Tests SARS-CoV-2 à grande échelle utilisant la salive et le regroupement d’échantillons par transposition

Résumé

Le protocole est destiné à servir de modèle aux universités et à d’autres organisations qui envisagent des tests à grande échelle pour le SRAS-CoV-2 ou qui élaborent des plans de préparation aux futures épidémies virales.

Résumé

L’identification et l’isolement des personnes contagieuses, ainsi que la mise en quarantaine des contacts étroits, sont essentiels pour ralentir la propagation de la COVID-19. Le dépistage à grande échelle dans le cadre d’une capacité de surveillance ou de dépistage des porteurs asymptomatiques de la COVID-19 fournit à la fois des données sur la propagation virale et la capacité de suivi pour tester rapidement les individus en cas d’éclosion suspectée. Depuis l’automne 2020, le programme de détection précoce de la COVID-19 de l’Université d’État du Michigan utilise des tests à grande échelle dans le cadre d’une capacité de surveillance ou de dépistage. Les méthodes adaptées ici tirent parti de la fiabilité, du grand volume d’échantillons et des avantages de l’auto-collecte de salive, associés à un système de regroupement bidimensionnel rentable et conservateur des réactifs. Le processus a été conçu pour pouvoir s’adapter aux pénuries d’approvisionnement, avec de nombreux composants des kits et du test facilement substitués. Les processus décrits pour la collecte et le traitement des échantillons de SARS-CoV-2 peuvent être adaptés pour tester les futurs agents pathogènes viraux exprimés de manière fiable dans la salive. En fournissant ce plan aux universités ou à d’autres organisations, des plans de préparation aux futures épidémies virales peuvent être élaborés.

Introduction

La pandémie de COVID-19, causée par le virus SARS-CoV-2, a causé la mort de plus de 6,2 millions de personnes à ce jour, avec des chiffres en hausse chaque jour¹. L’étalon-or des tests pour le SRAS-CoV-2 est la PCR quantitative en temps réel (RT-q), avec des amorces conçues pour cibler le génome viral, tels que la nucléocapside, l’enveloppe, la pointe et les gènes² de l’ARN polymérase dépendante de l’ARN. Au début de la pandémie, les capacités de dépistage du SARS-CoV-2 faisaient cruellement défaut. Il est né d’un manque de tests validés, de composants de test, de personnel clinique et d’une infrastructure non préparée à se développer rapidement pour accueillir des tests de masse au niveau de la pandémie. En raison des pénuries, les centres de test exigeaient souvent la recommandation d’un médecin pour être éligibles au test. Ces pénuries ont entraîné des retards dans l’approbation des tests, de longues files d’attente pour le prélèvement d’échantillons nasopharyngés inconfortables et de longs délais d’attente pour les résultats. De plus, en raison de ces contraintes, les efforts de dépistage n’ont pas pu s’adapter aux porteurs présymptomatiques, légers ou asymptomatiques qui propagent sans le savoir le SRAS-CoV-2. L’absence de tests de dépistage généralisés et facilement accessibles a probablement contribué à la propagation incontrôlée de la COVID-19.

Les tests d’intervalle à grande échelle peuvent être effectués soit à titre de surveillance, soit de dépistage. Les deux peuvent être utilisés pour surveiller les taux de positivité locaux dans les zones à forte densité ou à haut risque de transmission et peuvent être utilisés pour prendre des décisions de santé publique. Les tests de surveillance visent à surveiller l’incidence et la prévalence de la maladie dans une population et ne sont pas utilisés pour des diagnostics individuels³. Les résultats de la surveillance sont généralement anonymisés et ne sont pas retournés aux participants ; les laboratoires effectuant des tests de surveillance n’ont pas besoin d’être cliniquement certifiés ni d’utiliser un test autorisé par la FDA. Le dépistage permet de renvoyer les résultats à des participants individuels, mais les laboratoires de dépistage aux États-Unis doivent disposer d’un certificat CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) et répondre à toutes les exigences CLIA applicables.

Le programme de détection précoce de l’Université d’État du Michigan (MSU) a débuté en septembre 2020 et a traité plus de 350 000 échantillons. Le programme est né des efforts d’un groupe de recherche pour concevoir un test SARS-CoV-2 très sensible qui ne nécessitait pas de fournitures de test à forte demande 4,5,6,7,8. Les objectifs étaient d’aider les laboratoires cliniques à augmenter leur capacité et à développer des processus flexibles pour faire face aux pénuries d’approvisionnement, tout en élaborant une stratégie de dépistage pour établir un plan de retour au travail pour le MSU College of Human Medicine. Les efforts initiaux se sont concentrés sur des méthodes alternatives de collecte, d’extraction et de quantification du SRAS-CoV-2. La forte demande et les pénuries subséquentes d’écouvillons nasopharyngés ont conduit à l’évaluation d’échantillons de narines antérieures prélevés avec des écouvillons buccaux, et les pénuries de réactifs ont entraîné la mise au point d’une méthode d’extraction d’échantillons adaptée des premiers rapports de Wuhan, en Chine⁹. Afin d’augmenter la sensibilité pour la détection du SRAS-CoV-2 dans les échantillons de narines antérieures, la PCR numérique en gouttelettes a été substituée à la RT-qPCR ^6,7. Bien que la PCR numérique en gouttelettes soit très sensible et puisse fournir des valeurs absolues avec une lecture du point final, il a été déterminé que son utilisation n’était pas réalisable pour des tests à grande échelle en raison du manque d’instruments fiables à haut débit pour la technologie. De plus, l’auto-collecte d’échantillons de narines antérieures en fonction des niveaux de RNase P humaine était extrêmement variable, ce qui suggère qu’elle n’était pas suffisamment fiable pour un test de masse.

Une alternative aux écouvillons nasopharyngés et antérieurs est le prélèvement de salive. Historiquement, les virus respiratoires tels que le SRAS-CoV, le H1N1 et le MERS étaient tous détectés dans la salive 10,11,12,13. Cela s’est avéré vrai par la suite pour le SARS-CoV-2 14,15,16,17. La comparaison directe entre les échantillons de salive et de nasopharynx a montré que la salive produit des titres viraux plus élevés que les écouvillons nasopharyngés dans les échantillons appariés, et que la salive est moins variable avec des prélèvements répétés^{d’échantillons 14}. La salive s’est également révélée plus sensible dans certains variants, tels qu’Omicron, par rapport au Delta¹⁶. Les avantages supplémentaires de la collecte de salive sont la facilité relative de l’auto-prélèvement hors site sans approvisionnement en forte demande, la possibilité de retester l’échantillon à plusieurs reprises si nécessaire, l’élimination des exigences en matière de personnel sur place pour la collecte des échantillons et l’évitement des files d’attente des participants, ce qui pourrait augmenter le risque de transmission virale. Le kit de salive assemblé en laboratoire a été développé en collaboration entre les développeurs de tests de laboratoire, les experts de l’école d’emballage, les experts en image de marque des universités, les responsables de la sécurité et les partenaires de fabrication externes qui ont produit la boîte et le système d’étiquetage.

Alors que les échantillons de salive offrent un matériel de départ génétique abondant et que la RT-qPCR fournit des résultats sensibles et fiables, le coût des réactifs (amorce/sondes et mélange maître) a fait de l’analyse à grande échelle d’échantillons individuels une entreprise coûteuse sur une base individuelle, par échantillon. Étant donné que l’amorce/les sondes et le mélange maître sont les composants les plus coûteux du processus, l’objectif était de rechercher des solutions qui étendraient leur utilisation et réduiraient ainsi le coût par échantillon. L’optimisation systématique de la taille du pool d’échantillons en fonction de l’incidence dans la communauté et de la sensibilité du test a été proposée pour le test SARS-CoV-2¹⁸. Cependant, lorsque des flaques de n’importe quelle taille indiquent la présence du SRAS-CoV-2, tous les participants du bassin doivent être testés à nouveau, ce qui entraîne une perte de temps et une augmentation des possibilités de propagation. Pour remédier à ces limites, une méthode de regroupement bidimensionnel a été utilisée, comme le processus proposé par Zilinskas et d’autres¹⁹ pour effectuer un premier passage sous les restrictions des tests de surveillance. Dans ce processus, 96 échantillons individuels sont placés dans une plaque de 96 puits composée de 12 colonnes et de huit rangées. Chaque échantillon est inclus dans un pool de huit et un pool de 12 sur deux plaques de réaction différentes. Ainsi, chaque échantillon est représenté de manière unique dans les deux groupes. La déconvolution des bassins basée sur les coordonnées identifie les échantillons potentiellement positifs. Les échantillons dans les pools où le SRAS-CoV-2 n’a pas été détecté ne passent pas des tests de surveillance au dépistage. Pendant ce temps, les échantillons des personnes testées positives dans le cadre du processus de surveillance sont réextraits par le biais d’un processus de dépistage approuvé par la CLIA. S’ils sont confirmés positifs, les personnes reçoivent leur résultat, sont dirigées vers le cabinet du médecin de l’université, la recherche des contacts est amorcée et le service de santé est informé. Au total, l’échantillon d’un individu est testé lors de trois réactions distinctes avant d’être déclaré positif, deux fois dans des pools de surveillance et une fois en tant que dépistage de confirmation unique, ce qui réduit les risques de faux positif. Le regroupement d’échantillons utilise ~80 % moins de réactifs que l’analyse des échantillons individuellement, ce qui entraîne un coût de ~12 $ par échantillon.

Au-delà du kit de salive, de la stratégie de mutualisation et du processus de développement des tests, l’équipe a également élaboré un plan logistique pour la distribution des kits, la collecte des échantillons et la communication des résultats. Les participants au programme récupèrent leur trousse, enregistrent le code alphanumérique unique sur leur tube, produisent leur échantillon et le déposent dans l’un des nombreux bacs de dépôt où ils sont ramassés quotidiennement et transportés au laboratoire. Le laboratoire traite les échantillons, le superviseur technique examine et télécharge les résultats, et les participants sont invités à consulter le portail des résultats. Ce processus a un délai d’exécution de 24 à 48 h à partir du moment où un échantillon est déposé. La collaboration de toutes les parties de l’institution a été essentielle à la réussite de la mise en œuvre à grande échelle de ce processus hybride de surveillance et de dépistage. Les procédures et les descriptions suivantes du programme et de l’infrastructure de dépistage nécessaires sont conçues comme des plans sur la façon d’intensifier les tests à des fins de surveillance et/ou de dépistage futurs.

Protocole

Les études réalisées pour optimiser les méthodes du programme de détection précoce ont été approuvées par le Michigan State University Institutional Review Board. Toutes les figures ont été reproduites à l’aide d’échantillons artificiels et sont représentatives des résultats observés chez l’homme. Aucune donnée, information ou résultat présenté dans le manuscrit ne provient d’un participant au programme de détection précoce de l’Université d’État du Michigan.

1. Production de kits

REMARQUE : Lors de l’assemblage du kit, portez des masques, des gants, des lunettes de protection et des blouses de laboratoire à tout moment pour éviter de contaminer les composants du kit.

1. Préparation des composants du kit
   1. À l’aide d’un marqueur permanent, tracez une ligne indiquant 1 mL sur le tube conique de 25 mL. À l’aide d’un marqueur permanent, tracer une ligne indiquant 1 mL sur la pipette de transfert.
   2. Ajoutez quatre billes de céramique dans le tube d’échantillon de 5 ml. Pipeter 1 mL de solution de stabilisation de l’ARN dans le tube d’échantillon et fermer le tube. Fixez un autocollant d’haltères composé d’un code d’identification unique sur le tube d’échantillonnage avec le code-barres Datamatrix sur le dessus et l’identifiant répété en code alphanumérique sur le côté.
      REMARQUE : Les billes de céramique sont sans RNase/DNase et n’ont pas besoin d’être stérilisées davantage.
2. Placez un tube conique de 25 ml, un tube d’échantillon de 5 ml, une pipette de transfert et un petit sac à risque biologique dans la boîte de la trousse (figure supplémentaire 1).
   REMARQUE : Les tubes coniques n’ont pas besoin d’être exempts de DNase/RNase. L’intégrité de l’échantillon est préservée par la solution de stabilisation de l’ARN.

2. Utilisation du kit pour l’auto-prélèvement d’échantillons

1. Conformément aux instructions de la trousse, demandez aux participants de ne pas manger ou boire 30 minutes avant de fournir un échantillon. Demandez aux participants de cracher dans le tube conique de 25 ml jusqu’à ce que 1 ml de salive soit recueilli (ligne marquée).
2. À l’aide de la pipette, transférez 1 mL de salive (jusqu’à la ligne marquée) dans le tube d’échantillon de 5 mL contenant la solution de stabilisation de l’ARN et les billes de céramique. Fermez et secouez le tube d’échantillon pendant 15 s.
3. Demandez aux participants d’enregistrer le code alphanumérique attribué à l’échantillon sur le site Web désigné. Une fois cela fait, demandez-leur de placer le tube d’échantillon dans un petit sac à risque biologique et de le déposer dans un bac de collecte.

3. Prélèvement et préparation de l’échantillon pour l’isolement de l’ARN

REMARQUE : Toutes les étapes se déroulent dans une enceinte de biosécurité ou un seau à centrifugeuse avec un couvercle de bioconfinement.

1. Désinfectez et inspectez visuellement les échantillons pour le contrôle de la qualité alors qu’ils sont encore dans le sac à risque biologique.
2. Rejeter l’échantillon si (figure 1) : l’échantillon est de couleur non naturelle (c.-à-d. vert, bleu) ou contient des particules de nourriture ou du sang ; l’échantillon fuit ou manque des billes ; le volume prévu de l’échantillon est incorrect (<1,5 mL ou >3 mL) ; L’échantillon n’est pas associé à un code-barres ou à un code alphanumérique.
   1. Si l’échantillon est rejeté, numérisez et enregistrez-le dans un fichier de rejet avec une note expliquant pourquoi l’échantillon a été rejeté. Si l’échantillon est rejeté parce qu’il n’a pas d’identificateurs, consignez l’échantillon comme Aucun code-barres dans le fichier de rejet.
3. Si l’échantillon n’est pas rejeté, ouvrez le sac à risque biologique avec des ciseaux et retirez le tube d’échantillon. Faites tourbillonner le tube pendant 15 s, puis placez le tube d’échantillon dans un adaptateur de tube pour une centrifugeuse à godet oscillant.
4. Une fois les adaptateurs de tube pleins, fixez le couvercle de bioconfinement sur le godet de la centrifugeuse et transférez-le dans la centrifugeuse. Centrifuger les échantillons à 4 100 x g pendant 2 minutes et les renvoyer dans l’enceinte de sécurité biologique.
   REMARQUE : La centrifugation est utilisée pour granuler les débris et forcer plus de matériau visqueux dans la salive au fond du tube. Cela élimine le besoin de protéinase K dans le processus. Une série complète comprend 768 échantillons (huit plaques de 96 puits remplies d’échantillons après isolement de l’ARN).
5. Sans perturber le matériau granulé, transférez les tubes d’échantillon dans un support de tubes à 96 fentes pré-étiqueté avec l’ID de passage qui comprend le numéro de rack (1-8), la date et le groupe correspondant avec lequel les échantillons seront regroupés/évalués (un identificateur pour indiquer le groupe, c’est-à-dire que le groupe A est le premier cycle de la journée).
6. Lorsque les portoirs de tubes à 96 fentes sont pleins ou qu’il ne reste plus d’échantillons, à l’aide d’un lecteur de codes-barres portable, numérisez les tubes dans un fichier de carte de plaque (Fichier supplémentaire 1 pour les piscines pleines ; Fichier supplémentaire 2 pour les piscines de taille moyenne). Dans le cas où un code-barres ne fonctionne pas, utilisez le code alphanumérique sur le tube pour enregistrer l’échantillon.
   REMARQUE : Un masque est requis pour empêcher la lecture des codes-barres adjacents. Un masque peut être fabriqué en découpant un trou dans du papier opaque, puis en le plastifiant. Les codes-barres numérisés dans le fichier de carte de plaque apparaîtront dans le même sens que dans le rack à 96 emplacements.
7. Vaporisez les tubes d’échantillon dans le support avec de l’éthanol à 70 % et séchez-les avec une serviette en papier.
   REMARQUE : Essuyer les tubes au lieu de tamponner peut endommager les codes-barres.
8. Étiquetez une plaque à 96 puits profonds d’une capacité de 2 mL avec l’ID d’exécution. Transférez 200 μL d’échantillon de salive de chaque tube d’échantillon dans le puits correspondant de la plaque à 96 puits profonds. Si les échantillons sont trop visqueux pour être transférés, faites un vortex et centrifugez-les à nouveau. Rejeter l’échantillon si le problème persiste.
   REMARQUE : Les échantillons de salive peuvent être filandreux et laisser une traînée d’escargot sur la plaque pendant le transfert si le technicien ne fait pas attention. Cela peut conduire à des faux positifs initiaux et à d’autres échantillons qui devront éventuellement être réanalysés lors de l’étape de confirmation (voir section 6).
9. Lorsque tous les échantillons sont transférés, couvrez la plaque à 96 puits profonds avec un tapis en silicone et conservez-la à température ambiante. Conservez et stockez les étagères à 96 emplacements avec les échantillons restants pour la confirmation des échantillons potentiellement positifs.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

4. Isolement de l’ARN

1. Étiquetez une cartouche d’isolement d’ARN à 96 puits avec l’ID de course et placez-la sur une plaque de collecte vide.
   REMARQUE : Les plaques contenant des échantillons peuvent être retirées de l’enceinte de sécurité biologique à ce stade.
2. Retirez le tapis en silicone de la plaque à 96 puits profonds. Transférez 400 μL de tampon de charge virale dans chaque puits de la plaque à 96 puits profonds.
3. Mélangez chaque échantillon en pipetant doucement de haut en bas deux à quatre fois et transférez l’échantillon entier dans la colonne correspondante de la cartouche d’isolement d’ARN à 96 puits.
   REMARQUE : Le mélange de grands volumes créera des bulles qui peuvent entraîner la contamination des puits voisins s’il est effectué au hasard. Le mélange délibéré peut réduire ce risque et protéger l’intégrité du traitement en aval.
4. Centrifuger la cartouche d’isolement d’ARN sur le dessus de la plaque de collecte à 4 100 x g pendant 10 min pour charger les échantillons sur la cartouche. Transférez la cartouche d’isolement de l’ARN dans une plaque de collecte propre.
5. Ajouter 500 μL de tampon de lavage dans chaque puits de la cartouche d’isolement d’ARN et centrifuger à 4 100 x g pendant 5 min. Transférez la cartouche d’isolement de l’ARN sur une plaque de collecte propre.
6. Ajouter 500 μL de tampon de lavage dans chaque puits de la cartouche d’isolement d’ARN et centrifuger à 4 100 x g pendant 5 min. Transférez la cartouche d’isolement de l’ARN sur une plaque de collecte propre.
7. Ajouter 500 μL d’éthanol à 100 % dans chaque puits de la cartouche d’isolement d’ARN et centrifuger à 4 100 x g pendant 5 min. Transférez la cartouche d’isolement de l’ARN sur une plaque de collecte propre.
   REMARQUE : Si l’échantillon n’a pas complètement traversé la colonne à ce stade, l’échantillon est trop visqueux ou de petits débris dans l’échantillon obstruent la colonne. L’échantillon doit être complètement retiré de la cartouche afin de ne pas contaminer le processus de regroupement en aval, et le numéro de l’échantillon doit être ajouté au fichier de rejet.
8. Centrifuger la cartouche d’isolement d’ARN sur le dessus de la plaque de collecte à 4 100 x g pendant 5 min pour sécher les colonnes. Transférez la cartouche d’isolement de l’ARN sur une plaque d’élution propre étiquetée avec l’ID de l’exécution et la rangée de mots, puis placez-la sur une plaque de collecte propre.
9. Ajouter 25 μL d’eau de qualité moléculaire exempte de DNase/RNase dans chaque puits de la cartouche d’isolement d’ARN. Centrifuger à 4 100 x g pendant 10 min pour éluer l’ARN. Si l’échantillon n’élue pas complètement, il faut le centrifuger à nouveau pendant 5 minutes.
10. Transférez les plaques d’élution sur des plaques froides pré-refroidies et couvrez. Passez immédiatement à la mise en commun des échantillons et à la RT-qPCR.

5. Regroupement d’échantillons et RT-qPCR

REMARQUE : Le processus est configuré dans un système à deux plaques (comme le montre la figure 2). Le numéro de la plaque d’ARN d’élution correspond au numéro de la plaque de colonne produite et à la lettre de la plaque de ligne (A = 1, B = 2, C = 3, etc.). À des fins de déconvolution, la lettre de ligne de la plaque de colonne correspondra à la lettre de ligne de la plaque d’élution d’ARN, et le numéro de colonne de la plaque de ligne correspondra au numéro de colonne de la plaque d’élution d’ARN. Par exemple, un échantillon dans la plaque d’ARN #6 en position C4 se trouvera dans la position de la plaque de réaction de ligne F4 et dans la position de plaque de réaction de la colonne C6.

1. Étiquetez une nouvelle plaque d’élution avec l’ID de l’exécution et le mot rangée, et placez-la sur une plaque froide pré-refroidie. Transférez 10 μL d’ARN de chaque puits de la plaque d’élution de la rangée vers la rangée correspondante de la plaque d’élution de la colonne, faisant ainsi une copie de la plaque d’élution d’origine (figure 2).
   REMARQUE : Les plaques d’élution marquées de la colonne seront regroupées dans le sens de la colonne et les plaques d’élution marquées de la rangée seront regroupées dans le sens de la rangée.
2. Pour la plaque regroupée en colonnes, transférez la totalité du volume de chaque puits à travers la plaque dans le numéro de colonne qui correspond au numéro de plaque ID de l’exécution. Pour la plaque regroupée en rangées, transférez tout le volume de chaque puits vers le haut ou vers le bas de la plaque jusqu’au numéro de ligne qui correspond au numéro de plaque ID de la série (1 = A, 2 = B, etc. ; Figure 2).
3. Transférez 13 μL de chaque échantillon groupé dans la colonne ou la rangée correspondante d’une plaque réactionnelle à 96 puits (figure 2).
4. Pour ce protocole, utilisez trois sondes contre les gènes de la nucléocapside (N), de l’ORF1ab et de la pointe (S) pour détecter le SRAS-CoV-2, et une quatrième sonde d’amorce ciblant le phage MS2 comme contrôle interne. Dans les échantillons groupés, ajoutez un contrôle positif de phage MS2 dans le mixage maître. Dans les échantillons analysés individuellement, ajoutez du phage MS2 dans l’échantillon sur la cartouche d’isolement de l’ARN et utilisez-le comme contrôle d’extraction.
   REMARQUE : Le mélange maître, les sondes d’amorce, les colorants fluorescents et les trempants varieront en fonction du dosage. Les rapports et les canaux fluorescents appropriés doivent être déterminés par chaque laboratoire.
5. Préparez le témoin positif en ajoutant 2 μL de solution de témoin positif et 11 μL d’eau de qualité moléculaire exempte de DNase/RNase dans le puits de témoin positif sur la plaque réactionnelle (figure 2).
6. Préparez le témoin sans matrice en ajoutant 13 μL d’eau de qualité moléculaire exempte de DNase/RNase dans le puits de contrôle négatif sur la plaque de réaction.
7. Préparez le mélange maître selon les instructions du fabricant et augmentez le pic de contrôle positif des phages MS2. Distribuez 7 μL de mélange maître dans chaque puits des plaques de réaction à 96 puits qui contiennent des échantillons ou des témoins. Limitez l’exposition à la lumière fluorescente.
8. Couvrir les plaques de réaction avec un film optique et un vortex pendant 2 min pour bien mélanger les échantillons. Plaques de réaction de la centrifugeuse à 650 x g pendant 5 min.
9. Transférez les plaques dans le système RT-PCR et faites-les fonctionner avec des paramètres de cyclage appropriés pour le mixage principal. Pour le mélange maître utilisé ici, les cycles suivants ont été exécutés : 25 °C pendant 2 min, 53 °C pendant 10 min, 95 °C pendant 2 min, 40 cycles de 95 °C pendant 3 s et 60 °C pendant 30 s.
10. Une fois les échantillons exécutés, effectuez une déconvolution des pools pour identifier les échantillons positifs potentiels manuellement (Figure 3) et via une application R Script Shiny.
    1. Exportez les résultats des plaques de réaction de colonnes et de lignes sous forme de tableurs. Ouvrez l’application R script Shiny (code source disponible à l’adresse : https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP).
    2. Faites glisser et déposez les fichiers de carte, de colonne et de ligne de plaque dans l’application et exécutez l’application. Enregistrez la liste produite à partir de l’application.
       REMARQUE : La liste produite à partir de l’application contient tous les codes-barres saisis dans la carte des plaques et indique s’ils sont probablement positifs ou négatifs en fonction du script de déconvolution du pool. Ces échantillons qui sont signalés comme potentiellement positifs sont retraités individuellement.

6. Validation des échantillons positifs

1. Étiquetez deux tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et une colonne d’extraction d’ARN pour chaque échantillon à analyser. Utilisez un tube de microcentrifugation pour mélanger l’échantillon, le phage MS2 et le tampon de charge virale, et le deuxième tube de microcentrifugation pour l’étape d’élution de l’ARN.
2. Ajoutez 5 μL d’ARN du phage MS2 dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Transférez 200 μL de l’échantillon potentiellement positif dans le tube et ajoutez 400 μL de tampon de charge virale dans le tube, mélangez par pipetage.
3. Transférez tout le contenu dans la colonne d’extraction d’ARN pré-étiquetée dans un tube de collecte propre. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 2 min. Écoulement aspiré à partir du tube de collecte.
4. Ajouter 500 μL de tampon de lavage dans la colonne d’extraction d’ARN et centrifuger à 10 000 x g pendant 2 min. Écoulement aspiré à partir du tube de collecte.
5. Ajouter 500 μL de tampon de lavage dans la colonne d’extraction d’ARN et centrifuger à 10 000 x g pendant 2 min. Écoulement aspiré à partir du tube de collecte.
6. Ajouter 500 μL d’éthanol à 100 % dans la colonne d’extraction d’ARN et centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min. Transférez la colonne d’extraction d’ARN dans un tube de collecte propre et centrifugez à 10 000 x g pendant 1 min pour sécher la colonne.
7. Transférez la colonne d’extraction de l’ARN dans un tube de microcentrifugation pré-étiqueté de 1,5 mL pour l’élution. Ajoutez 25 μL d’eau de qualité moléculaire exempte de DNase/RNase dans la colonne d’extraction d’ARN. Centrifuger à 10 000 x g pendant 2 min pour recueillir l’ARN et transférer le tube sur de la glace humide.
8. Préparez un mélange maître selon les instructions du fabricant. Versez 7 μL de mélange maître dans chaque puits d’une plaque de réaction à 96 puits qui contiendra l’échantillon. Transférez 13 μL de chaque ARN isolé dans la plaque réactionnelle.
   REMARQUE : Le mélange principal est le même que celui utilisé dans le protocole d’échantillonnage groupé, mais n’inclut pas le spicule d’ARN du phage MS2.
9. Préparez le témoin positif en ajoutant 2 μL de solution de témoin positif et 11 μL d’eau de qualité moléculaire exempte de DNase/RNase dans le puits de témoin positif sur la plaque de réaction. Préparez le témoin sans matrice en ajoutant 13 μL d’eau de qualité moléculaire exempte de DNase/RNase dans le puits de contrôle négatif sur la plaque de réaction.
10. Couvrez les plaques de réaction avec un film optique et un vortex pendant 2 min pour bien mélanger les échantillons. Plaques de réaction de la centrifugeuse à 650 x g pendant 5 min. Transférez les plaques dans le système RT-PCR et faites-les fonctionner avec des paramètres de cyclage appropriés pour le mixage principal.
    1. Pour le mixage principal indiqué ici, utilisez 25 °C pendant 2 min, 53 °C pendant 10 min, 95 °C pendant 2 min, 40 cycles de 95 °C pendant 3 s et 60 °C pendant 30 s.

Résultats

La grande majorité des échantillons reçus par le laboratoire à ce jour ont été acceptés et ont passé l’étape initiale de contrôle visuel de la qualité. La nécessité de rejeter un échantillon est limitée aux raisons qui peuvent influencer négativement le traitement de l’échantillon et/ou les résultats globaux de l’échantillon. Plus précisément, un volume incorrect dans le tube, une consistance ou une couleur non naturelle à la salive, l’absence de billes de c...

Discussion

Lors du traitement des échantillons, il y a des étapes qui nécessitent une attention particulière. L’étape initiale de contrôle de la qualité, qui porte sur le volume de l’échantillon, la consistance, la couleur et la présence de billes ajoutées, est essentielle au succès global du processus. Les tubes contenant des échantillons qui ne contiennent pas la bonne quantité de salive pourraient produire un faux négatif, car trop peu de salive entraînerait un manque de maté...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Step MM, no ROX	Thermo Fisher	A28523
1.2 mlDeep well Plates	Fisher	AB0564
100 mL reagent reservoirs	Corning	4872
2.8 mm Ceramic Beads	OMNI	19-646
25 ml conical w/screw cap	VWR	76338-496
50mL V bottom reservoirs	Costar	4870
5430-High-Speed Centrifuge	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf Tube	Fisher	14282300
8 strip tubes for QuantStudio	life technologies	4316567
Beta Mercaptoethanol	Fisher	AC125472500
Ethanol 200 Proof, Molecular Biology Grade	Fisher	BP28184
Microamp Endura Optical 96-well fast clear reaction plate with barcode	life technologies	4483485
Microamp Fast Optical 96 well plate	Fisher	4346906
Mini Microcentrifuge	Corning Medical	6770
optical caps for strip tubes	life technologies	AB-1820
Optical Film	Thermo Fisher	4311971
PCR plate sealing film Non-optical	Fisher	AB-0558
PCR Plate semi-skirted	Fisher	14230244
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
Quick RNA Viral Kit confirmation	Zymo	R1035
Reagent Reservoir, 100ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
Small Biohazard Bags	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19 kit	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrifuge	Thermo Fisher	75009525
Transfer Pipet	Fisher	22170404
Viral 96 Kit	Zymo	R1041
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