Широкомасштабное тестирование на SARS-CoV-2 с использованием пулинга слюны и транспозиционных образцов

Резюме

Протокол призван послужить образцом для университетов и других организаций, рассматривающих возможность широкомасштабного тестирования на SARS-CoV-2 или разработки планов готовности к будущим вспышкам вируса.

Аннотация

Выявление и изоляция заразных лиц наряду с карантином близких контактов имеет решающее значение для замедления распространения COVID-19. Широкомасштабное тестирование в рамках эпиднадзора или скрининга бессимптомных носителей COVID-19 позволяет получить как данные о распространении вируса, так и возможность последующего наблюдения для быстрого тестирования людей во время предполагаемых вспышек. Программа раннего выявления COVID-19 в Университете штата Мичиган с осени 2020 года использует широкомасштабное тестирование в качестве эпиднадзора или скрининга. Адаптированные здесь методы используют преимущества надежности, большого объема проб и самостоятельного сбора слюны в сочетании с экономичной, сохраняющей реагенты двумерной схемой объединения. Процесс был разработан таким образом, чтобы его можно было адаптировать к нехватке поставок, при этом многие компоненты наборов и анализа легко заменялись. Описанные процессы сбора и обработки образцов SARS-CoV-2 могут быть адаптированы для тестирования будущих вирусных патогенов, надежно экспрессируемых в слюне. Предоставляя этот план университетам или другим организациям, можно разработать планы готовности к будущим вспышкам вируса.

Введение

Пандемия COVID-19, вызванная вирусом SARS-CoV-2, на сегодняшний день стала причиной смерти более 6,2 миллиона человек, и их число растет каждый^день1. Золотым стандартом тестирования на SARS-CoV-2 является количественная ПЦР в реальном времени (RT-q) с праймерами, предназначенными для нацеливания на вирусный геном, такие как нуклеокапсид, оболочка, спайк и гены РНК-зависимой РНК-полимеразы². В начале пандемии достаточных мощностей для тестирования на SARS-CoV-2 катастрофически не хватало. Она возникла из-за нехватки проверенных анализов, компонентов для тестирования, клинического персонала и инфраструктуры, неподготовленной к быстрому расширению для проведения массового тестирования на уровне пандемии. Из-за нехватки тестовых центров часто требовалось направление врача, чтобы иметь право на тестирование. Этот дефицит привел к задержкам с утверждением тестов, длинным очередям для неудобного сбора образцов из носоглотки и длительному ожиданию результатов. Кроме того, из-за этих ограничений усилия по тестированию не могли учитывать предсимптомных, легких или бессимптомных носителей, неосознанно распространяющих SARS-CoV-2. Отсутствие легкодоступного и широко распространенного тестирования, вероятно, способствовало неконтролируемому распространению COVID-19.

Крупномасштабное интервальное тестирование может быть выполнено либо в виде наблюдения, либо в виде скрининга. Оба эти показателя могут использоваться для мониторинга местных показателей положительности в районах с высокой плотностью или высоким риском передачи инфекции, а также для принятия решений в области общественного здравоохранения. Контрольно-надзорное тестирование предназначено для мониторинга заболеваемости и распространенности заболевания в популяции и не используется для индивидуальной диагностики³. Результаты эпиднадзора, как правило, обезличиваются и не возвращаются участникам; лаборатории, проводящие надзорные испытания, не обязательно должны иметь клиническую сертификацию, а также не обязаны использовать анализ, одобренный FDA. Скрининг позволяет вернуть результаты отдельным участникам, но скрининговые лаборатории в Соединенных Штатах должны иметь сертификат Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) и соответствовать всем применимым требованиям CLIA.

Программа раннего выявления Мичиганского государственного университета (MSU) началась в сентябре 2020 года и обработала более 350 000 образцов. Программа возникла в результате усилий исследовательской группы по разработке высокочувствительного анализа на SARS-CoV-2, который не требовал бы высокого спроса на материалы для тестирования 4,5,6,7,8. Цели состояли в том, чтобы помочь клиническим лабораториям увеличить пропускную способность и разработать гибкие процессы для восполнения нехватки поставок, а также разработать стратегию скрининга для создания плана возвращения к работе для Колледжа медицины человека МГУ. Первоначальные усилия были сосредоточены на альтернативных методах сбора, экстракции и количественного определения SARS-CoV-2. Высокий спрос и последующая нехватка мазков из носоглотки привели к оценке образцов передних ноздрей, собранных с помощью буккальных мазков, а нехватка реагентов привела к разработке метода экстракции образцов, адаптированного из ранних отчетов из Уханя, Китай⁹. Для повышения чувствительности к выявлению SARS-CoV-2 в образцах передних ноздрей капельная цифровая ПЦР была заменена на RT-qPCR ^6,7. Несмотря на то, что капельная цифровая ПЦР обладает высокой чувствительностью и может выдавать абсолютные значения при считывании показаний в конечной точке, было установлено, что ее использование нецелесообразно для крупномасштабных испытаний из-за отсутствия надежных высокопроизводительных инструментов для этой технологии. Кроме того, самостоятельный сбор образцов передних ноздрей на основе уровней РНКазы Р человека был чрезвычайно вариабельным, что позволяет предположить, что он недостаточно надежен для массового тестирования.

Альтернативой мазкам из носоглотки и передних ноздрей является сбор слюны. Респираторные вирусы, такие как SARS-CoV, H1N1 и MERS, исторически обнаруживались в слюне 10,11,12,13. Впоследствии это было доказано для SARS-CoV-2 14,15,16,17. Прямое сравнение образцов слюны и носоглотки показало, что слюна дает более высокие титры вируса, чем мазки из носоглотки в сопоставимых образцах, и что слюна менее изменчива при повторном сборе образцов¹⁴. Также сообщалось, что слюна более чувствительна к некоторым вариантам, таким как Омикрон, по сравнению с Дельтой¹⁶. Дополнительными преимуществами сбора слюны являются относительная простота самостоятельного сбора слюны за пределами объекта без большого спроса, возможность повторного тестирования образца при необходимости, устранение требований к персоналу на месте для сбора образцов и отсутствие очередей участников, которые могут увеличить вероятность передачи вируса. Собранный в лаборатории набор для анализа слюны был разработан в результате сотрудничества между разработчиками лабораторных анализов, экспертами школы упаковки, университетскими экспертами по брендингу, сотрудниками по безопасности и внешними производственными партнерами, которые изготовили коробку и систему маркировки.

В то время как образцы слюны содержат достаточный генетический исходный материал, а ОТ-кПЦР обеспечивает чувствительные и надежные результаты, стоимость реагентов (праймер/зондов и мастер-смеси) сделала крупномасштабное тестирование отдельных образцов дорогостоящим мероприятием для каждого отдельного образца. Поскольку праймер/зонды и мастер-смесь являются наиболее дорогостоящими компонентами процесса, цель состояла в том, чтобы найти решения, которые расширили бы их использование и, следовательно, снизили бы стоимость одного образца. Для тестирования на SARS-CoV-2 была предложена системная оптимизация размера пула выборки на основе заболеваемости в сообществе и чувствительности анализа¹⁸. Однако, когда пулы любого размера указывают на наличие SARS-CoV-2, все участники пула должны быть повторно протестированы, что приводит к потере времени и увеличению возможностей для распространения. Чтобы устранить эти ограничения, был использован метод двумерного объединения, подобный процессу, предложенному Жилинскасом и другими¹⁹ для проведения первого прохода в условиях контрольного тестирования. В ходе этого процесса 96 отдельных образцов помещаются в 96-луночный планшет, состоящий из 12 столбцов и восьми рядов. Каждый образец включен в пул из восьми и пул из 12 образцов на двух разных реакционных планшетах. Это приводит к тому, что каждая выборка уникально представлена двумя пулами. Деконволюция бассейнов на основе координат позволяет выявить потенциально положительные выборки. Образцы в пулах, в которых SARS-CoV-2 не был обнаружен, не переходят от контрольного тестирования к скринингу. Между тем, образцы, взятые у лиц с положительным результатом теста в процессе эпиднадзора, повторно извлекаются с помощью процесса скрининга, одобренного CLIA. В случае положительного результата пациенту сообщают результат, направляют в кабинет врача университета, начинают отслеживание контактов и уведомляют департамент здравоохранения. В общей сложности образец человека тестируется в трех отдельных реакциях, прежде чем он будет объявлен положительным, дважды в пулах наблюдения и один раз в качестве одного подтверждающего скрининга, что снижает вероятность ложноположительного результата. При объединении образцов используется на ~80% меньше реагентов, чем при работе с образцами по отдельности, что приводит к стоимости ~$12 за образец.

Помимо набора слюны, стратегии объединения и процесса разработки анализов, команда также разработала логистический план для распределения наборов, сбора образцов и составления отчетов о результатах. Участники программы забирают свой набор, регистрируют уникальный буквенно-цифровой код на своей пробирке, производят образец и помещают его в один из многочисленных контейнеров, где их ежедневно забирают и транспортируют в лабораторию. Лаборатория обрабатывает образцы, технический руководитель просматривает и загружает результаты, а участники получают уведомление о необходимости проверить портал результатов. Время выполнения этого процесса составляет 24-48 часов с момента сдачи образца. Сотрудничество со всеми подразделениями учреждения сыграло ключевую роль в успешном широкомасштабном внедрении этого гибридного процесса эпиднадзора и скрининга. Следующие процедуры и описания необходимой программы тестирования и необходимой инфраструктуры предназначены в качестве рекомендаций по расширению масштабов тестирования для будущих целей эпиднадзора и/или скрининга.

протокол

Исследования, проведенные с целью оптимизации методов для Программы раннего выявления, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Мичиганского государственного университета. Все рисунки были воспроизведены с помощью надуманных образцов и являются репрезентативными для наблюдаемых на людях результатов. Никакие данные, информация или результаты, представленные в рукописи, не принадлежат ни одному из участников Программы раннего выявления Мичиганского государственного университета.

1. Изготовление наборов

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время сборки комплекта всегда надевайте маски, перчатки, средства защиты глаз и лабораторные халаты, чтобы предотвратить загрязнение компонентов набора.

1. Подготовка комплектующих комплекта
   1. С помощью перманентного маркера нарисуйте линию, обозначающую 1 мл на конической трубке объемом 25 мл. С помощью перманентного маркера нарисуйте на передаточной пипетке линию, обозначающую 1 мл.
   2. Добавьте четыре керамических шарика в пробирку с образцом объемом 5 мл. Нанесите 1 мл раствора для стабилизации РНК в пробирку для образца и закройте пробирку. Прикрепите наклейку со штангой, состоящую из уникального идентификационного кода, к пробирке с образцом матричных данных со штрих-кодом сверху и идентификатором, повторяющимся буквенно-цифровым кодом сбоку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Керамические шарики не содержат РНКазы/ДНКазы и не нуждаются в дальнейшей стерилизации.
2. Поместите в коробку коническую пробирку объемом 25 мл, пробирку для образца объемом 5 мл, передаточную пипетку и небольшой пакетик для биологически опасных веществ (дополнительный рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конические трубки не обязательно должны быть свободными от ДНКазы/РНКазы. Целостность образца сохраняется с помощью раствора для стабилизации РНК.

2. Использование набора для самостоятельного сбора проб

1. В соответствии с инструкциями к набору, попросите участников не есть и не пить за 30 минут до предоставления образца. Попросите участников плевать в коническую пробирку объемом 25 мл до тех пор, пока не будет собран 1 мл слюны (отмеченная линия).
2. С помощью пипетки перенесите 1 мл слюны (до отмеченной линии) в пробирку для образца объемом 5 мл, содержащую раствор для стабилизации РНК и керамические шарики. Закройте и встряхните пробирку с образцом в течение 15 с.
3. Попросите участников зарегистрировать буквенно-цифровой код, присвоенный образцу, на соответствующем веб-сайте. После этого попросите их поместить пробирку с образцом в небольшой пакет для биологически опасных веществ и положить в контейнер для сбора.

3. Забор пробы и подготовка к выделению РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы выполняются в шкафу биобезопасности или ведре центрифуги с крышкой с биозащитной оболочкой.

1. Дезинфицируйте и визуально осматривайте образцы для контроля качества, еще находясь в пакете с биологически опасными веществами.
2. Отбраковывайте образец, если (Рисунок 1): образец имеет неестественный цвет (т.е. зеленый, синий) или содержит частицы пищи или крови; проба протекает или отсутствует бусины; образец имеет неправильный ожидаемый объем (<1,5 мл или >3 мл); К образцу не прикреплен штрих-код или буквенно-цифровой код.
   1. Если образец отбракован, отсканируйте и запишите образец в файл отбраковки с пометкой о причине отклонения. Если образец отклоняется из-за отсутствия идентификаторов, зарегистрируйте образец как No Barcode в файле отклонения.
3. Если образец не отбракован, разрежьте ножницами пакет с биологически опасными веществами и извлеките пробирку с образцом. Пробирка находится в вихревом состоянии в течение 15 с, затем поместите пробирку с образцом в адаптер для центрифуги с поворотным ведром.
4. Когда адаптеры пробирок будут заполнены, закройте крышку биозащитной оболочки над ведром центрифуги и передайте в центрифугу. Центрифугируйте образцы при давлении 4 100 x g в течение 2 мин и верните образцы в шкаф биобезопасности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование используется для удаления мусора из гранул и вытеснения большего количества вязкого материала в слюне на дно пробирки. Это устраняет необходимость в протеиназе К в процессе. Полный прогон состоит из 768 образцов (восемь 96-луночных планшетов, заполненных образцом после выделения РНК).
5. Не нарушая гранулированный материал, перенесите пробирки с образцами на штатив на 96 слотов, предварительно помеченный идентификатором прогона, который включает номер штатива (1-8), дату и соответствующую группу, с которой будут объединены/оценены образцы (идентификатор для обозначения группы, т. е. группа А является первым прогоном дня).
6. Когда штативы с 96 пробирками заполнены или не осталось образцов, с помощью ручного сканера штрих-кодов отсканируйте пробирки в файл карты планшета (Дополнительный файл 1 для полных бассейнов; Дополнительный файл 2 для пулов половинного размера). В случае, если штрих-код не работает, используйте буквенно-цифровой код на пробирке для регистрации образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Маска необходима для предотвращения сканирования соседних штрих-кодов. Маску можно изготовить, вырезав отверстие в непрозрачной бумаге, после чего заламинировать ее. Штрихкоды, отсканированные в файл карты пластины, будут отображаться в той же ориентации, что и в штативе на 96 слотов.
7. Распылите на пробирки с образцами в штативе 70% этанола и промокните насухо бумажным полотенцем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протирание трубок вместо протирания может привести к повреждению штрихкодов.
8. Пометьте планшет на 96 лунок емкостью 2 мл с идентификатором прогона. Перелейте 200 мкл образца слюны из каждой пробирки с образцом в соответствующую лунку планшета с 96 лунками. Если образцы слишком вязкие для переноса, вортекс и центрифуга снова центрифугируются. Отклоните образец, если проблема остается.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы слюны могут быть тягучими и оставлять след улитки на пластине во время переноса, если техник не будет осторожен. Это может привести к первоначальным ложным срабатываниям и большему количеству выборок, которые в конечном итоге придется повторно запускать на этапе подтверждения (см. раздел 6).
9. Когда все образцы будут перенесены, накройте планшет на 96 лунок силиконовым ковриком и храните при комнатной температуре. Сохраните и храните штативы на 96 слотов с оставшимися образцами для подтверждения потенциально положительных образцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.

4. Выделение РНК

1. Пометьте 96-луночный картридж с выделением РНК идентификатором Run ID и поместите его поверх пустой пластины для сбора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе пластины с образцами можно извлечь из шкафа биобезопасности.
2. Снимите силиконовый коврик с 96-луночной пластины. Перенесите 400 μL вирусного буфера в каждую лунку планшета с 96 лунками.
3. Смешайте каждый образец, осторожно пипетируя вверх и вниз два-четыре раза, и перенесите весь образец в соответствующую колонку в 96-луночном картридже для выделения РНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смешивание больших объемов приведет к образованию пузырей, которые могут привести к загрязнению соседних скважин при бессистемном выполнении. Преднамеренное смешивание может снизить этот риск и защитить целостность последующей обработки.
4. Центрифугируйте изолирующий картридж РНК в верхней части сборной пластины при давлении 4 100 x g в течение 10 минут, чтобы загрузить образцы в картридж. Перенесите изолирующий картридж РНК на чистую сборную пластину.
5. Добавьте 500 мкл промывочного буфера в каждую лунку картриджа для выделения РНК и центрифугируйте при давлении 4 100 x g в течение 5 минут. Перенесите изолирующий картридж РНК на чистую сборную пластину.
6. Добавьте 500 мкл промывочного буфера в каждую лунку картриджа для выделения РНК и центрифугируйте при давлении 4 100 x g в течение 5 минут. Перенесите изолирующий картридж РНК на чистую сборную пластину.
7. Добавьте 500 мкл 100% этанола в каждую лунку картриджа для выделения РНК и центрифугируйте при давлении 4 100 x g в течение 5 минут. Перенесите изолирующий картридж РНК на чистую сборную пластину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если проба не полностью прошла через колонну на этом этапе, она слишком вязкая или мелкие кусочки мусора в образце засоряют колонну. Образец должен быть полностью удален из картриджа, чтобы не загрязнить последующий процесс объединения, а номер образца должен быть добавлен в файл отбраковки.
8. Центрифугируйте картридж для выделения РНК в верхней части сборной пластины при давлении 4 100 x g в течение 5 минут, чтобы высушить колонки. Перенесите изолирующий картридж РНК на чистую элюирующую пластину с маркировкой Run ID и словом row, затем поместите их поверх чистой пластины для сбора.
9. Добавьте 25 мкл молекулярной воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы, в каждую лунку картриджа для выделения РНК. Центрифугируйте при давлении 4100 x g в течение 10 мин для элюирования РНК. Если образец не полностью элюируется, повторно центрифугируйте образец в течение 5 минут.
10. Переложите элюирующие пластины на предварительно охлажденные холодные пластины и накройте крышкой. Немедленно приступайте к объединению образцов и ОТ-кПЦР.

5. Пулинг образцов и ОТ-кПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс настроен в системе с двумя пластинами (как показано на рисунке 2). Номер пластины элюирующей РНК соответствует номеру полученной пластины столбца и букве строки пластины (A = 1, B = 2, C = 3 и т. д.). В целях деконволюции буква строки пластины столбца будет соответствовать букве строки с пластины элюирования РНК, а номер столбца пластины строки будет соответствовать номеру столбца пластины элюирования РНК. Например, образец в РНК-пластине #6 в положении C4 будет найден в позиции реакционной пластины ряда F4, а в позиции реакционной пластины колонки C6.

1. Пометьте новую элюирующую пластину идентификатором Run и строкой слов и поместите на предварительно охлажденную холодную пластину. Перенесите 10 мкл РНК из каждой лунки на пластине для элюирования ряда в соответствующий ряд на пластине для элюирования колонки, таким образом сделав копию оригинальной элюирующей пластины (рис. 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отмеченные столбцы элюирующих пластин будут объединены в направлении столбца, а отмеченные строки элюирующих пластин будут объединены в направлении строки.
2. Для пулированной пластины столбца перенесите весь объем из каждой лунки через пластину в номер столбца, соответствующий номеру идентификатора запуска. Для объединенной пластины ряда перенесите весь объем из каждой лунки вверх или вниз по пластине в номер ряда, соответствующий номеру идентификатора прогона (1 = A, 2 = B и т. д.; Рисунок 2).
3. Перенесите 13 μL каждого объединенного образца в соответствующую колонку или строку 96-луночного реакционного планшета (Рисунок 2).
4. Для этого протокола используйте три зонда против генов нуклеокапсида (N), ORF1ab и спайка (S) для обнаружения SARS-CoV-2, а также четвертый праймерный зонд, нацеленный на фаг MS2, в качестве внутреннего контроля. В объединенных образцах вставьте положительный фаг MS2 в мастер-микс. В образцах, запускаемых по отдельности, введите фаг MS2 в образец на картридже для выделения РНК и используйте в качестве контроля экстракции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мастер-смесь, праймерные щупы, флуоресцентные красители и гасители будут варьироваться в зависимости от анализа. Соответствующие соотношения и флуоресцентные каналы должны определяться каждой лабораторией.
5. Приготовьте положительный контроль, добавив 2 мкл положительного контрольного раствора и 11 мкл молекулярной воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы, в положительную контрольную лунку на реакционной пластине (рис. 2).
6. Приготовьте контроль без матрицы, добавив 13 мкл молекулярной воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы, в отрицательную контрольную лунку на реакционной пластине.
7. Приготовьте мастер-микс в соответствии с инструкциями производителя и установите положительный контроль фагов MS2. Нанесите по 7 мкл исходной смеси в каждую лунку из 96-луночных реакционных планшетов, содержащих образцы или контрольные пластины. Ограничьте воздействие флуоресцентного света.
8. Накройте реакционные пластины оптической пленкой и заверните в вортекс на 2 минуты, чтобы образцы хорошо перемешались. Центрифугируйте реакционные планшеты при 650 x g в течение 5 мин.
9. Перенесите планшеты в систему ОТ-ПЦР и запустите с параметрами цикла, подходящими для мастер-смеси. Для используемого здесь мастер-микса были выполнены следующие циклы: 25 °C в течение 2 мин, 53 °C в течение 10 мин, 95 °C в течение 2 мин, 40 циклов при 95 °C в течение 3 с и 60 °C в течение 30 с.
10. После запуска выборок выполните деконволюцию пулов, чтобы определить потенциальные положительные выборки вручную (рис. 3) и с помощью приложения R Script Shiny App.
    1. Экспортируйте результаты из реакционных пластин столбцов и строк в виде файлов электронных таблиц. Откройте скрипт деконволюции пула Shiny app (исходный код доступен по адресу: https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP).
    2. Перетащите файлы карты, столбцов и строк в приложение и запустите приложение. Сохраните список, созданный в приложении.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Список, созданный приложением, содержит все штрих-коды, введенные в карту номерных знаков, и то, являются ли они положительными или отрицательными на основе сценария деконволюции пула. Эти образцы, помеченные как потенциально положительные, обрабатываются по отдельности.

6. Валидация положительных проб

1. Промаркируйте две пробирки для микроцентрифуги объемом 1,5 мл и колонку для экстракции РНК для каждого образца, который необходимо исследовать. Используйте одну микроцентрифужную пробирку для смешивания образца, фага MS2 и буфера для вирусной загрузки, а вторую микроцентрифужную пробирку для этапа элюирования РНК.
2. Добавьте 5 мкл фаговой РНК MS2 в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Перенесите 200 мкл потенциально положительного образца в пробирку и добавьте в пробирку 400 мкл буфера для вирусной нагрузки, перемешайте с помощью пипетирования.
3. Перенесите все содержимое в предварительно помеченную колонку для экстракции РНК в чистой пробирке для сбора. Центрифугируйте при 10 000 x g в течение 2 мин. Аспират протекает из сборной трубки.
4. Добавьте 500 мкл промывочного буфера в колонку для экстракции РНК и центрифугируйте при 10 000 x g в течение 2 минут. Аспират протекает из сборной трубки.
5. Добавьте 500 мкл промывочного буфера в колонку для экстракции РНК и центрифугируйте при 10 000 x g в течение 2 минут. Аспират протекает из сборной трубки.
6. Добавьте 500 мкл 100% этанола в колонку для экстракции РНК и центрифугируйте при 10 000 x g в течение 1 минуты. Перенесите колонку для экстракции РНК в чистую сборную пробирку и центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 1 минуты, чтобы высушить колонку.
7. Перенесите колонку для экстракции РНК в предварительно помеченную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для элюирования. Добавьте 25 мкл молекулярной воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы, в колонку для экстракции РНК. Центрифугируйте при 10 000 x g в течение 2 минут, чтобы собрать РНК и перенести трубку во влажный лед.
8. Приготовьте мастер-микс в соответствии с инструкциями производителя. Нанесите по 7 мкл мастер-смеси в каждую лунку 96-луночного реакционного планшета, который будет содержать образец. Перенесите 13 мкл каждой выделенной РНК в реакционный планшет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мастер-микс аналогичен тому, который используется в протоколе объединенного образца, но не включает спайк фагальной РНК MS2.
9. Приготовьте положительный контроль, добавив 2 мкл положительного контрольного раствора и 11 мкл молекулярной воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы, в положительную контрольную лунку на реакционной пластине. Приготовьте контроль без матрицы, добавив 13 мкл молекулярной воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы, в отрицательную контрольную лунку на реакционной пластине.
10. Накройте реакционные пластины оптической пленкой и заведите вихрь на 2 минуты, чтобы образцы хорошо перемешались. Центрифугируйте реакционные планшеты при 650 x g в течение 5 мин. Перенесите планшеты в систему ОТ-ПЦР и запустите с параметрами цикла, подходящими для мастер-смеси.
    1. Для указанного здесь мастер-микса используйте 25 °C в течение 2 мин, 53 °C в течение 10 мин, 95 °C в течение 2 мин, 40 циклов по 95 °C в течение 3 с и 60 °C в течение 30 с.

Результаты

Подавляющее большинство образцов, полученных лабораторией на сегодняшний день, были приняты и прошли начальный этап визуального контроля качества. Необходимость отбраковки образца ограничена причинами, которые могут негативно повлиять на обработку образца и/или о?...

Обсуждение

Во время обработки образца есть этапы, требующие тщательного внимания. Начальный этап контроля качества, на котором проверяется объем, консистенция, цвет и наличие добавленных гранул образца, имеет решающее значение для общего успеха процесса. Пробирки с образцами, к...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Step MM, no ROX	Thermo Fisher	A28523
1.2 mlDeep well Plates	Fisher	AB0564
100 mL reagent reservoirs	Corning	4872
2.8 mm Ceramic Beads	OMNI	19-646
25 ml conical w/screw cap	VWR	76338-496
50mL V bottom reservoirs	Costar	4870
5430-High-Speed Centrifuge	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf Tube	Fisher	14282300
8 strip tubes for QuantStudio	life technologies	4316567
Beta Mercaptoethanol	Fisher	AC125472500
Ethanol 200 Proof, Molecular Biology Grade	Fisher	BP28184
Microamp Endura Optical 96-well fast clear reaction plate with barcode	life technologies	4483485
Microamp Fast Optical 96 well plate	Fisher	4346906
Mini Microcentrifuge	Corning Medical	6770
optical caps for strip tubes	life technologies	AB-1820
Optical Film	Thermo Fisher	4311971
PCR plate sealing film Non-optical	Fisher	AB-0558
PCR Plate semi-skirted	Fisher	14230244
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
Quick RNA Viral Kit confirmation	Zymo	R1035
Reagent Reservoir, 100ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
Small Biohazard Bags	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19 kit	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrifuge	Thermo Fisher	75009525
Transfer Pipet	Fisher	22170404
Viral 96 Kit	Zymo	R1041
Vortex Mixer	Fisher	2215414