيت إلى إتلاف الرموز الشريطية.
  8. قم بتسمية صفيحة بئر بعمق 96 بسعة 2 مل بمعرف التشغيل. انقل 200 ميكرولتر من عينة اللعاب من كل أنبوب عينة إلى البئر المقابل للوحة البئر التي يبلغ عمقها 96 بئر. إذا كانت العينات لزجة جدا بحيث لا يمكن نقلها ، فقم بالدوامة والطرد المركزي مرة أخرى. رفض العينة إذا بقيت المشكلة.
    ملاحظة: يمكن أن تكون عينات اللعاب خيطية وتترك أثرا حلزونا عبر اللوحة أثناء النقل إذا لم يكن الفني حريصا. يمكن أن يؤدي ذلك إلى إيجابيات خاطئة أولية والمزيد من العينات التي ستحتاج في النهاية إلى إعادة تشغيلها في خطوة التأكيد (انظر القسم 6).
  9. عندما يتم نقل جميع العينات ، قم بتغطية اللوحة ذات البئر العميق 96 بساط سيليكون وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. احفظ الرفوف المكونة من 96 فتحة وخزنها مع العينات المتبقية لتأكيد العينات التي يحتمل أن تكون إيجابية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

4. عزل الحمض النووي الريبي

  1. قم بتسمية خرطوشة عزل الحمض النووي الريبي ذات 96 بئرا بمعرف التشغيل وضعها فوق لوحة تجميع فارغة.
    ملاحظة: يمكن إزالة اللوحات التي تحتوي على عينات من خزانة السلامة الحيوية في هذه المرحلة.
  2. قم بإزالة حصيرة السيليكون من اللوحة التي يبلغ طولها 96 بئر. انقل 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل الفيروسي إلى كل بئر من لوحة البئر العميقة 96.
  3. امزج كل عينة عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل مرتين إلى أربع مرات ونقل العينة بأكملها إلى العمود المقابل في خرطوشة عزل الحمض النووي الريبي ذات 96 بئرا.
    ملاحظة: سيؤدي خلط كميات كبيرة إلى تكوين فقاعات قد تؤدي إلى تلوث الآبار المجاورة إذا تم إجراؤها بشكل عشوائي. يمكن أن يؤدي الخلط بطريقة متعمدة إلى تقليل هذا الخطر وحماية سلامة المعالجة النهائية.
  4. جهاز الطرد المركزي خرطوشة عزل الحمض النووي الريبي أعلى لوحة التجميع عند 4,100 × جم لمدة 10 دقائق لتحميل العينات على الخرطوشة. انقل خرطوشة عزل الحمض النووي الريبي إلى لوحة تجميع نظيفة.
  5. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى كل بئر من خرطوشة عزل الحمض النووي الريبي وجهاز الطرد المركزي عند 4,100 × جم لمدة 5 دقائق. انقل خرطوشة عزل الحمض النووي الريبي إلى لوحة تجميع نظيفة.
  6. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى كل بئر من خرطوشة عزل الحمض النووي الريبي وجهاز الطرد المركزي عند 4,100 × جم لمدة 5 دقائق. انقل خرطوشة عزل الحمض النووي الريبي إلى لوحة تجميع نظيفة.
  7. أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى كل بئر من خرطوشة عزل الحمض النووي الريبي وجهاز الطرد المركزي عند 4,100 × جم لمدة 5 دقائق. انقل خرطوشة عزل الحمض النووي الريبي إلى لوحة تجميع نظيفة.
    ملاحظة: إذا لم تمر العينة بالكامل عبر العمود في هذه المرحلة ، فإن العينة لزجة جدا أو أن قطع صغيرة من الحطام في العينة تسد العمود. يجب إزالة العينة بالكامل من الخرطوشة حتى لا تلوث عملية التجميع النهائي ، وإضافة رقم العينة إلى ملف الرفض.
  8. قم بالطرد المركزي لخرطوشة عزل الحمض النووي الريبي أعلى لوحة التجميع عند 4,100 × جم لمدة 5 دقائق لتجفيف الأعمدة. انقل خرطوشة عزل الحمض النووي الريبي إلى لوحة شطف نظيفة تحمل علامة "تشغيل الهوية" وصف الكلمات، ثم ضعها فوق لوحة تجميع نظيفة.
  9. أضف 25 ميكرولتر من الماء الجزيئي الخالي من DNase / RNase إلى كل بئر من خرطوشة عزل الحمض النووي الريبي. جهاز طرد مركزي عند 4,100 × جم لمدة 10 دقائق لتصفية الحمض النووي الريبي. إذا لم تتآكل العينة تماما ، فأعد الطرد المركزي للعينة لمدة 5 دقائق.
  10. انقل ألواح الشطف إلى ألواح باردة مبردة مسبقا وقم بتغطيتها. انتقل على الفور إلى تجميع العينات و RT-qPCR.

5. تجميع العينة و RT-qPCR

ملاحظة: يتم إعداد العملية في نظام من لوحين (كما هو موضح في الشكل 2). يتوافق رقم لوحة الحمض النووي الريبي للشطف مع رقم لوحة العمود المنتج وحرف لوحة الصف (A = 1 ، B = 2 ، C = 3 ، إلخ). لأغراض إزالة الالتواء ، سيتوافق حرف صف لوحة العمود مع حرف الصف من لوحة شطف الحمض النووي الريبي ، وسيتوافق رقم عمود لوحة الصف مع رقم عمود لوحة شطف الحمض النووي الريبي. على سبيل المثال ، سيتم العثور على عينة في لوحة الحمض النووي الريبي # 6 في الموضع C4 في موضع لوحة تفاعل الصف F4 ، وفي موضع لوحة تفاعل العمود C6.

  1. قم بتسمية لوحة شطف جديدة بمعرف التشغيل وصفا ، وضعها على طبق بارد مبرد مسبقا. انقل 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي من كل بئر على لوحة شطف الصف إلى الصف المقابل على لوحة شطف العمود ، وبالتالي عمل نسخة من لوحة الشطف الأصلية (الشكل 2).
    ملاحظة: سيتم تجميع لوحات الشطف التي تحمل علامة العمود في اتجاه العمود وسيتم تجميع لوحات الشطف التي تحمل علامة الصف في اتجاه الصف.
  2. بالنسبة للوحة العمود المجمعة، قم بنقل وحدة التخزين بأكملها من كل بئر عبر اللوحة إلى رقم العمود الذي يتوافق مع رقم لوحة معرف التشغيل. بالنسبة للوحة التجميع في الصف ، انقل الحجم بالكامل من كل بئر لأعلى أو لأسفل اللوحة إلى رقم الصف الذي يتوافق مع رقم لوحة معرف التشغيل (1 = A ، 2 = B ، إلخ ؛ الشكل 2).
  3. انقل 13 ميكرولتر من كل عينة مجمعة إلى العمود أو الصف المقابل للوحة تفاعل 96 بئرا (الشكل 2).
  4. بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم ثلاثة مجسات ضد جينات nucleocapsid (N) و ORF1ab و spike (S) للكشف عن SARS-CoV-2 ، ومسبار أولي رابع يستهدف عاثية MS2 كعنصر تحكم داخلي. في العينات المجمعة ، قم بتثبيت عنصر تحكم إيجابي في العاثية MS2 في المزيج الرئيسي. في العينات التي يتم تشغيلها بشكل فردي ، قم بتثبيت عاثية MS2 في العينة على خرطوشة عزل الحمض النووي الريبي واستخدامها كعنصر تحكم في الاستخراج.
    ملاحظة: سيختلف المزيج الرئيسي ، والمجسات التمهيدية ، والأصباغ الفلورية ، وأجهزة التبريد بناء على الفحص. يجب تحديد النسب المناسبة وقنوات الفلورسنت من قبل كل مختبر.
  5. قم بإعداد التحكم الإيجابي عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من محلول التحكم الإيجابي و 11 ميكرولتر من الماء الجزيئي الخالي من DNase / RNase إلى بئر التحكم الإيجابي على لوحة التفاعل (الشكل 2).
  6. قم بإعداد عنصر التحكم بدون قالب عن طريق إضافة 13 ميكرولتر من الماء الجزيئي الخالي من DNase / RNase إلى بئر التحكم السلبي على لوحة التفاعل.
  7. اصنع مزيجا رئيسيا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بزيادة التحكم الإيجابي في العاثية MS2. قم بتوزيع 7 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في كل بئر من ألواح التفاعل المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على عينات أو أدوات تحكم. قلل من التعرض لضوء الفلورسنت.
  8. قم بتغطية لوحات التفاعل بغشاء بصري ودوامة لمدة دقيقتين لخلط العينات جيدا. ألواح تفاعل أجهزة الطرد المركزي عند 650 × جم لمدة 5 دقائق.
  9. انقل الألواح إلى نظام RT-PCR وتعمل بمعلمات ركوب الدراجات المناسبة للمزيج الرئيسي. بالنسبة للمزيج الرئيسي المستخدم هنا ، تم تشغيل الدورات التالية: 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، و 53 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، و 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، و 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 3 ثوان ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
  10. بمجرد تشغيل العينات ، قم بإجراء فك التجميعات لتحديد العينات الإيجابية المحتملة يدويا (الشكل 3) وعبر تطبيق R Script Shiny.
    1. تصدير النتائج من لوحات تفاعل الأعمدة والصفوف كملفات جداول بيانات. افتح تطبيق البرنامج النصي R اللامع لفك الالتفاف للتجمع (الكود المصدري متاح على: https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP).
    2. قم بسحب وإسقاط خريطة اللوحة والأعمدة وملفات الصفوف في التطبيق وتشغيل التطبيق. احفظ القائمة التي تم إنتاجها من التطبيق.
      ملاحظة: تحتوي القائمة التي تم إنتاجها من التطبيق على جميع الرموز الشريطية التي تم إدخالها في خريطة اللوحة وما إذا كانت إيجابية أو سلبية على الأرجح بناء على البرنامج النصي لفك الالتفاف في المسبح. تتم إعادة معالجة هذه العينات التي تم وضع علامة عليها على أنها إيجابيات محتملة بشكل فردي.

6. التحقق من صحة العينات الإيجابية

  1. قم بتسمية أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل وعمود استخراج الحمض النووي الريبي لكل عينة تحتاج إلى اختبار. استخدم أنبوب طرد مركزي دقيق واحد لخلط العينة ، وعاثية MS2 ، ومخزن تحميل فيروسي ، وأنبوب الطرد المركزي الدقيق الثاني لخطوة شطف الحمض النووي الريبي.
  2. أضف 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي MS2 Phage إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل. انقل 200 ميكرولتر من العينة التي يحتمل أن تكون موجبة إلى الأنبوب وأضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل الفيروسي إلى الأنبوب، واخلطه عن طريق سحب العينات.
  3. انقل المحتويات بالكامل إلى عمود استخراج الحمض النووي الريبي المسمى مسبقا في أنبوب تجميع نظيف. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة دقيقتين. تدفق الشفط من أنبوب التجميع.
  4. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى عمود استخراج الحمض النووي الريبي وجهاز الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة دقيقتين. تدفق الشفط من أنبوب التجميع.
  5. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى عمود استخراج الحمض النووي الريبي وجهاز الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة دقيقتين. تدفق الشفط من أنبوب التجميع.
  6. أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى عمود استخراج الحمض النووي الريبي وجهاز الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة دقيقة واحدة. انقل عمود استخراج الحمض النووي الريبي إلى أنبوب تجميع نظيف وجهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 1 دقيقة لتجفيف العمود.
  7. انقل عمود استخراج الحمض النووي الريبي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مسمى مسبقا للشطف. أضف 25 ميكرولتر من الماء الجزيئي الخالي من DNase / RNase إلى عمود استخراج الحمض النووي الريبي. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة دقيقتين لجمع الحمض النووي الريبي ونقل الأنبوب إلى الجليد الرطب.
  8. اصنع مزيجا رئيسيا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتوزيع 7 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة تفاعل 96 بئرا تحتوي على العينة. نقل 13 ميكرولتر من كل RNA معزول إلى لوحة التفاعل.
    ملاحظة: المزيج الرئيسي هو نفسه المستخدم في بروتوكول العينة المجمعة ولكنه لا يتضمن مسمار الحمض النووي الريبي للعاثية MS2.
  9. قم بإعداد التحكم الإيجابي عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من محلول التحكم الإيجابي و 11 ميكرولتر من الماء الجزيئي الخالي من DNase / RNase إلى بئر التحكم الإيجابي على لوحة التفاعل. قم بإعداد عنصر التحكم بدون قالب عن طريق إضافة 13 ميكرولتر من الماء الجزيئي الخالي من DNase / RNase إلى بئر التحكم السلبي على لوحة التفاعل.
  10. قم بتغطية ألواح التفاعل بغشاء بصري ودوامة لمدة دقيقتين لخلط العينات جيدا. ألواح تفاعل أجهزة الطرد المركزي عند 650 × جم لمدة 5 دقائق. انقل الألواح إلى نظام RT-PCR وتعمل بمعلمات ركوب الدراجات المناسبة للمزيج الرئيسي.
    1. بالنسبة للمزيج الرئيسي المذكور هنا ، استخدم 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، و 53 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، و 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، و 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 3 ثوان ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.

النتائج

تم قبول الغالبية العظمى من العينات التي تلقاها المختبر حتى الآن واجتياز خطوة مراقبة الجودة البصرية الأولية. تقتصر الحاجة إلى رفض العينة على الأسباب التي يمكن أن تؤثر سلبا على معالجة العينة و / أو النتائج الإجمالية للعينة. على وجه التحديد ، الحجم غير الصحيح في الأنبوب ، أ?...

Discussion

أثناء معالجة العينة ، هناك خطوات تتطلب عناية فائقة. تعد خطوة مراقبة الجودة الأولية التي تبحث في حجم العينة واتساقها ولونها ووجودها أمرا بالغ الأهمية للنجاح العام للعملية. يمكن أن تنتج الأنابيب التي تحتوي على عينات لا تحتوي على الكمية الصحيحة من اللعاب سلبية كاذبة ، لأن ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات مالية فيما يتعلق بالأساليب أو الإمدادات أو المعدات أو الكواشف.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم للمشاركين في الدراسات المعتمدة لمجلس المراجعة المؤسسية بجامعة ولاية ميشيغان المستخدمة لتحسين الأساليب (STUDY00004265 ، STUDY00004383 ، STUDY00005109) ، بالإضافة إلى تلك التي خرجت لجمع العينات المستخدمة لاختبار الأساليب (الدكتورة كاتي ميلر ، آنا ستول ، بريان دالي ، الدكتورة كلوديا فينكلشتاين). تم دعم هذا المسعى من قبل جامعة ولاية ميشيغان.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 Step MM, no ROXThermo FisherA28523
1.2 mlDeep well PlatesFisherAB0564
100 mL reagent reservoirsCorning4872
2.8 mm Ceramic BeadsOMNI19-646
25 ml conical w/screw capVWR76338-496
50mL V bottom reservoirsCostar4870
5430-High-Speed CentrifugeEppendorf22620601
5ml Eppendorf TubeFisher14282300
8 strip tubes for QuantStudiolife technologies4316567
Beta MercaptoethanolFisherAC125472500
Ethanol 200 Proof, Molecular Biology GradeFisherBP28184
Microamp Endura Optical 96-well fast clear reaction plate with barcodelife technologies4483485
Microamp Fast Optical 96 well plateFisher4346906
Mini MicrocentrifugeCorning Medical6770
optical caps for strip tubeslife technologiesAB-1820
Optical FilmThermo Fisher4311971
PCR plate sealing film Non-opticalFisherAB-0558
PCR Plate semi-skirtedFisher14230244
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.1 mLThermo FisherA28136
Quick RNA Viral Kit confirmationZymoR1035
Reagent Reservoir, 100mlDOT229298
RNA ShieldZymoR1200-1L
Small Biohazard BagsFisher180000
Taqpath RTPCR COVID19 kitThermo FisherA47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus CentrifugeThermo Fisher75009525
Transfer PipetFisher22170404
Viral 96 KitZymoR1041
Vortex MixerFisher2215414

References

  1. . WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard Available from: https://covid19.who.int/ (2022)
  2. John Hopkins Center for Health Security. Center for Health Security. Comparison of National RT-PCR primers, probes, and protocols for SARS-CoV-2 diagnostics. John Hopkins Center for Health Security. , 5 (2020).
  3. Oleske, D. M. Screening and surveillance for promoting population health. Epidemiology and the Delivery of Health Care Services. , 131-150 (2009).
  4. Patterson, J. R., Cole-Strauss, A., Beck, J. S., Sortwell, C. E., Lipton, J. W. Isolation of SARS-Cov2 RNA from humans without high demand reagents. protocols.io. , (2020).
  5. Patterson, J. R., Cole-Strauss, A., Beck, J. S., Sortwell, C. E., Lipton, J. W. Modified nasal swab for detection of Sars-Cov2. protocols.io. , (2020).
  6. Patterson, J. R., Cole-Strauss, A., Beck, J. S., Sortwell, C. E., Lipton, J. W. Detection of Sars-Cov2 using droplet digital PCR. protocols.io. , (2020).
  7. Patterson, J. R., Cole-Strauss, A., Beck, J. S., Sortwell, C. E., Lipton, J. W. Detection of Sars-Cov2 using qPCR. protocols.io. , (2020).
  8. Patterson, J. R., Cole-Strauss, A., Beck, J. S., Sortwell, C. E., Lipton, J. W. Detection of SARS-Cov2 without high demand reagents (singleplex assays). protocols.io. , (2020).
  9. Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
  10. Wang, W. K., et al. Detection of SARS-associated coronavirus in throat wash and saliva in early diagnosis. Emerging Infectious. Diseases. 10 (7), 1213-1219 (2004).
  11. Niedrig, M., Patel, P., El Wahed, A. A., Schädler, R., Yactayo, S. Find the right sample: A study on the versatility of saliva and urine samples for the diagnosis of emerging viruses. BMC Infectious. Disease. 18 (1), 707 (2018).
  12. Bilder, L., MacHtei, E. E., Shenhar, Y., Kra-Oz, Z., Basis, F. Salivary detection of H1N1 virus: A clinical feasibility investigation. Journal of Dental Research. 90 (9), 1136-1139 (2011).
  13. To, K. K. W., et al. Saliva as a diagnostic specimen for testing respiratory virus by a point-of-care molecular assay: a diagnostic validity study. Clinical Microbiology and Infection. 25 (3), 372-378 (2019).
  14. Wyllie, A. L., et al. Saliva or nasopharyngeal swab specimens for detection of SARS-CoV-2. New England Journal of Medicine. 383 (13), 1283-1286 (2020).
  15. . Novel Coronavirus Information Center Available from: https://www.elsevier.com/connect/coronavirus-information-center (2021)
  16. Marais, G., Hsiao, N., Iranzadeh, A., Doolabh, D., Enoch, A. Saliva swabs are the preferred sample for Omicron detection. medrvix. , (2021).
  17. Chu, C. Y., et al. Performance of saliva and mid-turbinate swabs for detection of the beta variant in South Africa. The Lancet. Infectious Diseases. 21 (10), 1354 (2021).
  18. Mentus, C., Romeo, M., DiPaola, C. Analysis and applications of adaptive group testing methods for COVID-19. medRxiv. , (2020).
  19. Žilinskas, J., Lančinskas, A., Guarracino, M. R. Pooled testing with replication as a mass testing strategy for the COVID-19 pandemics. Scientific Reports. 11 (1), 3459 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

SARS CoV 2 COVID 19

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved