타액 및 전치 검체 풀링을 활용한 대규모 SARS-CoV-2 테스트

요약

이 프로토콜은 SARS-CoV-2에 대한 대규모 테스트를 고려하거나 향후 바이러스 발병에 대한 대비 계획을 개발하는 대학 및 기타 조직에 청사진 역할을 하기 위한 것입니다.

초록

밀접 접촉자에 대한 격리와 함께 전염병에 감염된 개인의 식별 및 격리는 COVID-19의 확산을 늦추는 데 매우 중요합니다. 무증상 COVID-19 보균자에 대한 감시 또는 선별 역량의 대규모 검사는 바이러스 확산에 대한 데이터와 의심되는 발병 시 개인을 신속하게 검사할 수 있는 후속 능력을 모두 제공합니다. Michigan State University의 COVID-19 조기 발견 프로그램은 2020년 가을부터 감시 또는 선별 역량에서 대규모 테스트를 활용하고 있습니다. 여기에 적용된 방법은 타액의 신뢰성, 많은 시료 부피 및 자가 채취 이점을 활용하며, 비용 효율적인 시약 보존 2차원 풀링 체계와 짝을 이룹니다. 이 공정은 공급 부족에 적응할 수 있도록 설계되었으며, 키트와 분석의 많은 구성 요소를 쉽게 대체할 수 있습니다. SARS-CoV-2 검체를 채취하고 처리하기 위해 설명된 프로세스는 타액에서 안정적으로 발현되는 미래의 바이러스 병원체를 테스트하도록 조정할 수 있습니다. 대학이나 기타 조직에 이 청사진을 제공함으로써 향후 바이러스 발병에 대한 대비 계획을 수립할 수 있습니다.

서문

SARS-CoV-2 바이러스로 인한 COVID-19 대유행으로 인해 현재까지 620만 명 이상이 사망했으며 그 수는 매일 증가하고 있습니다¹. SARS-CoV-2 검사의 황금 표준은 정량적 실시간(RT-q) PCR이며, 뉴클레오캡시드, 외피, 스파이크 및 RNA 의존성 RNA 중합효소 유전자²와 같은 바이러스 게놈을 표적으로 하도록 설계된 프라이머를 사용합니다. 팬데믹 초기에는 SARS-CoV-2 검사를 위한 충분한 용량이 심각하게 부족했습니다. 이는 검증된 분석법, 테스트 구성 요소, 임상 인력의 부족과 팬데믹 수준의 대량 테스트를 수용하기 위해 빠르게 확장할 준비가 되지 않은 인프라에서 비롯되었습니다. 부족으로 인해 검사 센터에서는 종종 검사 자격을 갖추기 위해 의사의 추천서를 요구했습니다. 이러한 부족으로 인해 검사 승인이 지연되고, 불편한 비인두 검체 채취를 위한 긴 줄이 늘어서고, 결과를 기다리는 시간이 길어졌습니다. 또한 이러한 제약으로 인해 검사 노력은 자신도 모르게 SARS-CoV-2를 퍼뜨리는 사전 증상, 경증 또는 무증상 보균자를 수용할 수 없었습니다. 쉽게 접근할 수 있고 광범위한 검사가 이루어지지 않은 것이 COVID-19의 통제되지 않은 확산에 기여했을 가능성이 높습니다.

대규모 간격 테스트는 감시 또는 스크리닝으로 수행할 수 있습니다. 둘 다 고밀도 또는 고위험 전염 지역에서 지역 양성률을 모니터링하는 데 사용할 수 있으며 공중 보건 결정을 내리는 데 사용할 수 있습니다. 감시 검사는 인구 집단의 질병 발병률과 유병률을 모니터링하기 위한 것으로, 개별 진단에는 사용되지 않는다³. 감시 결과는 일반적으로 비식별화되어 참가자에게 반환되지 않습니다. 감시 검사를 수행하는 실험실은 임상 인증을 받을 필요가 없으며 FDA 승인 분석을 사용할 필요도 없습니다. 스크리닝을 통해 개별 참가자에게 결과를 반환할 수 있지만, 미국 내 스크리닝 실험실은 CLIA(Clinical Laboratory Improvement Amendments) 인증서를 보유하고 있어야 하며 적용 가능한 모든 CLIA 요구 사항을 충족해야 합니다.

미시간 주립대학교(MSU)의 조기 발견 프로그램은 2020년 9월에 시작되어 350,000개 이상의 샘플을 처리했습니다. 이 프로그램은 수요가 많은 테스트 용품 ^4,5,6,7,8이 필요하지 않은 고감도 SARS-CoV-2 분석을 설계하려는 연구 그룹의 노력에서 비롯되었습니다. 목표는 임상 실험실의 용량을 늘리고 공급 부족을 수용할 수 있는 유연한 프로세스를 개발하는 동시에 MSU 인간 의과 대학의 업무 복귀 계획을 수립하기 위한 스크리닝 전략을 개발하는 것이었습니다. 초기 노력은 SARS-CoV-2에 대한 대체 수집, 추출 및 정량 분석에 중점을 두었습니다. 비인두 면봉에 대한 높은 수요와 그에 따른 부족으로 인해 구강 면봉으로 수집한 전두엽 검체를 평가할 수 있게 되었고, 시약 부족으로 인해 중국 우한에서 발굴된 초기 보고서에서 채택한 검체 추출 방법이 개발되었습니다⁹. 전방 콧구멍 샘플에서 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 민감도를 높이기 위해 RT-qPCR ^6,7 대신 액적 디지털 PCR을 대체했습니다. 액적 디지털 PCR은 매우 민감하고 종말점 판독값으로 절대값을 제공할 수 있지만, 이 기술에 대한 신뢰할 수 있는 고처리량 기기가 부족하기 때문에 대규모 테스트에는 사용이 적합하지 않은 것으로 확인되었습니다. 또한 인간 RNase P 수준에 따른 전방 콧구멍 샘플의 자가 수집은 매우 가변적이었으며, 이는 대량 테스트에 충분히 신뢰할 수 없음을 시사합니다.

비인두 및 전방 콧구멍 면봉의 대안은 타액 수집입니다. SARS-CoV, H1N1 및 MERS와 같은 호흡기 바이러스는 모두 역사적으로 타액에서 검출되었습니다 ^10,11,12,13. 이는 이후 SARS-CoV-2 ^14,15,16,17에 대해 사실로 입증되었습니다. 타액과 비인두 검체를 직접 비교한 결과, 일치하는 검체에서 타액이 비인두 면봉보다 더 높은 바이러스 역가를 산출하는 것으로 나타났으며, 타액은 반복적인 검체 채취에 따라 변동성이 덜한 것으로 나타났습니다¹⁴. 타액은 또한 델타¹⁶에 비해 오미크론과 같은 특정 변이에서 더 민감한 것으로 보고되었습니다. 타액 채취에 대한 또 다른 이점은 수요가 많은 공급품 없이 현장 밖에서 자체 채취가 상대적으로 용이하고, 필요한 경우 검체를 반복적으로 재검사할 수 있으며, 검체 채취를 위한 현장 인력 요구 사항이 제거되고, 바이러스 전파 가능성을 높일 수 있는 참가자 대기열을 피할 수 있다는 것입니다. 실험실에서 조립한 타액 키트는 실험실 분석 개발자, 포장 대학의 전문가, 대학 브랜딩 전문가, 안전 책임자 및 상자 및 라벨링 시스템을 생산한 외부 제조 파트너 간의 협업으로 개발되었습니다.

타액 검체는 충분한 유전자 시작 물질을 제공하고 RT-qPCR은 민감하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공하지만, 시약(프라이머/프로브 및 마스터 믹스)의 비용으로 인해 개별 검체에 대한 대규모 검사는 검체당 개별적으로 비용이 많이 드는 노력이 필요했습니다. 프라이머/프로브 및 마스터 믹스는 공정에서 가장 비싼 구성 요소이기 때문에 용도를 확대하여 샘플당 비용을 절감할 수 있는 솔루션을 찾는 것이 목표였습니다. SARS-CoV-2 검사를 위해 지역사회 및 분석 민감도에 따라 샘플 풀 크기를 체계적으로 최적화하는 것이 제안되었습니다¹⁸. 그러나 모든 크기의 풀에서 SARS-CoV-2의 존재가 나타나면 풀의 모든 참가자를 다시 검사해야 하므로 시간이 낭비되고 확산 가능성이 높아집니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, Zilinskas 등이 제안한 프로세스와 같은 2차원 풀링 방법이 사용되었다.¹⁹ 감시 테스트의 제한 하에서 첫 번째 패스를 수행하기 위해. 이 과정에서 96개의 개별 샘플이 12개의 열과 8개의 행으로 구성된 96웰 플레이트에 배치됩니다. 각 샘플은 두 개의 서로 다른 반응 플레이트에 8개의 풀과 12개의 풀에 포함됩니다. 그 결과 모든 샘플이 두 풀로 고유하게 표시됩니다. 좌표를 기반으로 한 풀의 디콘볼루션은 잠재적으로 긍정적인 샘플을 식별합니다. SARS-CoV-2가 검출되지 않은 풀의 샘플은 감시 테스트에서 스크리닝으로 이동하지 않습니다. 한편, 감시 과정에서 양성 판정을 받은 개인의 샘플은 CLIA가 승인한 선별 과정을 통해 다시 추출됩니다. 양성으로 확인되면 개인에게 결과를 제공하고, 대학 의사 사무실에 의뢰하고, 접촉 추적이 시작되고, 보건부에 통보됩니다. 전체적으로 개인의 샘플은 양성으로 선언되기 전에 세 번의 개별 반응으로 테스트되며, 감시 풀에서 두 번, 한 번의 확인 검사로 한 번씩 테스트되어 위양성 가능성을 줄입니다. 샘플 풀링은 샘플을 개별적으로 실행하는 것보다 ~80% 적은 시약을 사용하므로 샘플당 ~$12의 비용이 듭니다.

타액 키트, 풀링 전략 및 분석 개발 프로세스 외에도 팀은 키트 배포, 샘플 수집 및 결과 보고를 위한 물류 계획도 개발했습니다. 프로그램 참가자는 키트를 픽업하고, 튜브에 고유한 영숫자 코드를 등록하고, 샘플을 생산하고, 매일 픽업하여 실험실로 운송하는 많은 수거함 중 하나에 보관합니다. 실험실은 샘플을 처리하고, 기술 감독자는 결과를 검토 및 업로드하며, 참가자는 결과 포털을 확인하도록 알림을 받습니다. 이 공정의 처리 시간은 샘플이 입금된 시점부터 24-48시간입니다. 기관의 모든 부서와의 협력은 이 하이브리드 감시 및 스크리닝 프로세스의 성공적인 대규모 구현에 핵심이었습니다. 필요한 테스트 프로그램 및 인프라에 대한 다음 절차와 설명은 향후 감시 및/또는 스크리닝 목적을 위해 테스트를 확장하는 방법에 대한 청사진으로 사용됩니다.

프로토콜

조기 발견 프로그램의 방법을 최적화하기 위해 수행된 연구는 Michigan State University Institutional Review Board의 승인을 받았습니다. 모든 수치는 인위적인 샘플로 재현되었으며 관찰된 인간 결과를 나타냅니다. 원고에 표시된 데이터, 정보 또는 결과는 Michigan State University Early Detection Program의 참가자로부터 얻은 것이 아닙니다.

1. 키트 생산

알림: 키트를 조립하는 동안 키트 구성 요소 오염을 방지하기 위해 항상 마스크, 장갑, 보안경 및 실험실 가운을 착용하십시오.

1. 키트 구성 요소의 준비
   1. 영구 마커를 사용하여 25mL 원추형 튜브에 1mL를 나타내는 선을 그립니다. 영구 마커를 사용하여 전사 피펫에 1mL를 나타내는 선을 그립니다.
   2. 5mL 샘플 튜브에 세라믹 비드 4개를 추가합니다. RNA 안정화 용액 1mL를 시료 튜브에 피펫으로 주입하고 튜브를 닫습니다. 샘플 튜브에 고유 식별 코드로 구성된 바벨 스티커를 부착하고 상단에는 데이터 매트릭스 바코드가 있고 측면에는 영숫자 코드로 반복되는 식별자가 있습니다.
      참고: 세라믹 비드는 RNase/DNase가 없으며 추가 멸균이 필요하지 않습니다.
2. 25mL 원뿔형 튜브, 5mL 샘플 튜브, 전사 피펫 및 작은 생물학적 위험 백을 키트 상자에 넣습니다(보충 그림 1).
   참고: 원추형 튜브는 DNase/RNase가 없을 필요가 없습니다. 샘플의 무결성은 RNA 안정화 용액에 의해 보존됩니다.

2. 자체 샘플 수집을 위한 키트 사용

1. 키트 지침에 따라 참가자에게 샘플을 제공하기 30분 전에 먹거나 마시지 않도록 요청하십시오. 참가자들에게 1mL의 타액이 수집될 때까지(표시된 선) 25mL 원뿔형 튜브에 침을 뱉도록 요청합니다.
2. 피펫을 사용하여 1mL의 타액(표시된 선까지)을 RNA 안정화 용액과 세라믹 비드가 들어 있는 5mL 샘플 튜브로 옮깁니다. 샘플 튜브를 닫고 15초 동안 흔듭니다.
3. 참가자들에게 샘플에 할당된 영숫자 코드를 지정된 웹사이트에 등록하도록 요청합니다. 완료되면 샘플 튜브를 작은 생물학적 위험 백에 넣고 수집 쓰레기통에 넣도록 요청하십시오.

3. RNA 분리를 위한 시료 주입 및 준비

참고: 모든 단계는 생물 격리 뚜껑이 있는 생물 안전 캐비닛 또는 원심분리기 버킷에서 이루어집니다.

1. 생물학적 위험 백에 있는 동안 품질 관리를 위해 샘플을 소독하고 육안으로 검사합니다.
2. 다음과 같은 경우 샘플을 거부하십시오 (그림 1) : 샘플이 자연적이지 않은 색 (예 : 녹색, 파란색)이거나 음식 입자 또는 혈액을 포함합니다. 샘플에서 비드가 누출되거나 누락되었습니다. 샘플의 예상 부피가 잘못되었습니다(<1.5mL 또는 >3mL). 샘플에 바코드 또는 영숫자 코드가 첨부되어 있지 않습니다.
   1. 샘플이 불합격된 경우, 샘플을 스캔하여 샘플이 불합격된 이유에 대한 메모와 함께 리젝트 파일에 기록합니다. 샘플에 식별자가 없어 샘플이 거부된 경우 거부 파일에 샘플을 바코드 없음으로 기록합니다.
3. 샘플이 거부되지 않으면 가위로 생물학적 위험 백을 자르고 샘플 튜브를 제거합니다. 튜브를 15초 동안 소용돌이친 다음 샘플 튜브를 스윙 버킷 원심분리기용 튜브 어댑터에 넣습니다.
4. 튜브 어댑터가 가득 차면 생물 봉쇄 뚜껑을 원심분리기 버킷 위에 고정하고 원심분리기로 옮깁니다. 4,100 x g 에서 2분 동안 시료를 원심분리하고 시료를 생물 안전 작업대에 다시 넣습니다.
   참고: 원심분리는 파편을 펠릿화하고 타액의 더 점성이 있는 물질을 튜브 바닥으로 밀어 넣는 데 사용됩니다. 따라서 공정에서 proteinase K가 필요하지 않습니다. 전체 실행은 768개의 샘플(RNA 분리 후 샘플로 가득 찬 8개의 96웰 플레이트)으로 구성됩니다.
5. 펠릿화된 물질을 방해하지 않고 시료 튜브를 랙 번호(1-8), 날짜 및 시료를 풀링/평가할 해당 그룹(그룹을 나타내는 식별자, 즉, 그룹 A가 오늘의 첫 번째 실행)이 포함된 Run ID가 사전 표시된 96슬롯 튜브 랙으로 옮깁니다.
6. 96슬롯 튜브 랙이 가득 찼거나 샘플이 남아 있지 않은 경우 휴대용 바코드 스캐너를 사용하여 튜브를 플레이트 맵 파일(전체 풀의 경우 보충 파일 1 ; 절반 크기 풀에 대한 보충 파일 2 ). 바코드가 작동하지 않는 경우 튜브의 영숫자 코드를 사용하여 샘플을 기록합니다.
   참고: 인접한 바코드가 스캔되지 않도록 마스크가 필요합니다. 마스크는 불투명한 종이에 구멍을 뚫은 다음 라미네이팅하여 만들 수 있습니다. 플레이트 맵 파일로 스캔된 바코드는 96슬롯 랙과 동일한 방향으로 나타납니다.
7. 랙의 샘플 튜브에 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 가볍게 말리십시오.
   참고: 두드리는 대신 튜브를 닦으면 바코드가 손상될 수 있습니다.
8. 2mL 웰 용량의 96-deep-well 플레이트에 Run ID로 라벨을 부착합니다. 각 샘플 튜브에서 200μL의 타액 샘플을 96-deep-well 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 샘플의 점성이 너무 높아 옮길 수 없는 경우 와류와 원심분리기를 다시 사용합니다. 문제가 계속되면 샘플을 거부하십시오.
   참고: 타액 샘플은 끈적끈적할 수 있으며 기술자가 주의하지 않으면 이송 중에 플레이트를 가로질러 달팽이 자국을 남길 수 있습니다. 이로 인해 초기 거짓 긍정이 발생하고 결국 확인 단계에서 다시 실행해야 하는 샘플이 더 많아질 수 있습니다(섹션 6 참조).
9. 모든 샘플이 옮겨지면 96-deep-well 플레이트를 실리콘 매트로 덮고 실온에서 보관하십시오. 96슬롯 랙을 나머지 샘플과 함께 저장하고 보관하여 잠재적으로 양성 샘플을 확인할 수 있습니다.
   참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

4. RNA 분리

1. 96웰 RNA 분리 카트리지에 Run ID를 부착하고 빈 수집 플레이트 위에 놓습니다.
   참고: 이 시점에서 샘플이 들어 있는 플레이트를 생물 안전 캐비닛에서 제거할 수 있습니다.
2. 96-deep-well 플레이트에서 실리콘 매트를 제거합니다. 400μL의 바이러스 로딩 버퍼를 96-deep-well 플레이트의 각 well로 전달합니다.
3. 2-4회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 각 샘플을 혼합하고 전체 샘플을 96웰 RNA 분리 카트리지의 해당 컬럼으로 옮깁니다.
   알림: 많은 양을 혼합하면 기포가 생성되어 무작정 수행할 경우 이웃 우물을 오염시킬 수 있습니다. 의도적인 방식으로 혼합하면 이러한 위험을 낮추고 다운스트림 처리의 무결성을 보호할 수 있습니다.
4. 수집 플레이트 상단의 RNA 분리 카트리지를 4,100 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 카트리지에 샘플을 로드합니다. RNA 분리 카트리지를 깨끗한 수집 플레이트로 옮깁니다.
5. RNA 분리 카트리지의 모든 웰에 500μL의 세척 완충액을 추가하고 4,100 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. RNA 분리 카트리지를 깨끗한 수집 플레이트로 옮깁니다.
6. RNA 분리 카트리지의 모든 웰에 500μL의 세척 완충액을 추가하고 4,100 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. RNA 분리 카트리지를 깨끗한 수집 플레이트로 옮깁니다.
7. RNA 분리 카트리지의 모든 웰에 500μL의 100% 에탄올을 추가하고 4,100 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. RNA 분리 카트리지를 깨끗한 수집 플레이트로 옮깁니다.
   참고: 이 시점에서 샘플이 컬럼을 완전히 통과하지 않은 경우 샘플의 점성이 너무 높거나 샘플의 작은 파편 조각이 컬럼을 막고 있는 것입니다. 다운스트림 풀링 프로세스를 오염시키지 않도록 카트리지에서 샘플을 완전히 제거해야 하며 샘플 번호를 리젝트 파일에 추가해야 합니다.
8. 수집 플레이트 상단의 RNA 분리 카트리지를 4,100 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 컬럼을 건조시킵니다. RNA 분리 카트리지를 Run ID와 word row라고 표시된 깨끗한 용리 플레이트에 옮긴 다음 깨끗한 수집 플레이트 위에 둘 다 놓습니다.
9. RNA 분리 카트리지의 각 웰에 25μL의 DNase/RNase-free 분자 등급 물을 추가합니다. 4,100 x g 에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 RNA를 용리합니다. 샘플이 완전히 용리되지 않으면 5분 동안 샘플을 다시 원심분리합니다.
10. 용출판을 미리 냉각된 냉각판에 옮기고 덮습니다. 즉시 시료 풀링 및 RT-qPCR로 진행합니다.

5. 시료 풀링 및 RT-qPCR

알림: 이 프로세스는 2플레이트 시스템으로 설정됩니다( 그림 2 참조). 용리 RNA 플레이트 번호는 생성된 컬럼 플레이트 번호와 행 플레이트 문자(A = 1, B = 2, C = 3 등)에 해당합니다. 디콘볼루션을 위해 컬럼 플레이트 행 문자는 RNA 용리 플레이트의 행 문자에 해당하고 행 플레이트 열 번호는 RNA 용리 플레이트 열 번호에 해당합니다. 예를 들어, C4 위치의 RNA 플레이트 #6에 있는 샘플은 행 반응 플레이트 F4 위치 및 컬럼 반응 플레이트 위치 C6에서 찾을 수 있습니다.

1. 새 용리 플레이트에 Run ID와 row라는 단어를 표시하고 미리 냉각된 냉각판에 놓습니다. 열 용리 플레이트의 각 웰에서 컬럼 용리 플레이트의 해당 행으로 10μL의 RNA를 전달하여 원래 용리 플레이트의 사본을 만듭니다(그림 2).
   참고: 컬럼으로 표시된 용리 플레이트는 컬럼 방향으로 풀링되고 행으로 표시된 용리 플레이트는 행 방향으로 풀링됩니다.
2. 컬럼 풀링 플레이트의 경우, 플레이트를 가로질러 각 웰의 전체 부피를 Run ID 플레이트 번호에 해당하는 컬럼 번호로 이동합니다. 행 풀링 플레이트의 경우, 각 웰의 전체 볼륨을 플레이트의 위 또는 아래로 Run ID 플레이트 번호(1 = A, 2 = B 등)에 해당하는 행 번호로 이동합니다. 그림 2).
3. 풀링된 각 시료 13μL를 96웰 반응 플레이트의 해당 컬럼 또는 행으로 옮깁니다(그림 2).
4. 이 프로토콜의 경우 뉴클레오캡시드(N), ORF1ab 및 스파이크(S) 유전자에 대해 3개의 프로브를 사용하여 SARS-CoV-2를 검출하고 MS2 파지를 표적으로 하는 4번째 프라이머 프로브를 내부 대조군으로 사용합니다. 풀링된 샘플에서 MS2 파지 양성 대조군을 마스터 믹스에 스파이크합니다. 개별 샘플에서 MS2 파지를 RNA 분리 카트리지의 샘플에 스파이크하고 추출 대조군으로 사용합니다.
   참고: 마스터 믹스, 프라이머 프로브, 형광 염료 및 담금질제는 분석에 따라 달라집니다. 적절한 비율과 형광 채널은 각 실험실에서 결정해야 합니다.
5. 반응 플레이트의 양성 대조군 웰에 2 μL의 양성 대조군 용액과 11 μL의 DNase/RNase-free 분자 등급 물을 첨가하여 양성 대조군을 준비합니다(그림 2).
6. 반응 플레이트의 negative control well에 13μL의 DNase/RNase-free 분자 등급 물을 첨가하여 무템플릿 대조군을 준비합니다.
7. 제조업체의 지침에 따라 마스터 믹스를 만들고 MS2 파지 양성 대조군을 스파이크합니다. 7μL의 마스터 믹스를 샘플 또는 대조군이 포함된 96웰 반응 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 형광등에 대한 노출을 제한하십시오.
8. 반응 플레이트를 광학 필름과 와류로 2분 동안 덮어 샘플을 잘 혼합합니다. 650 x g 에서 5분 동안 원심분리기 반응 플레이트.
9. 플레이트를 RT-PCR 시스템으로 옮기고 마스터 믹스에 적합한 사이클링 파라미터로 실행합니다. 여기에 사용된 마스터 믹스의 경우, 2분 동안 25°C, 10분 동안 53°C, 2분 동안 95°C, 3초 동안 95°C의 40 사이클, 30초 동안 60°C의 사이클을 실행했습니다.
10. 샘플이 실행되면 풀의 디콘볼루션을 수행하여 수동으로 그리고 R Script Shiny 앱을 통해 잠재적인 양성 샘플을 식별합니다(그림 3).
    1. 열 및 행 반응 플레이트의 결과를 스프레드시트 파일로 내보냅니다. 풀 디콘볼루션 R 스크립트 Shiny 앱을 엽니다(소스 코드는 https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP 에서 사용 가능).
    2. 플레이트 맵, 열 및 행 파일을 앱으로 끌어다 놓고 앱을 실행합니다. 앱에서 생성된 목록을 저장합니다.
       참고: 앱에서 생성된 목록에는 플레이트 맵에 입력된 모든 바코드와 풀 디콘볼루션 스크립트를 기반으로 양수 또는 음수인지 여부가 포함됩니다. 잠재적 양성으로 표시된 이러한 샘플은 개별적으로 재처리됩니다.

6. 양성 샘플의 검증

1. 검사가 필요한 각 샘플에 대해 2개의 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브와 RNA 추출 컬럼에 라벨을 부착합니다. 시료, MS2 파지 및 바이러스 로딩 버퍼를 혼합하기 위해 하나의 마이크로 원심분리 튜브를 사용하고, RNA 용리 단계를 위해 두 번째 마이크로 원심분리 튜브를 사용합니다.
2. 5μL의 MS2 Phage RNA를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 200 μL의 양성 가능성이 있는 샘플을 튜브로 옮기고 400 μL의 바이러스 로딩 버퍼를 튜브에 추가한 후 피펫팅으로 혼합합니다.
3. 전체 내용물을 깨끗한 채취 튜브의 사전 라벨링된 RNA 추출 컬럼으로 옮깁니다. 10,000 x g 에서 2분 동안 원심분리기 수집 튜브에서 흐름을 흡입합니다.
4. RNA 추출 컬럼에 세척 완충액 500μL를 추가하고 10,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 수집 튜브에서 흐름을 흡입합니다.
5. RNA 추출 컬럼에 세척 완충액 500μL를 추가하고 10,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 수집 튜브에서 흐름을 흡입합니다.
6. RNA 추출 컬럼에 500μL의 100% 에탄올을 첨가하고 10,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. RNA 추출 컬럼을 깨끗한 채취 튜브로 옮기고 10,000 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 컬럼을 건조시킵니다.
7. RNA 추출 컬럼을 사전 라벨링된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 용리합니다. 25μL의 DNase/RNase-free 분자 등급 물을 RNA 추출 컬럼에 추가합니다. 10,000 x g 에서 2분 동안 원심분리기를 하여 RNA를 수집하고 튜브를 젖은 얼음으로 이동합니다.
8. 제조업체의 지침에 따라 마스터 믹스를 만드십시오. 샘플을 담을 96웰 반응 플레이트의 각 웰에 7μL의 마스터 믹스를 분주합니다. 분리된 각 RNA 13μL를 반응 플레이트로 옮깁니다.
   참고: 마스터 믹스는 풀링된 샘플 프로토콜에 사용된 것과 동일하지만 MS2 파지 RNA 스파이크는 포함되지 않습니다.
9. 반응 플레이트의 양성 대조군 웰에 2 μL의 양성 대조군 용액과 11 μL의 DNase/RNase-free 분자 등급 물을 첨가하여 양성 대조군을 준비합니다. 반응 플레이트의 negative control well에 13μL의 DNase/RNase-free 분자 등급 물을 첨가하여 무템플릿 대조군을 준비합니다.
10. 반응 플레이트를 광학 필름과 와류로 2분 동안 덮어 샘플을 잘 혼합합니다. 650 x g 에서 5분 동안 원심분리기 반응 플레이트. 플레이트를 RT-PCR 시스템으로 옮기고 마스터 믹스에 적합한 사이클링 파라미터로 실행합니다.
    1. 여기에 명시된 마스터 믹스의 경우 25°C에서 2분, 53°C에서 10분, 95°C에서 2분, 40°C에서 95°C를 3초, 60°C에서 30초를 사용합니다.

결과

현재까지 실험실에서 받은 샘플의 대다수는 승인되어 초기 시각적 품질 관리 단계를 통과했습니다. 샘플을 거부해야 할 필요성은 샘플 처리 및/또는 샘플의 전체 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 이유로 제한됩니다. 구체적으로 말하자면, 튜브의 잘못된 부피, 농도 또는 타액에 자연스럽지 않은 색상, 시료 균질화를 돕기 위해 사용되는 세라믹 비드의 부재, 바코드 ?...

토론

시료 처리 중에는 세심한 주의가 필요한 단계가 있습니다. 시료의 양, 일관성, 색상 및 첨가된 비드의 존재 여부를 확인하는 초기 품질 관리 단계는 공정의 전반적인 성공에 매우 중요합니다. 정확한 양의 타액이 포함되어 있지 않은 샘플이 있는 튜브는 타액이 너무 적으면 유전 물질이 충분하지 않기 때문에 위음성을 생성할 수 있습니다. 반대로, 너무 많은 타액은 RNA 완?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Step MM, no ROX	Thermo Fisher	A28523
1.2 mlDeep well Plates	Fisher	AB0564
100 mL reagent reservoirs	Corning	4872
2.8 mm Ceramic Beads	OMNI	19-646
25 ml conical w/screw cap	VWR	76338-496
50mL V bottom reservoirs	Costar	4870
5430-High-Speed Centrifuge	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf Tube	Fisher	14282300
8 strip tubes for QuantStudio	life technologies	4316567
Beta Mercaptoethanol	Fisher	AC125472500
Ethanol 200 Proof, Molecular Biology Grade	Fisher	BP28184
Microamp Endura Optical 96-well fast clear reaction plate with barcode	life technologies	4483485
Microamp Fast Optical 96 well plate	Fisher	4346906
Mini Microcentrifuge	Corning Medical	6770
optical caps for strip tubes	life technologies	AB-1820
Optical Film	Thermo Fisher	4311971
PCR plate sealing film Non-optical	Fisher	AB-0558
PCR Plate semi-skirted	Fisher	14230244
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
Quick RNA Viral Kit confirmation	Zymo	R1035
Reagent Reservoir, 100ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
Small Biohazard Bags	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19 kit	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrifuge	Thermo Fisher	75009525
Transfer Pipet	Fisher	22170404
Viral 96 Kit	Zymo	R1041
Vortex Mixer	Fisher	2215414