Teste de SARS-CoV-2 em larga escala utilizando saliva e agrupamento de amostras de transposição

Summary

O protocolo destina-se a servir como um modelo para universidades e outras organizações que consideram testes em larga escala para SARS-CoV-2 ou desenvolvem planos de preparação para futuros surtos virais.

Abstract

A identificação e o isolamento de indivíduos contagiosos, juntamente com a quarentena de contatos próximos, são essenciais para retardar a propagação do COVID-19. Os testes em larga escala com capacidade de vigilância ou triagem para portadores assintomáticos de COVID-19 fornecem dados sobre a disseminação viral e a capacidade de acompanhamento para testar rapidamente os indivíduos durante suspeitas de surtos. O programa de detecção precoce de COVID-19 da Michigan State University tem utilizado testes em larga escala em uma capacidade de vigilância ou triagem desde o outono de 2020. Os métodos adaptados aqui aproveitam a confiabilidade, o grande volume de amostra e os benefícios de autocoleta da saliva, combinados com um esquema de agrupamento bidimensional de conservação de reagentes e econômico. O processo foi projetado para ser adaptável à escassez de suprimentos, com muitos componentes dos kits e do ensaio facilmente substituídos. Os processos descritos para coleta e processamento de amostras de SARS-CoV-2 podem ser adaptados para testar futuros patógenos virais expressos de forma confiável na saliva. Ao fornecer este plano para universidades ou outras organizações, planos de preparação para futuros surtos virais podem ser desenvolvidos.

Introduction

A pandemia de COVID-19, causada pelo vírus SARS-CoV-2, causou a morte de mais de 6,2 milhões de pessoas até o momento, com números aumentando a cada dia¹. O padrão-ouro de teste para SARS-CoV-2 é a PCR quantitativa em tempo real (RT-q), com primers projetados para atingir o genoma viral, como nucleocapsídeo, envelope, pico e genes de RNA polimerase dependentes de RNA². No início da pandemia, faltava capacidade suficiente para testes de SARS-CoV-2. Surgiu da falta de ensaios validados, componentes de teste, pessoal clínico e uma infraestrutura despreparada para se expandir rapidamente par....

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Protocol

Os estudos realizados para otimizar os métodos do Programa de Detecção Precoce foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Michigan State University. Todas as figuras foram reproduzidas com amostras artificiais e são representativas dos resultados humanos observados. Nenhum dado, informação ou resultado mostrado no manuscrito é de qualquer participante do Programa de Detecção Precoce da Michigan State University.

1. Produção de kits

NOTA: Durante a montagem do kit, use máscaras, luvas, proteção para os olhos e jalecos o tempo todo para evitar a contam....

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Results

A grande maioria das amostras recebidas pelo laboratório até o momento foi aceita e passou na etapa inicial de controle de qualidade visual. A necessidade de rejeitar uma amostra é limitada a razões que podem influenciar negativamente o processamento da amostra e/ou os resultados gerais da amostra. Especificamente, volume incorreto no tubo, consistência ou cor não natural para a saliva, ausência de grânulos de cerâmica usados para auxiliar na homogeneização da amostra e códig.......

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Discussion

Durante o processamento da amostra, há etapas que requerem atenção cuidadosa. A etapa inicial de controle de qualidade, que analisa o volume da amostra, consistência, cor e presença de grânulos adicionados, é fundamental para o sucesso geral do processo. Tubos com amostras que não contêm a quantidade correta de saliva podem produzir um falso negativo, pois pouca saliva resultaria em material genético insuficiente; por outro lado, muita saliva não estaria na proporção correta.......

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Step MM, no ROX	Thermo Fisher	A28523
1.2 mlDeep well Plates	Fisher	AB0564
100 mL reagent reservoirs	Corning	4872
2.8 mm Ceramic Beads	OMNI	19-646
25 ml conical w/screw cap	VWR	76338-496
50mL V bottom reservoirs	Costar	4870
5430-High-Speed Centrifuge	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf Tube	Fisher	14282300
8 strip tubes for QuantStudio	life technologies	4316567
Beta Mercaptoethanol	Fisher	AC125472500
Ethanol 200 Proof, Molecular Biology Grade	Fisher	BP28184
Microamp Endura Optical 96-well fast clear reaction plate with barcode	life technologies	4483485
Microamp Fast Optical 96 well plate	Fisher	4346906
Mini Microcentrifuge	Corning Medical	6770
optical caps for strip tubes	life technologies	AB-1820
Optical Film	Thermo Fisher	4311971
PCR plate sealing film Non-optical	Fisher	AB-0558
PCR Plate semi-skirted	Fisher	14230244
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
Quick RNA Viral Kit confirmation	Zymo	R1035
Reagent Reservoir, 100ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
Small Biohazard Bags	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19 kit	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrifuge	Thermo Fisher	75009525
Transfer Pipet	Fisher	22170404
Viral 96 Kit	Zymo	R1041
Vortex Mixer	Fisher	2215414