Teste de SARS-CoV-2 em larga escala utilizando saliva e agrupamento de amostras de transposição

Resumo

O protocolo destina-se a servir como um modelo para universidades e outras organizações que consideram testes em larga escala para SARS-CoV-2 ou desenvolvem planos de preparação para futuros surtos virais.

Resumo

A identificação e o isolamento de indivíduos contagiosos, juntamente com a quarentena de contatos próximos, são essenciais para retardar a propagação do COVID-19. Os testes em larga escala com capacidade de vigilância ou triagem para portadores assintomáticos de COVID-19 fornecem dados sobre a disseminação viral e a capacidade de acompanhamento para testar rapidamente os indivíduos durante suspeitas de surtos. O programa de detecção precoce de COVID-19 da Michigan State University tem utilizado testes em larga escala em uma capacidade de vigilância ou triagem desde o outono de 2020. Os métodos adaptados aqui aproveitam a confiabilidade, o grande volume de amostra e os benefícios de autocoleta da saliva, combinados com um esquema de agrupamento bidimensional de conservação de reagentes e econômico. O processo foi projetado para ser adaptável à escassez de suprimentos, com muitos componentes dos kits e do ensaio facilmente substituídos. Os processos descritos para coleta e processamento de amostras de SARS-CoV-2 podem ser adaptados para testar futuros patógenos virais expressos de forma confiável na saliva. Ao fornecer este plano para universidades ou outras organizações, planos de preparação para futuros surtos virais podem ser desenvolvidos.

Introdução

A pandemia de COVID-19, causada pelo vírus SARS-CoV-2, causou a morte de mais de 6,2 milhões de pessoas até o momento, com números aumentando a cada dia¹. O padrão-ouro de teste para SARS-CoV-2 é a PCR quantitativa em tempo real (RT-q), com primers projetados para atingir o genoma viral, como nucleocapsídeo, envelope, pico e genes de RNA polimerase dependentes de RNA². No início da pandemia, faltava capacidade suficiente para testes de SARS-CoV-2. Surgiu da falta de ensaios validados, componentes de teste, pessoal clínico e uma infraestrutura despreparada para se expandir rapidamente para acomodar testes em massa em nível de pandemia. Devido à escassez, os centros de testes geralmente exigiam o encaminhamento de um médico para serem elegíveis para o teste. Essa escassez resultou em atrasos na aprovação dos testes, longas filas para coleta desconfortável de amostras nasofaríngeas e longos tempos de espera pelos resultados. Além disso, devido a essas restrições, os esforços de teste não puderam acomodar portadores pré-sintomáticos, leves ou assintomáticos que espalham o SARS-CoV-2 sem saber. A falta de testes generalizados e de fácil acesso provavelmente contribuiu para a disseminação descontrolada do COVID-19.

O teste intervalado em larga escala pode ser realizado como vigilância ou triagem. Ambos podem ser usados para monitorar as taxas de positividade locais em áreas de transmissão de alta densidade ou alto risco e podem ser utilizados para tomar decisões de saúde pública. O teste de vigilância destina-se a monitorar a incidência e prevalência da doença em uma população e não é usado para diagnósticos individuais³. Os resultados da vigilância geralmente são desidentificados e não são devolvidos aos participantes; os laboratórios que realizam testes de vigilância não precisam ser clinicamente certificados, nem são obrigados a usar um ensaio autorizado pela FDA. A triagem permite que os resultados sejam devolvidos a participantes individuais, mas os laboratórios de triagem nos Estados Unidos devem ter um certificado de Emendas de Melhoria de Laboratório Clínico (CLIA) e atender a todos os requisitos aplicáveis da CLIA.

O programa de detecção precoce da Michigan State University (MSU) começou em setembro de 2020 e processou mais de 350.000 amostras. O programa surgiu dos esforços de um grupo de pesquisa para projetar um ensaio SARS-CoV-2 altamente sensível que não exigisse suprimentos de teste de alta demanda 4,5,6,7,8. Os objetivos eram ajudar os laboratórios clínicos a aumentar a capacidade e desenvolver processos flexíveis para acomodar a escassez de suprimentos, ao mesmo tempo em que desenvolviam uma estratégia de triagem para estabelecer um plano de retorno ao trabalho para a Faculdade de Medicina Humana da MSU. Os esforços iniciais se concentraram em métodos alternativos de coleta, extração e quantificação para SARS-CoV-2. A alta demanda e a subsequente escassez de swabs nasofaríngeos levaram à avaliação de amostras de narinas anteriores coletadas com swabs bucais, e a escassez de reagentes resultou no desenvolvimento de um método de extração de amostras adaptado dos primeiros relatórios de Wuhan, China⁹. Para aumentar a sensibilidade para detectar SARS-CoV-2 em amostras de narinas anteriores, a PCR digital de gotículas foi substituída por RT-qPCR ^6,7. Embora a PCR digital de gotículas seja altamente sensível e possa fornecer valores absolutos com uma leitura de endpoint, foi determinado que seu uso não era viável para testes em larga escala devido à falta de instrumentação confiável de alto rendimento para a tecnologia. Além disso, a autocoleta de amostras de narinas anteriores com base nos níveis de RNase P humana foi extremamente variável, sugerindo que não era suficientemente confiável para testes em massa.

Uma alternativa aos swabs nasofaríngeos e das narinas anteriores é a coleta de saliva. Vírus respiratórios como SARS-CoV, H1N1 e MERS foram historicamente detectados na saliva 10,11,12,13. Isso foi posteriormente comprovado para SARS-CoV-2 14,15,16,17. A comparação direta entre amostras de saliva e nasofaringe mostrou que a saliva produz títulos virais mais altos do que os swabs nasofaríngeos em amostras pareadas, e que a saliva é menos variável com a coleta repetida de amostras¹⁴. A saliva também foi relatada como mais sensível em certas variantes, como a Omicron, em comparação com a Delta¹⁶. Os benefícios adicionais à coleta de saliva são a relativa facilidade de autocoleta fora do local sem suprimentos de alta demanda, a capacidade de testar repetidamente a amostra, se necessário, a eliminação dos requisitos de pessoal no local para coleta de amostras e a prevenção de filas de participantes que podem aumentar o potencial de transmissão viral. O kit de saliva montado em laboratório foi desenvolvido como uma colaboração entre desenvolvedores de ensaios de laboratório, especialistas na escola de embalagens, especialistas em marcas universitárias, oficiais de segurança e parceiros de fabricação externos que produziram a caixa e o sistema de rotulagem.

Embora as amostras de saliva ofereçam amplo material de partida genético e o RT-qPCR forneça resultados sensíveis e confiáveis, o custo dos reagentes (primer/sondas e master mix) tornou o teste em larga escala de amostras individuais um empreendimento caro em um indivíduo, por amostra. Como o primer/sondas e o master mix são os componentes mais caros do processo, o objetivo era buscar soluções que ampliassem seu uso e, portanto, diminuíssem o custo por amostra. A otimização sistêmica do tamanho do pool de amostras com base na incidência na comunidade e na sensibilidade do ensaio foi proposta para testes de SARS-CoV-2¹⁸. No entanto, quando pools de qualquer tamanho indicam a presença de SARS-CoV-2, todos os participantes do pool devem ser testados novamente, resultando em perda de tempo e aumento das oportunidades de disseminação. Para lidar com essas limitações, um método de agrupamento bidimensional foi empregado, como o processo proposto por Zilinskas e outros¹⁹ para realizar uma primeira passagem sob as restrições dos testes de vigilância. Nesse processo, 96 amostras individuais são colocadas em uma placa de 96 poços composta por 12 colunas e oito linhas. Cada amostra é incluída em um pool de oito e um pool de 12 em duas placas de reação diferentes. Isso faz com que cada amostra seja representada de forma única com os dois pools. A deconvolução dos pools com base nas coordenadas identifica amostras potencialmente positivas. As amostras em pools onde o SARS-CoV-2 não foi detectado não passam do teste de vigilância para a triagem. Enquanto isso, amostras de indivíduos com teste positivo no processo de vigilância são extraídas novamente por meio de um processo de triagem aprovado pela CLIA. Se confirmado positivo, os indivíduos recebem seu resultado, são encaminhados ao consultório médico da universidade, o rastreamento de contatos é iniciado e o departamento de saúde é notificado. No total, a amostra de um indivíduo é testada em três reações separadas antes de ser declarada positiva, duas vezes em pools de vigilância e uma vez como uma única triagem confirmatória, reduzindo as chances de um falso positivo. O pool de amostras usa ~80% menos reagentes do que a execução de amostras individualmente, resultando em um custo de ~US$ 12 por amostra.

Além do kit de saliva, estratégia de agrupamento e processo de desenvolvimento de ensaios, a equipe também desenvolveu um plano de logística para distribuição de kits, coleta de amostras e relatórios de resultados. Os participantes do programa pegam seu kit, registram o código alfanumérico exclusivo em seu tubo, produzem sua amostra e a depositam em uma das muitas caixas de coleta onde são coletadas diariamente e transportadas para o laboratório. O laboratório processa as amostras, o supervisor técnico analisa e carrega os resultados e os participantes são notificados para verificar o portal de resultados. Este processo tem um tempo de resposta de 24-48 h a partir do momento em que uma amostra é depositada. A colaboração de todas as partes da instituição foi fundamental para uma implementação bem-sucedida em larga escala desse processo híbrido de vigilância e triagem. Os procedimentos e descrições a seguir do programa de testes e da infraestrutura necessária destinam-se a ser planos sobre como ampliar os testes para fins de vigilância e/ou triagem futuras.

Protocolo

Os estudos realizados para otimizar os métodos do Programa de Detecção Precoce foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Michigan State University. Todas as figuras foram reproduzidas com amostras artificiais e são representativas dos resultados humanos observados. Nenhum dado, informação ou resultado mostrado no manuscrito é de qualquer participante do Programa de Detecção Precoce da Michigan State University.

1. Produção de kits

NOTA: Durante a montagem do kit, use máscaras, luvas, proteção para os olhos e jalecos o tempo todo para evitar a contaminação dos componentes do kit.

1. Preparação de componentes do kit
   1. Usando um marcador permanente, desenhe uma linha denotando 1 mL no tubo cônico de 25 mL. Usando um marcador permanente, desenhe uma linha indicando 1 mL na pipeta de transferência.
   2. Adicione quatro esferas de cerâmica ao tubo de amostra de 5 mL. Pipetar 1 mL de solução de estabilização de RNA no tubo de amostra e feche o tubo. Anexe um adesivo de barra que consiste em um código de identificação exclusivo ao tubo de amostra com o código de barras da matriz de dados na parte superior e o identificador repetido em código alfanumérico na lateral.
      NOTA: As esferas de cerâmica são livres de RNase / DNase e não precisam ser esterilizadas posteriormente.
2. Coloque um tubo cônico de 25 mL, um tubo de amostra de 5 mL, uma pipeta de transferência e uma pequena bolsa de risco biológico na caixa do kit (Figura Suplementar 1).
   NOTA: Os tubos cônicos não precisam ser livres de DNase/RNase. A integridade da amostra é preservada pela solução de estabilização de RNA.

2. Usos do kit para coleta de auto-amostra

1. De acordo com as instruções do kit, peça aos participantes que não comam ou bebam 30 minutos antes de fornecer uma amostra. Peça aos participantes que cuspam no tubo cônico de 25 mL até que 1 mL de saliva seja coletado (linha marcada).
2. Usando a pipeta, transfira 1 mL de saliva (até a linha marcada) para o tubo de amostra de 5 mL contendo solução de estabilização de RNA e esferas de cerâmica. Feche e agite o sample tubo por 15 s.
3. Peça aos participantes que registrem o código alfanumérico atribuído à amostra no site designado. Uma vez feito isso, peça-lhes que coloquem o tubo de amostra em um pequeno saco de risco biológico e depositem em uma lixeira de coleta.

3. Ingestão de amostras e preparação para isolamento de RNA

NOTA: Todas as etapas ocorrem em um gabinete de biossegurança ou balde de centrífuga com tampa de biocontenção.

1. Desinfete e inspecione visualmente as amostras para controle de qualidade enquanto ainda estão no saco de risco biológico.
2. Rejeite a amostra se (Figura 1): a amostra for de cor não natural (ou seja, verde, azul) ou contiver partículas de alimentos ou sangue; a amostra está vazando ou faltando contas; a amostra tem volume esperado incorreto (<1,5 mL ou >3 mL); A amostra não tem um código de barras ou código alfanumérico anexado.
   1. Se a amostra for rejeitada, digitalize e registre a amostra em um arquivo de rejeição com uma nota sobre o motivo pelo qual a amostra foi rejeitada. Se a amostra for rejeitada porque não tem identificadores, registre a amostra como Sem código de barras no arquivo de rejeição.
3. Se a amostra não for rejeitada, abra o saco de risco biológico com uma tesoura e remova o tubo de amostra. Vortex o tubo por 15 s e, em seguida, coloque o sample tubo em um adaptador de tubo para uma centrífuga de balde oscilante.
4. Quando os adaptadores de tubo estiverem cheios, prenda a tampa de biocontenção sobre o balde da centrífuga e transfira para a centrífuga. Centrifugue amostras a 4.100 x g por 2 min e devolva as amostras ao gabinete de biossegurança.
   NOTA: A centrifugação é usada para pellet detritos e forçar material mais viscoso na saliva para o fundo do tubo. Isso elimina a necessidade de proteinase K no processo. Uma execução completa consiste em 768 amostras (oito placas de 96 poços cheias de amostras após o isolamento do RNA).
5. Sem perturbar o material peletizado, transfira os tubos de amostra para um rack de tubos de 96 slots pré-rotulado com o ID da execução, que inclui o número do rack (1-8), a data e o grupo correspondente com o qual as amostras serão agrupadas/avaliadas (um identificador para denotar o grupo, ou seja, o grupo A é a primeira execução do dia).
6. Quando os racks de tubos de 96 slots estiverem cheios ou não houver amostras, usando um leitor de código de barras portátil, digitalize os tubos em um arquivo de mapa de placas (Arquivo Suplementar 1 para piscinas cheias; Arquivo Suplementar 2 para pools de tamanho médio). Caso um código de barras não funcione, use o código alfanumérico no tubo para registrar a amostra.
   NOTA: É necessária uma máscara para impedir a leitura de códigos de barras adjacentes. Uma máscara pode ser feita cortando um orifício em papel opaco e laminando-o. Os códigos de barras digitalizados no arquivo de mapa de placas aparecerão na mesma orientação do rack de 96 slots.
7. Pulverize os tubos de amostra no rack com etanol a 70% e seque com uma toalha de papel.
   NOTA: Limpar os tubos em vez de enxugar pode danificar os códigos de barras.
8. Rotule uma placa de 96 poços profundos com capacidade de poço de 2 mL com o Run ID. Transfira 200 μL de saliva sample sample de cada sample tubo para o poço correspondente da placa de 96 poços profundos. Se as amostras forem muito viscosas para serem transferidas, vórtice e centrifugue novamente. Rejeite a amostra se o problema persistir.
   NOTA: As amostras de saliva podem ser fibrosas e deixar um rastro de caracol na placa durante a transferência se o técnico não tomar cuidado. Isso pode levar a falsos positivos iniciais e mais amostras que eventualmente precisarão ser executadas novamente na etapa de confirmação (consulte a seção 6).
9. Quando todas as amostras forem transferidas, cubra a placa de 96 poços profundos com um tapete de silicone e armazene em temperatura ambiente. Salve e armazene os racks de 96 slots com amostras restantes para confirmação de amostras potencialmente positivas.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

4. Isolamento de RNA

1. Rotule um cartucho de isolamento de RNA de 96 poços com o Run ID e coloque-o em cima de uma placa de coleta vazia.
   NOTA: As placas contendo samples podem ser removidas do gabinete de biossegurança neste momento.
2. Remova o tapete de silicone da placa de 96 poços profundos. Transfira 400 μL de tampão de carga viral para cada poço da placa de 96 poços profundos.
3. Misture cada amostra pipetando suavemente para cima e para baixo duas a quatro vezes e transfira toda a amostra para a coluna correspondente no cartucho de isolamento de RNA de 96 poços.
   NOTA: A mistura de grandes volumes criará bolhas que podem levar à contaminação dos poços vizinhos se realizada ao acaso. A mistura deliberada pode reduzir esse risco e proteger a integridade do processamento a jusante.
4. Centrifugue o cartucho de isolamento de RNA no topo da placa de coleta a 4.100 x g por 10 min para carregar samples no cartucho. Transfira o cartucho de isolamento de RNA para uma placa de coleta limpa.
5. Adicione 500 μL de tampão de lavagem a cada poço do cartucho de isolamento de RNA e centrifugue a 4.100 x g por 5 min. Transfira o cartucho de isolamento de RNA para uma placa de coleta limpa.
6. Adicione 500 μL de tampão de lavagem a cada poço do cartucho de isolamento de RNA e centrifugue a 4.100 x g por 5 min. Transfira o cartucho de isolamento de RNA para uma placa de coleta limpa.
7. Adicione 500 μL de etanol 100% a cada poço do cartucho de isolamento de RNA e centrifugue a 4.100 x g por 5 min. Transfira o cartucho de isolamento de RNA para uma placa de coleta limpa.
   NOTA: Se a amostra não tiver passado completamente pela coluna neste ponto, a amostra é muito viscosa ou pequenos pedaços de detritos na amostra estão entupindo a coluna. A amostra precisa ser removida completamente do cartucho para não contaminar o processo de pooling a jusante e o número da amostra adicionado ao arquivo de rejeição.
8. Centrifugue o cartucho de isolamento de RNA no topo da placa de coleta a 4.100 x g por 5 min para secar as colunas. Transfira o cartucho de isolamento de RNA para uma placa de eluição limpa rotulada com o Run ID e a palavra row e, em seguida, coloque ambos em cima de uma placa de coleta limpa.
9. Adicione 25 μL de água de grau molecular livre de DNase / RNase a cada poço do cartucho de isolamento de RNA. Centrifugue a 4.100 x g por 10 min para eluir o RNA. Se a amostra não eluir completamente, centrifugue novamente a amostra por 5 min.
10. Transfira as placas de eluição para placas frias pré-resfriadas e cubra. Prossiga imediatamente para o pool de amostras e RT-qPCR.

5. Agrupamento de amostras e RT-qPCR

NOTA: O processo é configurado em um sistema de duas placas (como visto na Figura 2). O número da placa de RNA de eluição corresponde ao número da placa da coluna produzida e à letra da placa da linha (A = 1, B = 2, C = 3, etc.). Para fins de deconvolução, a letra da linha da placa da coluna corresponderá à letra da linha da placa de eluição de RNA, e o número da coluna da placa de linha corresponderá ao número da coluna da placa de eluição de RNA. Por exemplo, uma amostra na placa de RNA #6 na posição C4 será encontrada na posição da placa de reação da linha F4 e na posição da placa de reação da coluna C6.

1. Rotule uma nova placa de eluição com o Run ID e a palavra row e coloque em uma placa fria pré-resfriada. Transferir 10 μL de RNA de cada alvéolo da placa de eluição da linha para a linha correspondente da placa de eluição da coluna, fazendo assim uma cópia da placa de eluição original (Figura 2).
   NOTA: As placas de eluição marcadas com coluna serão agrupadas na direção da coluna e as placas de eluição marcadas com linha serão agrupadas na direção da linha.
2. Para a placa agrupada de colunas, transfira todo o volume de cada poço através da placa para o número da coluna que corresponde ao número da placa de identificação de execução. Para a placa agrupada em linha, transfira todo o volume de cada poço para cima ou para baixo na placa para o número da linha que corresponde ao número da placa Run ID (1 = A, 2 = B, etc.; Figura 2).
3. Transfira 13 μL de cada amostra agrupada para a coluna ou linha correspondente de uma placa de reação de 96 poços (Figura 2).
4. Para este protocolo, use três sondas contra os genes do nucleocapsídeo (N), ORF1ab e spike (S) para detectar SARS-CoV-2 e uma quarta sonda de primer direcionada ao fago MS2 como controle interno. Nas amostras agrupadas, coloque um controle positivo de fago MS2 na mistura principal. Em amostras executadas individualmente, coloque o fago MS2 na amostra no cartucho de isolamento de RNA e use como controle de extração.
   NOTA: Master mix, sondas de primer, corantes fluorescentes e têmperas variam de acordo com o ensaio. Proporções apropriadas e canais fluorescentes devem ser determinados por cada laboratório.
5. Preparar o controlo positivo adicionando 2 μl de solução de controlo positivo e 11 μl de água de qualidade molecular isenta de DNase/RNase ao poço de controlo positivo na placa de reacção (figura 2).
6. Prepare o controle sem modelo adicionando 13 μL de água de grau molecular livre de DNase / RNase ao poço de controle negativo na placa de reação.
7. Faça a mistura principal de acordo com as instruções do fabricante e aumente o controle positivo do fago MS2. Dispense 7 μL de master mix em cada poço das placas de reação de 96 poços que contêm amostras ou controles. Limite a exposição à luz fluorescente.
8. Cubra as placas de reação com filme óptico e vórtice por 2 min para misturar bem as amostras. Centrifugue as placas de reação a 650 x g por 5 min.
9. Transfira as placas para o sistema RT-PCR e execute com parâmetros de ciclagem apropriados para a mistura principal. Para o master mix usado aqui, os seguintes ciclos foram executados: 25 ° C por 2 min, 53 ° C por 10 min, 95 ° C por 2 min, 40 ciclos de 95 ° C por 3 s e 60 ° C por 30s.
10. Depois que as amostras forem executadas, execute uma deconvolução dos pools para identificar possíveis amostras positivas manualmente (Figura 3) e por meio de um aplicativo R Script Shiny.
    1. Exporte resultados de placas de reação de coluna e linha como arquivos de planilha. Abra o aplicativo Shiny do script R de deconvolução do pool (código-fonte disponível em: https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP).
    2. Arraste e solte os arquivos de mapa de placas, colunas e linhas no aplicativo e execute o aplicativo. Salve a lista produzida a partir do aplicativo.
       NOTA: A lista produzida a partir do aplicativo contém todos os códigos de barras inseridos no mapa de placas e se eles são provavelmente positivos ou negativos com base no script de deconvolução do pool. Essas amostras sinalizadas como potenciais positivos são reprocessadas individualmente.

6. Validação de amostras positivas

1. Rotule dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e uma coluna de extração de RNA para cada amostra que precisa ser testada. Use um tubo de microcentrífuga para misturar amostra, fago MS2 e tampão de carga viral, e o segundo tubo de microcentrífuga para a etapa de eluição de RNA.
2. Adicione 5 μL de MS2 Phage RNA ao tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Transfira 200 μL da amostra potencialmente positiva para o tubo e adicione 400 μL de tampão de carga viral ao tubo, misture por pipetagem.
3. Transfira todo o conteúdo para a coluna de extração de RNA pré-marcada em um tubo de coleta limpo. Centrifugue a 10.000 x g por 2 min. Aspirar o fluxo através do tubo de recolha.
4. Adicione 500 μL de tampão de lavagem à coluna de extração de RNA e centrifugue a 10.000 x g por 2 min. Aspirar o fluxo através do tubo de recolha.
5. Adicione 500 μL de tampão de lavagem à coluna de extração de RNA e centrifugue a 10.000 x g por 2 min. Aspirar o fluxo através do tubo de recolha.
6. Adicione 500 μL de etanol 100% à coluna de extração de RNA e centrifugue a 10.000 x g por 1 min. Transfira a coluna de extração de RNA para um tubo de coleta limpo e centrifugue a 10.000 x g por 1 min para secar a coluna.
7. Transfira a coluna de extração de RNA para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL pré-marcado para eluição. Adicione 25 μL de água de grau molecular livre de DNase / RNase à coluna de extração de RNA. Centrifugue a 10.000 x g por 2 min para coletar o RNA e transferir o tubo para o gelo úmido.
8. Faça a mistura principal de acordo com as instruções do fabricante. Dispense 7 μL de mistura principal em cada poço de uma placa de reação de 96 poços que conterá a amostra. Transfira 13 μL de cada RNA isolado para a placa de reação.
   NOTA: A mistura master é a mesma usada no protocolo de amostra agrupada, mas não inclui o pico de RNA do fago MS2.
9. Preparar o controlo positivo adicionando 2 μl de solução de controlo positivo e 11 μl de água de qualidade molecular isenta de DNase/RNase ao poço de controlo positivo na placa de reacção. Prepare o controle sem modelo adicionando 13 μL de água de grau molecular livre de DNase / RNase ao poço de controle negativo na placa de reação.
10. Cubra as placas de reação com filme óptico e vórtice por 2 min para misturar bem as amostras. Centrifugue as placas de reação a 650 x g por 5 min. Transfira as placas para o sistema RT-PCR e execute com parâmetros de ciclagem apropriados para a mistura principal.
    1. Para a mistura principal indicada aqui, use 25 ° C por 2 min, 53 ° C por 10 min, 95 ° C por 2 min, 40 ciclos de 95 ° C por 3 s e 60 ° C por 30 s.

Resultados

A grande maioria das amostras recebidas pelo laboratório até o momento foi aceita e passou na etapa inicial de controle de qualidade visual. A necessidade de rejeitar uma amostra é limitada a razões que podem influenciar negativamente o processamento da amostra e/ou os resultados gerais da amostra. Especificamente, volume incorreto no tubo, consistência ou cor não natural para a saliva, ausência de grânulos de cerâmica usados para auxiliar na homogeneização da amostra e códig...

Discussão

Durante o processamento da amostra, há etapas que requerem atenção cuidadosa. A etapa inicial de controle de qualidade, que analisa o volume da amostra, consistência, cor e presença de grânulos adicionados, é fundamental para o sucesso geral do processo. Tubos com amostras que não contêm a quantidade correta de saliva podem produzir um falso negativo, pois pouca saliva resultaria em material genético insuficiente; por outro lado, muita saliva não estaria na proporção correta...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Step MM, no ROX	Thermo Fisher	A28523
1.2 mlDeep well Plates	Fisher	AB0564
100 mL reagent reservoirs	Corning	4872
2.8 mm Ceramic Beads	OMNI	19-646
25 ml conical w/screw cap	VWR	76338-496
50mL V bottom reservoirs	Costar	4870
5430-High-Speed Centrifuge	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf Tube	Fisher	14282300
8 strip tubes for QuantStudio	life technologies	4316567
Beta Mercaptoethanol	Fisher	AC125472500
Ethanol 200 Proof, Molecular Biology Grade	Fisher	BP28184
Microamp Endura Optical 96-well fast clear reaction plate with barcode	life technologies	4483485
Microamp Fast Optical 96 well plate	Fisher	4346906
Mini Microcentrifuge	Corning Medical	6770
optical caps for strip tubes	life technologies	AB-1820
Optical Film	Thermo Fisher	4311971
PCR plate sealing film Non-optical	Fisher	AB-0558
PCR Plate semi-skirted	Fisher	14230244
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
Quick RNA Viral Kit confirmation	Zymo	R1035
Reagent Reservoir, 100ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
Small Biohazard Bags	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19 kit	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrifuge	Thermo Fisher	75009525
Transfer Pipet	Fisher	22170404
Viral 96 Kit	Zymo	R1041
Vortex Mixer	Fisher	2215414