Pruebas de detección del SARS-CoV-2 a gran escala que utilizan muestras de saliva y transposición

Resumen

El protocolo pretende servir de modelo para las universidades y otras organizaciones que estén considerando realizar pruebas a gran escala para el SARS-CoV-2 o desarrollar planes de preparación para futuros brotes virales.

Resumen

La identificación y el aislamiento de las personas contagiosas, junto con la cuarentena de los contactos cercanos, son fundamentales para frenar la propagación del COVID-19. Las pruebas a gran escala en calidad de vigilancia o cribado de portadores asintomáticos de COVID-19 proporcionan tanto datos sobre la propagación viral como la capacidad de seguimiento para realizar pruebas rápidamente a las personas durante los brotes sospechosos. El programa de detección temprana de COVID-19 de la Universidad Estatal de Michigan ha estado utilizando pruebas a gran escala en calidad de vigilancia o detección desde el otoño de 2020. Los métodos adaptados aquí aprovechan la fiabilidad, el gran volumen de muestra y los beneficios de la autorecolección de la saliva, junto con un esquema de agrupación bidimensional rentable y conservador de reactivos. El proceso fue diseñado para ser adaptable a la escasez de suministros, con muchos componentes de los kits y el ensayo fácilmente sustituibles. Los procesos descritos para recolectar y procesar muestras de SARS-CoV-2 se pueden adaptar para analizar futuros patógenos virales expresados de manera confiable en la saliva. Al proporcionar este plan para las universidades u otras organizaciones, se pueden desarrollar planes de preparación para futuros brotes virales.

Introducción

La pandemia de COVID-19, causada por el virus SARS-CoV-2, ha causado la muerte de más de 6,2 millones de personas hasta la fecha, y las cifras aumentan cada día¹. El estándar de oro de las pruebas para el SARS-CoV-2 es la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-q), con cebadores diseñados para dirigirse al genoma viral, como los genes de nucleocápside, envoltura, espícula y ARN polimerasa^dependiente de ARN 2. Al comienzo de la pandemia, la capacidad suficiente para realizar pruebas de detección del SARS-CoV-2 era muy escasa. Surgió de la falta de ensayos validados, componentes de prueba, personal clínico y una infraestructura que no estaba preparada para expandirse rápidamente para acomodar pruebas masivas a nivel de pandemia. Debido a la escasez, los centros de pruebas a menudo requerían la referencia de un médico para ser elegible para la prueba. Esta escasez provocó retrasos en la aprobación de las pruebas, largas colas para la incómoda recogida de muestras nasofaríngeas y largos tiempos de espera para los resultados. Además, debido a estas limitaciones, los esfuerzos de prueba no pudieron acomodar a los portadores presintomáticos, leves o asintomáticos que propagaron el SARS-CoV-2 sin saberlo. Es probable que la falta de pruebas generalizadas y de fácil acceso haya contribuido a la propagación descontrolada de la COVID-19.

Las pruebas de intervalo a gran escala se pueden realizar como vigilancia o detección. Ambos se pueden usar para monitorear las tasas de positividad local en áreas de alta densidad o alta riesgo de transmisión y se pueden utilizar para tomar decisiones de salud pública. Las pruebas de vigilancia están destinadas a controlar la incidencia y prevalencia de la enfermedad en una población y no se utilizan para el diagnóstico individual³. Por lo general, los resultados de la vigilancia se anonimizan y no se devuelven a los participantes; los laboratorios que realizan pruebas de vigilancia no necesitan estar clínicamente certificados, ni están obligados a utilizar un ensayo autorizado por la FDA. La detección permite que los resultados se devuelvan a los participantes individuales, pero los laboratorios de detección en los Estados Unidos deben tener un certificado de Enmiendas para la Mejora del Laboratorio Clínico (CLIA) y cumplir con todos los requisitos aplicables de CLIA.

El programa de detección temprana de la Universidad Estatal de Michigan (MSU, por sus siglas en inglés) comenzó en septiembre de 2020 y ha procesado más de 350,000 muestras. El programa surgió de los esfuerzos de un grupo de investigación para diseñar un ensayo de SARS-CoV-2 altamente sensible que no requiriera suministros de prueba de alta demanda 4,5,6,7,8. Los objetivos eran ayudar a los laboratorios clínicos a aumentar su capacidad y desarrollar procesos flexibles para adaptarse a la escasez de suministros, al tiempo que desarrollaban una estrategia de detección para establecer un plan de regreso al trabajo para la Facultad de Medicina Humana de MSU. Los esfuerzos iniciales se centraron en métodos alternativos de recolección, extracción y cuantificación para el SARS-CoV-2. La alta demanda y la posterior escasez de hisopos nasofaríngeos llevaron a la evaluación de muestras de narinas anteriores recolectadas con hisopos bucales, y la escasez de reactivos resultó en el desarrollo de un método de extracción de muestras adaptado de los primeros informes de Wuhan, China⁹. Con el fin de aumentar la sensibilidad para la detección de SARS-CoV-2 en muestras de narinas anteriores, se sustituyó la PCR digital en gotas por la RT-qPCR ^6,7. Aunque la PCR digital en gotas es muy sensible y puede proporcionar valores absolutos con una lectura de punto final, se determinó que su uso no era factible para pruebas a gran escala debido a la falta de instrumentación fiable de alto rendimiento para la tecnología. Además, la autorecolección de muestras de narinas anteriores basada en los niveles de ARNasa P humana fue extremadamente variable, lo que sugiere que no era lo suficientemente fiable para las pruebas masivas.

Una alternativa a los hisopos nasofaríngeos y de narinas anteriores es la recolección de saliva. Históricamente, los virus respiratorios como el SARS-CoV, el H1N1 y el MERS se detectaron en la saliva 10,11,12,13. Posteriormente, se demostró que esto era cierto para el SARS-CoV-2 14,15,16,17. La comparación directa entre las muestras de saliva y nasofaríngeas mostró que la saliva produce títulos virales más altos que los hisopos nasofaríngeos en muestras pareadas, y que la saliva es menos variable con la recolección repetida^{de muestras 14}. También se ha informado que la saliva es más sensible en ciertas variantes, como Ómicron, en comparación con Delta¹⁶. Los beneficios adicionales de la recolección de saliva son la relativa facilidad de la autorecolección fuera del sitio sin suministros de alta demanda, la capacidad de volver a analizar repetidamente la muestra si es necesario, la eliminación de los requisitos de personal en el sitio para la recolección de muestras y evitar las filas de participantes que podrían aumentar el potencial de transmisión viral. El kit de saliva ensamblado en laboratorio se desarrolló como una colaboración entre desarrolladores de ensayos de laboratorio, expertos en la escuela de empaques, expertos en marcas universitarias, oficiales de seguridad y socios de fabricación externos que produjeron la caja y el sistema de etiquetado.

Si bien las muestras de saliva ofrecen un amplio material genético de partida y la RT-qPCR proporciona resultados sensibles y confiables, el costo de los reactivos (cebador/sondas y mezcla maestra) hizo que las pruebas a gran escala de muestras individuales fueran un esfuerzo costoso individual, por muestra. Dado que el cebador/sonda y la mezcla maestra son los componentes más caros del proceso, el objetivo era buscar soluciones que ampliaran su uso y, por lo tanto, disminuyeran el costo por muestra. Se ha propuesto la optimización sistémica del tamaño del grupo de muestras en función de la incidencia en la comunidad y la sensibilidad del ensayo para las pruebas de SARS-CoV-2¹⁸. Sin embargo, cuando los grupos de cualquier tamaño indican la presencia de SARS-CoV-2, todos los participantes en el grupo deben volver a hacerse la prueba, lo que resulta en una pérdida de tiempo y un aumento de las oportunidades de propagación. Para abordar estas limitaciones, se empleó un método de agrupación bidimensional, como el proceso propuesto por Zilinskas y otros¹⁹ para realizar un primer paso bajo las restricciones de las pruebas de vigilancia. En este proceso, se colocan 96 muestras individuales en una placa de 96 pocillos que consta de 12 columnas y ocho filas. Cada muestra se incluye en un grupo de ocho y un grupo de 12 en dos placas de reacción diferentes. Esto da como resultado que cada muestra se represente de forma única con los dos grupos. La deconvolución de los grupos en función de las coordenadas identifica muestras potencialmente positivas. Las muestras en grupos donde no se detectó el SARS-CoV-2 no pasan de las pruebas de vigilancia a las pruebas de detección. Mientras tanto, las muestras de las personas que dan positivo en el proceso de vigilancia se vuelven a extraer a través de un proceso de detección aprobado por CLIA. Si se confirma un positivo, se da a las personas su resultado, se las remite al consultorio del médico de la universidad, se inicia el rastreo de contactos y se notifica al departamento de salud. En total, la muestra de un individuo se analiza en tres reacciones separadas antes de ser declarada positiva, dos veces en grupos de vigilancia y una vez como una sola prueba de confirmación, lo que reduce las posibilidades de un falso positivo. La agrupación de muestras utiliza ~ 80% menos de reactivos que las muestras procesadas individualmente, lo que resulta en un costo de ~ $ 12 por muestra.

Más allá del kit de saliva, la estrategia de agrupación y el proceso de desarrollo de ensayos, el equipo también desarrolló un plan logístico para la distribución de kits, la recolección de muestras y la presentación de informes de resultados. Los participantes en el programa recogen su kit, registran el código alfanumérico único en su tubo, producen su muestra y la depositan en uno de los muchos contenedores de entrega donde se recogen diariamente y se transportan al laboratorio. El laboratorio procesa las muestras, el supervisor técnico revisa y carga los resultados, y se notifica a los participantes para que consulten el portal de resultados. Este proceso tiene un tiempo de respuesta de 24-48 h desde el momento en que se deposita una muestra. La colaboración de todas las partes de la institución fue clave para una implementación exitosa a gran escala de este proceso híbrido de vigilancia y detección. Los siguientes procedimientos y descripciones del programa de pruebas y la infraestructura necesaria pretenden ser modelos sobre cómo ampliar las pruebas para futuros fines de vigilancia y/o detección.

Protocolo

Los estudios realizados para optimizar los métodos del Programa de Detección Temprana fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Estatal de Michigan. Todas las figuras fueron reproducidas con muestras artificiales y son representativas de los resultados humanos observados. Ningún dato, información o resultado que se muestra en el manuscrito proviene de ningún participante del Programa de Detección Temprana de la Universidad Estatal de Michigan.

1. Producción de kits

NOTA: Durante el armado del kit, use mascarillas, guantes, protección para los ojos y batas de laboratorio en todo momento para evitar la contaminación de los componentes del kit.

1. Preparación de los componentes del kit
   1. Con un marcador permanente, dibuje una línea que indique 1 mL en el tubo cónico de 25 mL. Con un rotulador permanente, dibuje una línea que indique 1 mL en la pipeta de transferencia.
   2. Agregue cuatro perlas de cerámica al tubo de muestra de 5 ml. Pipetear 1 mL de solución de estabilización de ARN en el tubo de muestra y cerrar el tubo. Coloque una pegatina de barra que consta de un código de identificación único en el tubo de muestra con el código de barras de la matriz de datos en la parte superior y el identificador repetido en código alfanumérico en el lateral.
      NOTA: Las perlas de cerámica están libres de RNasa/DNasa y no necesitan ser esterilizadas más.
2. Coloque un tubo cónico de 25 mL, un tubo de muestra de 5 mL, una pipeta de transferencia y una pequeña bolsa de riesgo biológico en la caja del kit (Figura complementaria 1).
   NOTA: No es necesario que los tubos cónicos estén libres de DNasa/RNasa. La solución de estabilización de ARN preserva la integridad de la muestra.

2. Usos del kit para la recolección de muestras propias

1. De acuerdo con las instrucciones del kit, pida a los participantes que no coman ni beban 30 minutos antes de proporcionar una muestra. Pida a los participantes que escupan en el tubo cónico de 25 mL hasta que se recoja 1 mL de saliva (línea marcada).
2. Con la pipeta, transfiera 1 mL de saliva (hasta la línea marcada) al tubo de muestra de 5 mL que contiene la solución de estabilización de ARN y perlas cerámicas. Cierre y agite el tubo de muestra durante 15 s.
3. Pida a los participantes que registren el código alfanumérico asignado a la muestra en el sitio web designado. Una vez hecho esto, pídales que coloquen el tubo de muestra en una pequeña bolsa de riesgo biológico y lo depositen en un contenedor de recolección.

3. Ingesta de muestras y preparación para el aislamiento de ARN

NOTA: Todos los pasos se llevan a cabo en un gabinete de bioseguridad o cubo de centrífuga con tapa de biocontención.

1. Desinfecte e inspeccione visualmente las muestras para el control de calidad mientras aún están en la bolsa de riesgo biológico.
2. Rechace la muestra si (Figura 1): la muestra es de color no natural (es decir, verde, azul) o contiene partículas de alimentos o sangre; la muestra tiene fugas o faltan cuentas; la muestra tiene un volumen esperado incorrecto (<1,5 mL o >3 mL); La muestra no tiene un código de barras o alfanumérico adjunto.
   1. Si se rechaza la muestra, escanee y registre la muestra en un archivo de rechazo con una nota de por qué se rechazó la muestra. Si la muestra se rechaza porque no tiene identificadores, registre la muestra como Sin código de barras en el archivo de rechazo.
3. Si la muestra no es rechazada, corte la bolsa de riesgo biológico con unas tijeras y retire el tubo de muestra. Agite el tubo durante 15 s y, a continuación, coloque el tubo de muestra en un adaptador de tubo para una centrífuga de cubo oscilante.
4. Una vez que los adaptadores de tubo estén llenos, asegure la tapa de biocontención sobre el cubo de centrífuga y transfiéralo a la centrífuga. Centrifugar las muestras a 4.100 x g durante 2 minutos y devolver las muestras a la cabina de bioseguridad.
   NOTA: La centrifugación se utiliza para pellizar los desechos y forzar más material viscoso en la saliva hacia el fondo del tubo. Esto elimina la necesidad de proteinasa K en el proceso. Una tirada completa consta de 768 muestras (ocho placas de 96 pocillos llenas de muestra después del aislamiento del ARN).
5. Sin alterar el material peletizado, transfiera los tubos de muestra a un estante de tubos de 96 ranuras preetiquetado con el ID de ejecución que incluye el número de bastidor (1-8), la fecha y el grupo correspondiente con el que se agruparán/evaluarán las muestras (un identificador para denotar el grupo, es decir, el grupo A es la primera ejecución del día).
6. Cuando los racks de tubos de 96 ranuras estén llenos o no queden muestras, utilizando un escáner de código de barras de mano, escanee los tubos en un archivo de mapa de placas (Archivo Suplementario 1 para piscinas completas; Fichero complementario 2 para piscinas de tamaño medio). En caso de que un código de barras no funcione, use el código alfanumérico en el tubo para registrar la muestra.
   NOTA: Se requiere una mascarilla para evitar el escaneo de códigos de barras adyacentes. Se puede hacer una mascarilla cortando un agujero en papel opaco y luego laminándolo. Los códigos de barras escaneados en el archivo de mapa de placas aparecerán en la misma orientación que en el bastidor de 96 ranuras.
7. Rocíe los tubos de muestra en la rejilla con etanol al 70% y séquelos con una toalla de papel.
   NOTA: Limpiar los tubos en lugar de frotar puede dañar los códigos de barras.
8. Etiquete una placa de 96 pocillos de profundidad con una capacidad de pocillo de 2 mL con el ID de ejecución. Transfiera 200 μL de muestra de saliva de cada tubo de muestra al pocillo correspondiente de la placa de 96 pocillos de profundidad. Si las muestras son demasiado viscosas para transferirlas, vórtice y centrifugar de nuevo. Rechace la muestra si el problema persiste.
   NOTA: Las muestras de saliva pueden ser fibrosas y dejar un rastro de caracol a través de la placa durante la transferencia si el técnico no tiene cuidado. Esto puede dar lugar a falsos positivos iniciales y a más muestras que eventualmente deberán volver a ejecutarse en el paso de confirmación (consulte la sección 6).
9. Cuando se transfieran todas las muestras, cubra la placa de 96 pocillos de profundidad con una estera de silicona y guárdela a temperatura ambiente. Guarde y almacene los bastidores de 96 ranuras con las muestras restantes para confirmar las muestras potencialmente positivas.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

4. Aislamiento de ARN

1. Etiquete un cartucho de aislamiento de ARN de 96 pocillos con el ID de ejecución y colóquelo encima de una placa de recolección vacía.
   NOTA: Las placas que contienen muestras se pueden retirar de la cabina de bioseguridad en este punto.
2. Retire la alfombrilla de silicona de la placa de 96 pocillos de profundidad. Transfiera 400 μL de tampón de carga viral a cada pocillo de la placa de 96 pocillos de profundidad.
3. Mezcle cada muestra pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo de dos a cuatro veces y transfiera toda la muestra a la columna correspondiente en el cartucho de aislamiento de ARN de 96 pocillos.
   NOTA: La mezcla de grandes volúmenes creará burbujas que pueden provocar la contaminación de los pozos vecinos si se realiza al azar. La mezcla deliberada puede reducir este riesgo y proteger la integridad del procesamiento posterior.
4. Centrifugar el cartucho de aislamiento de ARN en la parte superior de la placa de recolección a 4.100 x g durante 10 minutos para cargar muestras en el cartucho. Transfiera el cartucho de aislamiento de ARN a una placa de recolección limpia.
5. Añada 500 μL de tampón de lavado a cada pocillo del cartucho de aislamiento de ARN y centrifugue a 4.100 x g durante 5 min. Transfiera el cartucho de aislamiento de ARN a una placa de recolección limpia.
6. Añada 500 μL de tampón de lavado a cada pocillo del cartucho de aislamiento de ARN y centrifugue a 4.100 x g durante 5 min. Transfiera el cartucho de aislamiento de ARN a una placa de recolección limpia.
7. Agregue 500 μL de etanol al 100% a cada pocillo del cartucho de aislamiento de ARN y centrifugue a 4.100 x g durante 5 min. Transfiera el cartucho de aislamiento de ARN a una placa de recolección limpia.
   NOTA: Si la muestra no ha pasado completamente por la columna en este punto, la muestra es demasiado viscosa o pequeños trozos de residuos en la muestra están obstruyendo la columna. La muestra debe extraerse completamente del cartucho para no contaminar el proceso de agrupación posterior, y el número de muestra debe agregarse al archivo de rechazo.
8. Centrifugar el cartucho de aislamiento de ARN en la parte superior de la placa de recolección a 4.100 x g durante 5 minutos para secar las columnas. Transfiera el cartucho de aislamiento de ARN a una placa de elución limpia etiquetada con el ID de ejecución y la fila de palabras, luego coloque ambos encima de una placa de recolección limpia.
9. Agregue 25 μL de agua de grado molecular libre de DNasa/RNasa a cada pocillo del cartucho de aislamiento de ARN. Centrifugar a 4.100 x g durante 10 min para eluir el ARN. Si la muestra no eluye completamente, vuelva a centrifugar la muestra durante 5 minutos.
10. Transfiera las placas de elución a placas frías preenfriadas y cúbralas. Proceda inmediatamente a la agrupación de muestras y a la RT-qPCR.

5. Agrupación de muestras y RT-qPCR

NOTA: El proceso se configura en un sistema de dos placas (como se ve en la Figura 2). El número de placa de ARN de elución corresponde al número de placa de columna producido y la letra de la placa de fila (A = 1, B = 2, C = 3, etc.). Para fines de deconvolución, la letra de la fila de la placa de columna corresponderá a la letra de la fila de la placa de elución de ARN, y el número de columna de la placa de fila corresponderá al número de columna de la placa de elución de ARN. Por ejemplo, una muestra en la placa de ARN #6 en la posición C4 se encontrará en la posición F4 de la placa de reacción en fila y en la posición C6 de la placa de reacción en columna.

1. Etiquete una nueva placa de elución con el ID de ejecución y la palabra fila, y colóquela en una placa fría preenfriada. Transfiera 10 μL de ARN de cada pocillo en la placa de elución de la fila a la fila correspondiente en la placa de elución de la columna, haciendo así una copia de la placa de elución original (Figura 2).
   NOTA: Las placas de elución marcadas como columna se agruparán en la dirección de la columna y las placas de elución marcadas como fila se agruparán en la dirección de la fila.
2. En el caso de la placa agrupada en columnas, transfiera todo el volumen de cada pocillo a través de la placa al número de columna que corresponda al número de placa de ID de ejecución. Para la placa agrupada en filas, transfiera todo el volumen de cada pocillo hacia arriba o hacia abajo de la placa al número de fila que corresponde al número de placa de ID de ejecución (1 = A, 2 = B, etc.; Figura 2).
3. Transfiera 13 μL de cada muestra agrupada a la columna o fila correspondiente de una placa de reacción de 96 pocillos (Figura 2).
4. Para este protocolo, utilice tres sondas contra los genes nucleocápside (N), ORF1ab y spike (S) para detectar el SARS-CoV-2, y una cuarta sonda de cebador dirigida al fago MS2 como control interno. En las muestras agrupadas, agregue un control positivo de fagos MS2 a la mezcla maestra. En muestras ejecutadas individualmente, agregue el fago MS2 a la muestra en el cartucho de aislamiento de ARN y utilícelo como control de extracción.
   NOTA: La mezcla maestra, las sondas de cebado, los tintes fluorescentes y los extintores variarán según el ensayo. Las proporciones apropiadas y los canales fluorescentes deben ser determinados por cada laboratorio.
5. Prepare el control positivo agregando 2 μL de solución de control positivo y 11 μL de agua de grado molecular libre de DNasa/RNasa al pocillo de control positivo en la placa de reacción (Figura 2).
6. Prepare el control sin plantilla añadiendo 13 μL de agua de grado molecular libre de DNasa/RNasa al pocillo de control negativo en la placa de reacción.
7. Prepare la mezcla maestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante y aumente el control positivo del fago MS2. Dispense 7 μL de mezcla maestra en cada pocillo de las placas de reacción de 96 pocillos que contienen muestras o controles. Limite la exposición a la luz fluorescente.
8. Cubra las placas de reacción con una película óptica y un vórtice durante 2 minutos para mezclar bien las muestras. Centrifugar las placas de reacción a 650 x g durante 5 min.
9. Transfiera las placas al sistema RT-PCR y ejecute con los parámetros de ciclo apropiados para la mezcla maestra. Para la mezcla maestra utilizada aquí, se ejecutaron los siguientes ciclos: 25 °C durante 2 min, 53 °C durante 10 min, 95 °C durante 2 min, 40 ciclos de 95 °C durante 3 s y 60 °C durante 30 s.
10. Una vez que se ejecutan las muestras, realice una deconvolución de los grupos para identificar posibles muestras positivas manualmente (Figura 3) y a través de una aplicación R Script Shiny.
    1. Exporte los resultados de las placas de reacción de columna y fila como archivos de hoja de cálculo. Abra la aplicación Shiny del script R de deconvolución de grupos (código fuente disponible en: https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP).
    2. Arrastre y suelte los archivos de mapa de placas, columnas y filas en la aplicación y ejecute la aplicación. Guarde la lista producida desde la aplicación.
       NOTA: La lista producida por la aplicación contiene todos los códigos de barras ingresados en el mapa de placas y si son probablemente positivos o negativos según el script de deconvolución de la piscina. Estas muestras que se marcan como posibles positivos se vuelven a procesar individualmente.

6. Validación de muestras positivas

1. Etiquete dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y una columna de extracción de ARN para cada muestra que deba analizarse. Utilice un tubo de microcentrífuga para mezclar la muestra, el fago MS2 y el tampón de carga viral, y el segundo tubo de microcentrífuga para el paso de elución de ARN.
2. Añada 5 μL de ARN de fago MS2 al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Transfiera 200 μL de la muestra potencialmente positiva al tubo y agregue 400 μL de tampón de carga viral al tubo, mezcle mediante pipeteo.
3. Transfiera todo el contenido a la columna de extracción de ARN premarcada en un tubo de recolección limpio. Centrifugar a 10.000 x g durante 2 min. Flujo de aspirado a través del tubo de recolección.
4. Añadir 500 μL de tampón de lavado a la columna de extracción de ARN y centrifugar a 10.000 x g durante 2 min. Flujo de aspirado a través del tubo de recolección.
5. Añadir 500 μL de tampón de lavado a la columna de extracción de ARN y centrifugar a 10.000 x g durante 2 min. Flujo de aspirado a través del tubo de recolección.
6. Añadir 500 μL de etanol al 100% a la columna de extracción de ARN y centrifugar a 10.000 x g durante 1 min. Transfiera la columna de extracción de ARN a un tubo de recolección limpio y centrifugue a 10,000 x g durante 1 minuto para secar la columna.
7. Transfiera la columna de extracción de ARN a un tubo de microcentrífuga premarcado de 1,5 mL para su elución. Agregue 25 μL de agua de grado molecular libre de DNasa/RNasa a la columna de extracción de ARN. Centrifugar a 10.000 x g durante 2 min para recoger el ARN y transferir el tubo a hielo húmedo.
8. Haga la mezcla maestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dispense 7 μL de mezcla maestra en cada pocillo de una placa de reacción de 96 pocillos que contendrá la muestra. Transfiera 13 μL de cada ARN aislado a la placa de reacción.
   NOTA: La mezcla maestra es la misma que se utiliza en el protocolo de muestra agrupada, pero no incluye la espiga de ARN del fago MS2.
9. Prepare el control positivo agregando 2 μL de solución de control positivo y 11 μL de agua de grado molecular libre de DNasa/RNasa al pocillo de control positivo en la placa de reacción. Prepare el control sin plantilla añadiendo 13 μL de agua de grado molecular libre de DNasa/RNasa al pocillo de control negativo en la placa de reacción.
10. Cubra las placas de reacción con una película óptica y un vórtice durante 2 minutos para mezclar bien las muestras. Centrifugar las placas de reacción a 650 x g durante 5 min. Transfiera las placas al sistema RT-PCR y ejecute con los parámetros de ciclo apropiados para la mezcla maestra.
    1. Para la mezcla maestra indicada aquí, use 25 °C durante 2 min, 53 °C durante 10 min, 95 °C durante 2 min, 40 ciclos de 95 °C durante 3 s y 60 °C durante 30 s.

Resultados

La gran mayoría de las muestras recibidas por el laboratorio hasta la fecha han sido aceptadas y han pasado el paso inicial de control de calidad visual. La necesidad de rechazar una muestra se limita a razones que pueden influir negativamente en el procesamiento de la muestra y/o en los resultados generales de la misma. Específicamente, el volumen incorrecto en el tubo, la consistencia o el color no natural de la saliva, la ausencia de perlas de cerámica utilizadas para ayudar en la ...

Discusión

Durante el procesamiento de muestras, hay pasos que requieren una atención cuidadosa. El paso inicial de control de calidad, que analiza el volumen de la muestra, la consistencia, el color y la presencia de perlas agregadas, es fundamental para el éxito general del proceso. Los tubos con muestras que no contienen la cantidad correcta de saliva podrían producir un falso negativo, ya que muy poca saliva daría como resultado que no haya suficiente material genético; por el contrario, d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Step MM, no ROX	Thermo Fisher	A28523
1.2 mlDeep well Plates	Fisher	AB0564
100 mL reagent reservoirs	Corning	4872
2.8 mm Ceramic Beads	OMNI	19-646
25 ml conical w/screw cap	VWR	76338-496
50mL V bottom reservoirs	Costar	4870
5430-High-Speed Centrifuge	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf Tube	Fisher	14282300
8 strip tubes for QuantStudio	life technologies	4316567
Beta Mercaptoethanol	Fisher	AC125472500
Ethanol 200 Proof, Molecular Biology Grade	Fisher	BP28184
Microamp Endura Optical 96-well fast clear reaction plate with barcode	life technologies	4483485
Microamp Fast Optical 96 well plate	Fisher	4346906
Mini Microcentrifuge	Corning Medical	6770
optical caps for strip tubes	life technologies	AB-1820
Optical Film	Thermo Fisher	4311971
PCR plate sealing film Non-optical	Fisher	AB-0558
PCR Plate semi-skirted	Fisher	14230244
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
Quick RNA Viral Kit confirmation	Zymo	R1035
Reagent Reservoir, 100ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
Small Biohazard Bags	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19 kit	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrifuge	Thermo Fisher	75009525
Transfer Pipet	Fisher	22170404
Viral 96 Kit	Zymo	R1041
Vortex Mixer	Fisher	2215414