Großflächige SARS-CoV-2-Tests mit Speichel und Transpositionsproben-Pooling

Zusammenfassung

Das Protokoll soll als Blaupause für Universitäten und andere Organisationen dienen, die groß angelegte Tests auf SARS-CoV-2 in Betracht ziehen oder Bereitschaftspläne für zukünftige Virusausbrüche entwickeln.

Zusammenfassung

Die Identifizierung und Isolierung ansteckender Personen sowie die Quarantäne enger Kontakte sind entscheidend, um die Ausbreitung von COVID-19 zu verlangsamen. Groß angelegte Tests zur Überwachung oder zum Screening von asymptomatischen Trägern von COVID-19 liefern sowohl Daten zur Virusausbreitung als auch die Nachverfolgungsfähigkeit, um Personen bei Verdacht auf Ausbrüche schnell zu testen. Das COVID-19-Früherkennungsprogramm an der Michigan State University nutzt seit Herbst 2020 groß angelegte Tests zur Überwachung oder zum Screening. Die hier angepassten Methoden nutzen die Zuverlässigkeit, das große Probenvolumen und die Vorteile der Selbstentnahme von Speichel, gepaart mit einem kostengünstigen, reagenzienschonenden zweidimensionalen Pooling-Schema. Der Prozess wurde so konzipiert, dass er an Versorgungsengpässe angepasst werden kann, wobei viele Komponenten der Kits und des Assays leicht ersetzt werden können. Die beschriebenen Verfahren zur Entnahme und Aufbereitung von SARS-CoV-2-Proben können angepasst werden, um auf zukünftige virale Erreger zu testen, die zuverlässig im Speichel exprimiert werden. Durch die Bereitstellung dieser Blaupause für Universitäten oder andere Organisationen können Bereitschaftspläne für zukünftige Virusausbrüche entwickelt werden.

Einleitung

Die COVID-19-Pandemie, die durch das SARS-CoV-2-Virus verursacht wurde, hat bisher den Tod von über 6,2 Millionen Menschen verursacht, Tendenz täglich steigend¹. Der Goldstandard für Tests auf SARS-CoV-2 ist die quantitative Echtzeit-PCR (RT-q) mit Primern, die auf das virale Genom abzielen, wie z. B. Nukleokapsid-, Hüll-, Spike- und RNA-abhängige RNA-Polymerase-Gene². Zu Beginn der Pandemie fehlten es stark an ausreichenden Kapazitäten für SARS-CoV-2-Tests. Es entstand aus einem Mangel an validierten Assays, Testkomponenten, klinischem Personal und einer Infrastruktur, die nicht darauf vorbereitet war, schnell zu expandieren, um Massentests auf Pandemieniveau zu ermöglichen. Aufgrund von Engpässen verlangten die Testzentren oft die Überweisung eines Arztes, um für den Test in Frage zu kommen. Diese Engpässe führten zu Verzögerungen bei der Zulassung von Tests, langen Schlangen für die unangenehme Entnahme von Nasen-Rachen-Proben und langen Wartezeiten auf die Ergebnisse. Darüber hinaus konnten die Testbemühungen aufgrund dieser Einschränkungen präsymptomatische, milde oder asymptomatische Träger, die das SARS-CoV-2 unwissentlich verbreiten, nicht berücksichtigen. Der Mangel an leicht zugänglichen, weit verbreiteten Tests hat wahrscheinlich zur unkontrollierten Ausbreitung von COVID-19 beigetragen.

Großflächige Intervalltests können entweder als Überwachung oder als Screening durchgeführt werden. Beide können zur Überwachung der lokalen Positivitätsraten in Gebieten mit hoher Dichte oder hohem Übertragungsrisiko verwendet werden und können verwendet werden, um Entscheidungen im Bereich der öffentlichen Gesundheit zu treffen. Überwachungstests dienen der Überwachung der Inzidenz und Prävalenz von Krankheiten in einer Population und werden nicht für die individuelle Diagnostik verwendet³. Die Überwachungsergebnisse werden in der Regel anonymisiert und nicht an die Teilnehmer zurückgegeben. Laboratorien, die Überwachungstests durchführen, müssen weder klinisch zertifiziert sein, noch sind sie verpflichtet, einen von der FDA zugelassenen Assay zu verwenden. Das Screening ermöglicht es, die Ergebnisse an einzelne Teilnehmer zurückzugeben, aber Screening-Laboratorien in den Vereinigten Staaten müssen über ein CLIA-Zertifikat (Clinical Laboratory Improvement Amendments) verfügen und alle geltenden CLIA-Anforderungen erfüllen.

Das Früherkennungsprogramm der Michigan State University (MSU) begann im September 2020 und hat über 350.000 Proben verarbeitet. Das Programm entstand aus den Bemühungen einer Forschungsgruppe, einen hochempfindlichen SARS-CoV-2-Assay zu entwickeln, der keine stark nachgefragten Testmaterialien erforderte 4,5,6,7,8. Ziel war es, klinische Labore dabei zu unterstützen, die Kapazitäten zu erhöhen und flexible Prozesse zu entwickeln, um Lieferengpässen zu begegnen, sowie eine Screening-Strategie zu entwickeln, um einen Plan für die Rückkehr an den Arbeitsplatz für das MSU College of Human Medicine zu erstellen. Die ersten Bemühungen konzentrierten sich auf alternative Methoden zur Gewinnung, Extraktion und Quantifizierung von SARS-CoV-2. Die hohe Nachfrage und der daraus resultierende Mangel an Nasopharynxabstrichen führten zur Auswertung von Proben der vorderen Nasenlöcher, die mit Wangenabstrichen entnommen wurden, und der Mangel an Reagenzien führte zur Entwicklung einer Probenextraktionsmethode, die aus frühen Berichten aus Wuhan, China, angepasst wurde⁹. Um die Sensitivität für den Nachweis von SARS-CoV-2 in Proben der vorderen Nasenlöcher zu erhöhen, wurde die RT-qPCR ^6,7 durch die digitale Tröpfchen-PCR ersetzt. Obwohl die digitale Tröpfchen-PCR hochempfindlich ist und absolute Werte mit einer Endpunktauslesung liefern kann, wurde festgestellt, dass ihre Verwendung für groß angelegte Tests aufgrund des Mangels an zuverlässigen Hochdurchsatzinstrumenten für die Technologie nicht machbar ist. Darüber hinaus war die Selbstentnahme von Proben der vorderen Nasenlöcher auf der Grundlage von humanen RNase P-Gehalten extrem unterschiedlich, was darauf hindeutet, dass sie für Massentests nicht zuverlässig genug war.

Eine Alternative zu Nasen-Rachen-Abstrichen und Abstrichen der vorderen Nasenlöcher ist die Entnahme von Speichel. Atemwegsviren wie SARS-CoV, H1N1 und MERS wurden in der Vergangenheit alle im Speichel nachgewiesen 10,11,12,13. Dies wurde in der Folge für SARS-CoV-2 14,15,16,17 bestätigt. Der direkte Vergleich zwischen Speichel- und Nasopharynxproben zeigte, dass Speichel in übereinstimmenden Proben höhere Virustiter ergab als Nasopharynxabstriche und dass der Speichel bei wiederholter Probenentnahme weniger variabel ist¹⁴. Es wurde auch berichtet, dass Speichel bei bestimmten Varianten wie Omikron im Vergleich zu Delta¹⁶ empfindlicher ist. Zu den zusätzlichen Vorteilen der Speichelentnahme gehören die relativ einfache Selbstentnahme außerhalb des Standorts ohne hohe Nachfrage, die Möglichkeit, die Probe bei Bedarf wiederholt zu testen, der Wegfall des Personalbedarfs vor Ort für die Probenentnahme und die Vermeidung von Warteschlangen der Teilnehmer, die das Potenzial für eine Virusübertragung erhöhen könnten. Das im Labor zusammengestellte Speichelkit wurde in Zusammenarbeit zwischen Laborassay-Entwicklern, Experten der Verpackungsschule, Branding-Experten der Universität, Sicherheitsbeauftragten und externen Produktionspartnern entwickelt, die die Schachtel und das Etikettiersystem hergestellt haben.

Während Speichelproben reichlich genetisches Ausgangsmaterial liefern und die RT-qPCR empfindliche, zuverlässige Ergebnisse liefert, machten die Kosten für Reagenzien (Primer/Sonden und Mastermix) die groß angelegte Untersuchung einzelner Proben zu einem kostspieligen Unterfangen auf individueller Basis pro Probe. Da der Primer/die Sonden und der Mastermix die teuersten Komponenten des Prozesses sind, bestand das Ziel darin, Lösungen zu finden, die ihren Einsatz ausdehnen und somit die Kosten pro Probe senken würden. Für SARS-CoV-2-Tests wurde eine systemische Optimierung der Größe des Probenpools auf der Grundlage der Inzidenz in der Gemeinschaft und der Sensitivität des Assays vorgeschlagen¹⁸. Wenn jedoch Pools beliebiger Größe auf das Vorhandensein von SARS-CoV-2 hinweisen, müssen alle Teilnehmer des Pools erneut getestet werden, was zu Zeitverlust und erhöhten Ausbreitungsmöglichkeiten führt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde eine zweidimensionale Pooling-Methode eingesetzt, wie sie von Zilinskas und anderen¹⁹ vorgeschlagen wurde, um einen ersten Durchgang unter den Auflagen von Überwachungstests durchzuführen. Dabei werden 96 Einzelproben in eine 96-Well-Platte gelegt, die aus 12 Säulen und acht Reihen besteht. Jede Probe ist in einem Pool von acht und einem Pool von 12 auf zwei verschiedenen Reaktionsplatten enthalten. Dies führt dazu, dass jede Stichprobe eindeutig mit den beiden Pools repräsentiert wird. Die Entfaltung der Pools anhand der Koordinaten identifiziert potenziell positive Proben. Proben in Pools, in denen SARS-CoV-2 nicht nachgewiesen wurde, werden nicht von Überwachungstests zu Screenings überführt. In der Zwischenzeit werden Proben von Personen, die im Rahmen des Überwachungsprozesses positiv getestet wurden, durch ein CLIA-zugelassenes Screening-Verfahren wieder entnommen. Bei positiver Positivität erhalten die Betroffenen ihr Ergebnis, werden an die Universitätsarztpraxis überwiesen, die Kontaktnachverfolgung eingeleitet und das Gesundheitsamt benachrichtigt. Insgesamt wird die Probe einer Person in drei separaten Reaktionen getestet, bevor sie für positiv erklärt wird, zweimal in Überwachungspools und einmal als einzelnes Bestätigungsscreening, wodurch die Wahrscheinlichkeit eines falsch positiven Ergebnisses verringert wird. Beim Probenpooling werden ~80 % weniger Reagenzien verbraucht als bei der Einzelprobenverarbeitung, was zu Kosten von ~12 US-Dollar pro Probe führt.

Neben dem Speichelkit, der Pooling-Strategie und dem Assay-Entwicklungsprozess entwickelte das Team auch einen Logistikplan für die Verteilung der Kits, die Entnahme von Proben und die Berichterstattung über die Ergebnisse. Die Teilnehmer des Programms nehmen ihr Kit in die Hand, registrieren den eindeutigen alphanumerischen Code auf ihrem Röhrchen, stellen ihre Probe her und werfen sie in einen der vielen Abgabebehälter, wo sie täglich abgeholt und zum Labor transportiert werden. Das Labor verarbeitet die Proben, der technische Supervisor überprüft und lädt die Ergebnisse hoch, und die Teilnehmer werden benachrichtigt, um das Ergebnisportal zu überprüfen. Dieser Prozess hat eine Durchlaufzeit von 24-48 h ab dem Zeitpunkt, an dem eine Probe abgelegt wird. Die Zusammenarbeit aus allen Teilen der Institution war der Schlüssel für eine erfolgreiche großflächige Implementierung dieses hybriden Überwachungs- und Screening-Prozesses. Die folgenden Verfahren und Beschreibungen des erforderlichen Testprogramms und der erforderlichen Infrastruktur dienen als Blaupausen für die Ausweitung von Tests für zukünftige Überwachungs- und/oder Screening-Zwecke.

Protokoll

Studien, die zur Optimierung der Methoden für das Früherkennungsprogramm durchgeführt wurden, wurden vom Institutional Review Board der Michigan State University genehmigt. Alle Zahlen wurden mit erfundenen Proben reproduziert und sind repräsentativ für die beobachteten menschlichen Ergebnisse. Keine Daten, Informationen oder Ergebnisse, die in dem Manuskript gezeigt werden, stammen von Teilnehmern des Früherkennungsprogramms der Michigan State University.

1. Herstellung des Bausatzes

HINWEIS: Tragen Sie während der Montage des Kits stets Masken, Handschuhe, Augenschutz und Laborkittel, um eine Kontamination der Kit-Komponenten zu vermeiden.

1. Vorbereitung der Kit-Komponenten
   1. Zeichnen Sie mit einem Permanentmarker eine Linie mit der Angabe 1 ml auf das konische 25-ml-Röhrchen. Zeichnen Sie mit einem Permanentmarker eine Linie mit der Angabe 1 ml auf die Transferpipette.
   2. Geben Sie vier Keramikkügelchen in das 5-ml-Probenröhrchen. Pipettieren Sie 1 ml RNA-Stabilisierungslösung in das Probenröhrchen und verschließen Sie das Röhrchen. Bringen Sie einen Langhantelaufkleber an, der aus einem eindeutigen Identifikationscode besteht, mit dem Datamatrix-Barcode auf der Oberseite und der Kennung in alphanumerischem Code an der Seite.
      HINWEIS: Die Keramikkügelchen sind RNase/DNase-frei und müssen nicht weiter sterilisiert werden.
2. Legen Sie ein konisches 25-ml-Röhrchen, ein 5-ml-Probenröhrchen, eine Transferpipette und einen kleinen Biohazard-Beutel in die Kit-Box (Ergänzende Abbildung 1).
   HINWEIS: Konische Rohre müssen nicht DNase/RNase-frei sein. Die Integrität der Probe wird durch die RNA-Stabilisierungslösung gewahrt.

2. Verwendung des Kits für die Entnahme von Selbstproben

1. Bitten Sie die Teilnehmer gemäß den Anweisungen des Kits, 30 Minuten vor der Abgabe einer Probe nicht zu essen oder zu trinken. Bitten Sie die Teilnehmer, in das konische 25-ml-Röhrchen zu spucken, bis 1 mL Speichel gesammelt ist (markierte Linie).
2. Übertragen Sie mit der Pipette 1 ml Speichel (bis zur markierten Linie) in das 5-ml-Probenröhrchen, das die RNA-Stabilisierungslösung und die Keramikkügelchen enthält. Verschließen Sie das Probenröhrchen und schütteln Sie es 15 s lang.
3. Bitten Sie die Teilnehmer, den alphanumerischen Code, der der Probe zugewiesen ist, auf der dafür vorgesehenen Website zu registrieren. Wenn dies erledigt ist, bitten Sie sie, das Probenröhrchen in einen kleinen Beutel für biologische Gefahrstoffe zu legen und in einen Auffangbehälter zu werfen.

3. Probenentnahme und Vorbereitung für die RNA-Isolierung

HINWEIS: Alle Schritte finden in einer Biosicherheitswerkbank oder einem Zentrifugeneimer mit Bioabdichtungsdeckel statt.

1. Desinfizieren und inspizieren Sie Proben zur Qualitätskontrolle, während Sie sich noch im Biohazard-Beutel befinden.
2. Lehnen Sie die Probe ab, wenn (Abbildung 1): die Probe eine nicht natürliche Farbe hat (d. h. grün, blau) oder Speisereste oder Blut enthält; Die Probe ist undicht oder es fehlen Kügelchen; Die Probe hat ein falsches erwartetes Volumen (<1,5 ml oder >3 ml); Probe ist kein Barcode oder alphanumerischer Code beigefügt.
   1. Wenn die Probe abgelehnt wird, scannen Sie die Probe und notieren Sie sie in einer Ablehnungsdatei mit einem Hinweis, warum die Probe abgelehnt wurde. Wenn die Probe abgelehnt wird, weil sie keine Identifikatoren hat, protokollieren Sie die Probe als Kein Barcode in der Ablehnungsdatei.
3. Wenn die Probe nicht zurückgewiesen wird, schneiden Sie den Biohazard-Beutel mit einer Schere auf und entfernen Sie das Probenröhrchen. Wirbeln Sie das Röhrchen 15 s lang vor und setzen Sie dann das Probenröhrchen in einen Röhrchenadapter für eine Schwenkbecherzentrifuge ein.
4. Sobald die Röhrchenadapter voll sind, befestigen Sie den Bioabdichtungsdeckel über dem Zentrifugeneimer und geben Sie ihn in die Zentrifuge. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.100 x g für 2 min und geben Sie die Proben an die Biosicherheitswerkbank zurück.
   HINWEIS: Die Zentrifugation wird verwendet, um Schmutz zu pelletieren und viskoseres Material im Speichel auf den Boden des Röhrchens zu drücken. Dadurch entfällt der Einsatz von Proteinase K. Ein vollständiger Lauf besteht aus 768 Proben (acht 96-Well-Platten mit Proben nach der RNA-Isolierung).
5. Ohne das pelletierte Material zu stören, übertragen Sie die Probenröhrchen in ein Röhrchengestell mit 96 Schlitzen, das mit der Lauf-ID vorbeschriftet ist, die die Racknummer (1-8), das Datum und die entsprechende Gruppe enthält, in der die Proben gepoolt/bewertet werden (eine Kennung zur Bezeichnung der Gruppe, d. h. Gruppe A ist der erste Lauf des Tages).
6. Wenn die Röhrchenracks mit 96 Schlitzen voll sind oder keine Proben mehr übrig sind, scannen Sie die Röhrchen mit einem tragbaren Barcode-Scanner in eine Plate-Map-Datei (Ergänzende Datei 1 für volle Pools; Ergänzende Datei 2 für halbgroße Pools). Falls ein Barcode nicht funktioniert, verwenden Sie den alphanumerischen Code auf dem Röhrchen, um die Probe zu protokollieren.
   HINWEIS: Eine Maske ist erforderlich, um das Scannen benachbarter Barcodes zu verhindern. Eine Maske kann hergestellt werden, indem man ein Loch in undurchsichtiges Papier schneidet und es dann laminiert. Barcodes, die in die Plattenzuordnungsdatei gescannt werden, werden in der gleichen Ausrichtung wie im Rack mit 96 Steckplätzen angezeigt.
7. Besprühen Sie die Probenröhrchen im Rack mit 70% Ethanol und tupfen Sie sie mit einem Papiertuch trocken.
   HINWEIS: Das Abwischen der Tuben anstelle des Abtupfens kann die Barcodes beschädigen.
8. Markieren Sie eine 96-Deep-Well-Platte mit einer Well-Kapazität von 2 mL mit der Run ID. Übertragen Sie 200 μl Speichelprobe aus jedem Probenröhrchen in die entsprechende Vertiefung der 96-Deep-Well-Platte. Wenn die Proben zu viskos sind, um sie zu übertragen, vortexen und erneut zentrifugieren. Probe ablehnen, wenn das Problem weiterhin besteht.
   HINWEIS: Speichelproben können fadenziehend sein und während des Transfers eine Schneckenspur auf der Platte hinterlassen, wenn der Techniker nicht aufpasst. Dies kann zu anfänglichen False Positives und mehr Samples führen, die schließlich im Bestätigungsschritt erneut ausgeführt werden müssen (siehe Abschnitt 6).
9. Wenn alle Proben übertragen sind, decken Sie die 96-Deep-Well-Platte mit einer Silikonmatte ab und lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Bewahren Sie die Racks mit 96 Steckplätzen mit den verbleibenden Proben auf, um potenziell positive Proben zu bestätigen.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

4. RNA-Isolierung

1. Beschriften Sie eine 96-Well-RNA-Isolationskartusche mit der Run ID und legen Sie sie auf eine leere Auffangplatte.
   HINWEIS: Platten mit Proben können zu diesem Zeitpunkt aus der Biosicherheitswerkbank entnommen werden.
2. Entfernen Sie die Silikonmatte von der 96-Deep-Well-Platte. Übertragen Sie 400 μl Virusladepuffer in jede Vertiefung der 96-Deep-Well-Platte.
3. Mischen Sie jede Probe, indem Sie zwei- bis viermal vorsichtig auf und ab pipettieren und die gesamte Probe in die entsprechende Säule in der 96-Well-RNA-Isolationskartusche übertragen.
   HINWEIS: Beim Mischen großer Mengen entstehen Blasen, die bei willkürlichem Mischen zur Kontamination benachbarter Bohrlöcher führen können. Bewusstes Mischen kann dieses Risiko verringern und die Integrität der nachgelagerten Verarbeitung schützen.
4. Zentrifugieren Sie die RNA-Isolationskartusche auf der Auffangplatte 10 Minuten lang bei 4.100 x g , um die Proben auf die Kartusche zu laden. Übertragen Sie die RNA-Isolationskartusche auf eine saubere Auffangplatte.
5. Geben Sie 500 μl Waschpuffer in jede Vertiefung der RNA-Isolationskartusche und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 4.100 x g . Übertragen Sie die RNA-Isolationskartusche auf eine saubere Auffangplatte.
6. Geben Sie 500 μl Waschpuffer in jede Vertiefung der RNA-Isolationskartusche und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 4.100 x g . Übertragen Sie die RNA-Isolationskartusche auf eine saubere Auffangplatte.
7. Geben Sie 500 μl 100 % Ethanol in jede Vertiefung der RNA-Isolationskartusche und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 4.100 x g . Übertragen Sie die RNA-Isolationskartusche auf eine saubere Auffangplatte.
   HINWEIS: Wenn die Probe zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollständig durch die Säule gegangen ist, ist die Probe zu viskos oder kleine Schmutzstücke in der Probe verstopfen die Säule. Die Probe muss vollständig aus der Kartusche entfernt werden, um den nachgelagerten Pooling-Prozess nicht zu verunreinigen, und die Probennummer muss der Auswurfdatei hinzugefügt werden.
8. Zentrifugieren Sie die RNA-Isolationskartusche auf der Auffangplatte 5 Minuten lang bei 4.100 x g , um die Säulen zu trocknen. Übertragen Sie die RNA-Isolationskartusche auf eine saubere Elutionsplatte, die mit der Run-ID und der Wortreihe beschriftet ist, und legen Sie dann beide auf eine saubere Auffangplatte.
9. Geben Sie 25 μl DNase/RNase-freies Wasser in molekularer Qualität in jede Vertiefung der RNA-Isolationspatrone. Zentrifugieren Sie 10 min lang bei 4.100 x g , um die RNA zu eluieren. Wenn die Probe nicht vollständig eluiert, zentrifugieren Sie die Probe erneut für 5 Minuten.
10. Die Elutionsplatten auf vorgekühlte Kühlplatten geben und abdecken. Fahren Sie sofort mit dem Probenpooling und der RT-qPCR fort.

5. Probenpooling und RT-qPCR

HINWEIS: Der Prozess ist in einem Zwei-Platten-System aufgebaut (siehe Abbildung 2). Die Elutions-RNA-Plattennummer entspricht der produzierten Spaltenplattennummer und dem Zeilenplattenbuchstaben (A = 1, B = 2, C = 3 usw.). Zu Dekonvolutionszwecken entspricht der Zeilenbuchstabe der Spaltenplatte dem Zeilenbuchstaben der RNA-Elutionsplatte, und die Spaltennummer der Zeilenplatte entspricht der Spaltennummer der RNA-Elutionsplatte. Zum Beispiel befindet sich eine Probe in der RNA-Platte #6 in Position C4 in der Position F4 der Reihenreaktionsplatte und in der Position C6 der Säulenreaktionsplatte.

6. Validierung positiver Proben

1. Markieren Sie zwei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und eine RNA-Extraktionssäule für jede Probe, die getestet werden muss. Verwenden Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen zum Mischen von Probe, MS2-Phagen und Virusladepuffer und das zweite Mikrozentrifugenröhrchen für den RNA-Elutionsschritt.
2. Geben Sie 5 μl MS2-Phagen-RNA in das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. 200 μl der potenziell positiven Probe werden in das Röhrchen überführt und 400 μl Virusladepuffer in das Röhrchen gegeben, durch Pipettieren gemischt.
3. Übertragen Sie den gesamten Inhalt in ein sauberes Sammelröhrchen in die vormarkierte RNA-Extraktionssäule. Zentrifugieren bei 10.000 x g für 2 min. Der Saugstrom fließt aus dem Sammelrohr durch.
4. Geben Sie 500 μl Waschpuffer in die RNA-Extraktionssäule und zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 10.000 x g . Der Saugstrom fließt aus dem Sammelrohr durch.
5. Geben Sie 500 μl Waschpuffer in die RNA-Extraktionssäule und zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 10.000 x g . Der Saugstrom fließt aus dem Sammelrohr durch.
6. Geben Sie 500 μl 100 % Ethanol in die RNA-Extraktionssäule und zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 10.000 x g . Übertragen Sie die RNA-Extraktionssäule in ein sauberes Sammelröhrchen und zentrifugieren Sie sie 1 Minute lang bei 10.000 x g , um die Säule zu trocknen.
7. Übertragen Sie die RNA-Extraktionssäule zur Elution in ein vormarkiertes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 25 μl DNase/RNase-freies Wasser in molekularer Qualität in die RNA-Extraktionssäule. Zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 10.000 x g , um die RNA zu sammeln und das Röhrchen auf nasses Eis zu übertragen.
8. Mastermix nach Herstellerangaben herstellen. Geben Sie 7 μl Mastermix in jede Vertiefung einer 96-Well-Reaktionsplatte, die die Probe enthält. Übertragen Sie 13 μl jeder isolierten RNA in die Reaktionsplatte.
   HINWEIS: Der Mastermix ist derselbe, der im gepoolten Probenprotokoll verwendet wird, enthält jedoch nicht den MS2-Phagen-RNA-Spike.
9. Bereiten Sie die Positivkontrolle vor, indem Sie 2 μl Positivkontrolllösung und 11 μl DNase/RNase-freies Wasser in molekularer Qualität in die Positivkontrollvertiefung auf der Reaktionsplatte geben. Bereiten Sie die No-Template-Kontrolle vor, indem Sie 13 μl DNase/RNase-freies Wasser in molekularer Qualität in die Negativkontrollvertiefung auf der Reaktionsplatte geben.
10. Decken Sie die Reaktionsplatten mit optischer Folie ab und wirbeln Sie sie 2 Minuten lang ein, um die Proben gut zu mischen. Reaktionsplatten bei 650 x g für 5 min zentrifugieren. Übertragen Sie die Platten in das RT-PCR-System und führen Sie sie mit zyklischen Parametern durch, die für den Mastermix geeignet sind.
    1. Für den hier angegebenen Mastermix verwenden Sie 25 °C für 2 Minuten, 53 °C für 10 Minuten, 95 °C für 2 Minuten, 40 Zyklen mit 95 °C für 3 s und 60 °C für 30 s.

Ergebnisse

Die überwiegende Mehrheit der Proben, die bisher im Labor eingegangen sind, wurde akzeptiert und hat die erste Stufe der visuellen Qualitätskontrolle durchlaufen. Die Notwendigkeit, eine Probe abzulehnen, beschränkt sich auf Gründe, die die Probenverarbeitung und/oder das Gesamtergebnis der Probe negativ beeinflussen können. Insbesondere ein falsches Volumen im Röhrchen, eine Konsistenz oder eine Farbe, die nicht für den Speichel geeignet ist, das Fehlen von Keramikkügelchen, die...

Diskussion

Während der Probenverarbeitung gibt es Schritte, die besondere Aufmerksamkeit erfordern. Der erste Schritt der Qualitätskontrolle, bei dem das Probenvolumen, die Konsistenz, die Farbe und das Vorhandensein der hinzugefügten Kügelchen untersucht werden, ist entscheidend für den Gesamterfolg des Prozesses. Röhrchen mit Proben, die nicht die richtige Menge an Speichel enthalten, könnten zu einem falsch negativen Ergebnis führen, da zu wenig Speichel zu wenig genetischem Material fü...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Step MM, no ROX	Thermo Fisher	A28523
1.2 mlDeep well Plates	Fisher	AB0564
100 mL reagent reservoirs	Corning	4872
2.8 mm Ceramic Beads	OMNI	19-646
25 ml conical w/screw cap	VWR	76338-496
50mL V bottom reservoirs	Costar	4870
5430-High-Speed Centrifuge	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf Tube	Fisher	14282300
8 strip tubes for QuantStudio	life technologies	4316567
Beta Mercaptoethanol	Fisher	AC125472500
Ethanol 200 Proof, Molecular Biology Grade	Fisher	BP28184
Microamp Endura Optical 96-well fast clear reaction plate with barcode	life technologies	4483485
Microamp Fast Optical 96 well plate	Fisher	4346906
Mini Microcentrifuge	Corning Medical	6770
optical caps for strip tubes	life technologies	AB-1820
Optical Film	Thermo Fisher	4311971
PCR plate sealing film Non-optical	Fisher	AB-0558
PCR Plate semi-skirted	Fisher	14230244
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
Quick RNA Viral Kit confirmation	Zymo	R1035
Reagent Reservoir, 100ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
Small Biohazard Bags	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19 kit	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrifuge	Thermo Fisher	75009525
Transfer Pipet	Fisher	22170404
Viral 96 Kit	Zymo	R1041
Vortex Mixer	Fisher	2215414