JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול נועד לשמש כתוכנית לאוניברסיטאות וארגונים אחרים השוקלים בדיקות בקנה מידה גדול ל-SARS-CoV-2 או לפתח תוכניות מוכנות להתפרצויות נגיפיות עתידיות.

Abstract

זיהוי ובידוד של אנשים מדבקים יחד עם בידוד של מגעים קרובים, הם קריטיים להאטת התפשטות COVID-19. בדיקות בקנה מידה גדול ביכולת מעקב או סינון לנשאים א-סימפטומטיים של COVID-19 מספקות הן נתונים על התפשטות הנגיף והן את יכולת המעקב לבדוק במהירות אנשים במהלך חשד להתפרצויות. תוכנית הגילוי המוקדם של COVID-19 באוניברסיטת מישיגן סטייט משתמשת בבדיקות בקנה מידה גדול ביכולת מעקב או סינון מאז סתיו 2020. השיטות המותאמות כאן מנצלות את האמינות, נפח הדגימה הגדול ויתרונות האיסוף העצמי של הרוק, בשילוב עם תוכנית איגום דו-ממדית חסכונית המשמרת ריאגנטים. התהליך תוכנן להיות מותאם למחסור באספקה, כאשר רכיבים רבים של הערכות והבדיקה מוחלפים בקלות. ניתן להתאים את התהליכים המתוארים לאיסוף ועיבוד דגימות SARS-CoV-2 כדי לבדוק פתוגנים נגיפיים עתידיים המתבטאים באופן אמין ברוק. על ידי מתן תוכנית זו לאוניברסיטאות או לארגונים אחרים, ניתן לפתח תוכניות מוכנות להתפרצויות ויראליות עתידיות.

Introduction

מגיפת COVID-19, הנגרמת על ידי נגיף SARS-CoV-2, גרמה למותם של למעלה מ-6.2 מיליון בני אדם עד כה, כאשר המספרים עולים מדי יום1. תקן הזהב לבדיקת SARS-CoV-2 הוא PCR כמותי בזמן אמת (RT-q), עם פריימרים שנועדו למקד את הגנום הנגיפי, כגון נוקלאוקפסיד, מעטפת, ספייק וגנים RNA פולימראז תלויי RNA2. בתחילת המגיפה, הייתה מחסור חמור ביכולת מספקת לבדיקות SARS-CoV-2. זה נבע מהיעדר בדיקות מאומתות, רכיבי בדיקה, כוח אדם קליני ותשתית שאינה מוכנה להתרחב במהירות כדי להתאים לבדיקות המוניות ברמת המגיפה. בשל מחסור, מרכזי בדיקה דרשו לעתים קרובות הפניית רופא כדי להיות כשירים לבדיקה. מחסור זה הביא לעיכובים באישור הבדיקות, תורים ארוכים לאיסוף דגימות אף לא נוח וזמני המתנה ארוכים לתוצאות. בנוסף, בגלל אילוצים אלה, מאמצי הבדיקה לא יכלו להכיל נשאים טרום-סימפטומטיים, קלים או אסימפטומטיים המפיצים ללא ידיעתם את SARS-CoV-2. היעדר בדיקות נגישות ונרחבות ככל הנראה תרם להתפשטות בלתי מבוקרת של COVID-19.

ניתן לבצע בדיקות מרווחים בקנה מידה גדול כמעקב או כהקרנה. ניתן להשתמש בשניהם כדי לנטר שיעורי חיוביים מקומיים באזורי הדבקה בצפיפות גבוהה או בסיכון גבוה וניתן להשתמש בהם כדי לקבל החלטות בבריאות הציבור. בדיקות מעקב נועדו לנטר את שכיחות ושכיחות המחלה באוכלוסייה ואינן משמשות לאבחון פרטני3. תוצאות המעקב בדרך כלל אינן מזוהות ואינן מוחזרות למשתתפים; מעבדות המבצעות בדיקות מעקב אינן צריכות להיות מוסמכות קלינית, והן אינן נדרשות להשתמש בבדיקה מאושרת על ידי ה-FDA. הבדיקה מאפשרת להחזיר את התוצאות למשתתפים בודדים, אך מעבדות סינון בארצות הברית חייבות להיות בעלות אישור תיקונים לשיפור מעבדה קלינית (CLIA) ולעמוד בכל דרישות ה-CLIA הרלוונטיות.

תוכנית הגילוי המוקדם של אוניברסיטת מישיגן סטייט (MSU) החלה בספטמבר 2020 ועיבדה למעלה מ-350,000 דגימות. התוכנית צמחה מתוך מאמציה של קבוצת מחקר לתכנן בדיקת SARS-CoV-2 רגישה ביותר שלא דרשה אספקת בדיקה בביקוש גבוה 4,5,6,7,8. המטרות היו לסייע למעבדות קליניות להגדיל את הקיבולת ולפתח תהליכים גמישים כדי להתאים למחסור באספקה, תוך פיתוח אסטרטגיית סינון להקמת תוכנית חזרה לעבודה עבור מכללת MSU לרפואה אנושית. המאמצים הראשוניים התמקדו בשיטות איסוף, מיצוי וכימות חלופיות עבור SARS-CoV-2. ביקוש גבוה ומחסור במקלוני אף לוע הובילו להערכה של דגימות נארס קדמיות שנאספו עם ספוגיות בוקאליות, ומחסור בריאגנטים הביא לפיתוח שיטת מיצוי דגימות המותאמת מדיווחים מוקדמים מווהאן, סין9. כדי להגביר את הרגישות לזיהוי SARS-CoV-2 בדגימות נארס קדמיות, הוחלף PCR דיגיטלי טיפתי ב-RT-qPCR 6,7. למרות ש-PCR דיגיטלי טיפתי רגיש מאוד ויכול לספק ערכים מוחלטים עם קריאת נקודות קצה, נקבע כי השימוש בו אינו אפשרי לבדיקות בקנה מידה גדול בשל היעדר מכשור אמין בעל תפוקה גבוהה לטכנולוגיה. בנוסף, איסוף עצמי של דגימות נרס קדמיות על סמך רמות RNase P אנושי היה משתנה ביותר, מה שמרמז על כך שהוא לא היה אמין מספיק לבדיקה המונית.

אלטרנטיבה לספוגיות אף ולוע וקדמיות היא איסוף הרוק. וירוסים נשימתיים כגון SARS-CoV, H1N1 ו-MERS זוהו כולם באופן היסטורי ברוק 10,11,12,13. זה הוכח לאחר מכן כנכון עבור SARS-CoV-2 14,15,16,17. השוואה ישירה בין דגימות רוק לאף הראתה שהרוק מניב טיטרים נגיפיים גבוהים יותר מאשר ספוגיות אף בדגימות תואמות, וכי הרוק פחות משתנה עם איסוף דגימות חוזרות14. כמו כן, דווח כי הרוק רגיש יותר בווריאנטים מסוימים, כמו אומיקרון, בהשוואה לדלתא16. יתרונות נוספים לאיסוף הרוק הם הקלות היחסית של איסוף עצמי מחוץ לאתר ללא אספקה בעלת ביקוש גבוה, היכולת לבדוק שוב ושוב את הדגימה במידת הצורך, ביטול דרישות כוח האדם באתר לאיסוף דגימות, והימנעות מתורים של משתתפים שעלולים להגביר את הפוטנציאל להעברת ויראלי. ערכת הרוק שהורכבה במעבדה פותחה כשיתוף פעולה בין מפתחי בדיקות מעבדה, מומחים בבית הספר לאריזה, מומחי מיתוג אוניברסיטאיים, קציני בטיחות ושותפי ייצור חיצוניים שייצרו את הקופסה ומערכת התיוג.

בעוד שדגימות רוק מציעות חומר מוצא גנטי בשפע ו-RT-qPCR מספק תוצאות רגישות ואמינות, עלות הריאגנטים (פריימר/בדיקות ותערובת מאסטר) הפכה את הבדיקה בקנה מידה גדול של דגימות בודדות למאמץ יקר על בסיס פרט, על בסיס דגימה. מכיוון שהפריימר/בדיקות ותערובת המאסטר הם המרכיבים היקרים ביותר בתהליך, המטרה הייתה לחפש פתרונות שימתחו את השימוש בהם ולכן יפחיתו את העלות לדגימה. אופטימיזציה מערכתית של גודל מאגר המדגם על סמך שכיחות בקהילה ורגישות לבדיקה הוצעה לבדיקת SARS-CoV-218. עם זאת, כאשר בריכות בכל גודל מצביעות על נוכחות של SARS-CoV-2, יש לבדוק מחדש את כל המשתתפים במאגר, וכתוצאה מכך אובדן זמן והזדמנויות מוגברות להתפשטות. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, נעשה שימוש בשיטת איגום דו-ממדית, כמו התהליך שהוצע על ידי Zilinskas ואחרים19 לביצוע מעבר ראשון תחת המגבלות של בדיקות מעקב. בתהליך זה, 96 דגימות בודדות מונחות בצלחת של 96 בארות המורכבת מ-12 עמודות ושמונה שורות. כל דגימה כלולה במאגר של שמונה ומאגר של 12 על שתי לוחות תגובה שונים. התוצאה היא שכל דגימה מיוצגת באופן ייחודי עם שני המאגרים. דה-קונבולוציה של המאגרים על סמך הקואורדינטות מזהה דגימות חיוביות פוטנציאליות. דגימות בבריכות שבהן לא זוהה SARS-CoV-2, אינן עוברות מבדיקות מעקב לבדיקה. בינתיים, דגימות מאנשים שנמצאו חיוביים בתהליך המעקב מופקות מחדש באמצעות תהליך סינון שאושר על ידי CLIA. אם מאומתים חיוביים, אנשים מקבלים את התוצאה, מופנים למשרד הרופא של האוניברסיטה, מתחיל מעקב אחר מגעים ומחלקת הבריאות מקבלת הודעה. בסך הכל, הדגימה של אדם נבדקת בשלוש תגובות נפרדות לפני שהיא מוכרזת חיובית, פעמיים במאגרי מעקב ופעם אחת כמסך אישור יחיד, מה שמפחית את הסיכוי לתוצאה חיובית כוזבת. איגום דגימות משתמש ב~80% פחות ריאגנטים מאשר הפעלת דגימות בנפרד, וכתוצאה מכך עלות של ~$12 לדגימה.

מעבר לערכת הרוק, אסטרטגיית האיגום ותהליך פיתוח הבדיקות, הצוות פיתח גם תוכנית לוגיסטית לחלוקת ערכות, איסוף דגימות ודיווח תוצאות. המשתתפים בתוכנית אוספים את הערכה שלהם, רושמים את הקוד האלפאנומרי הייחודי על השפופרת שלהם, מייצרים את הדגימה שלהם ומפקידים אותה באחד מפחי ההורדה הרבים, שם הם נאספים מדי יום ומועברים למעבדה. המעבדה מעבדת את הדגימות, המפקח הטכני בודק ומעלה תוצאות, והמשתתפים מקבלים הודעה לבדוק את פורטל התוצאות. לתהליך זה יש זמן אספקה של 24-48 שעות מרגע הפקדת הדגימה. שיתוף הפעולה מכל חלקי המוסד היה המפתח ליישום מוצלח בקנה מידה גדול של תהליך מעקב וסינון היברידי זה. הנהלים והתיאורים הבאים של תוכנית הבדיקה והתשתית הדרושה נועדו לשמש כתוכניות כיצד להרחיב את הבדיקות למטרות מעקב ו/או סינון עתידיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקרים שבוצעו כדי לייעל את השיטות לתוכנית הגילוי המוקדם אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת מישיגן. כל הנתונים שוחזרו עם דגימות מומצאות ומייצגים את התוצאות האנושיות שנצפו. שום נתונים, מידע או תוצאות המוצגים בכתב היד אינם מאף משתתף בתוכנית הגילוי המוקדם של אוניברסיטת מישיגן.

1. ייצור ערכות

הערה: במהלך הרכבת הערכה, יש ללבוש מסכות, כפפות, מגן עיניים ומעילי מעבדה בכל עת כדי למנוע זיהום ברכיבי הערכה.

  1. הכנת רכיבי הערכה
    1. בעזרת טוש קבוע, צייר קו המציין 1 מ"ל על הצינור החרוטי של 25 מ"ל. בעזרת טוש קבוע, צייר קו המציין 1 מ"ל על צינור ההעברה.
    2. הוסף ארבעה חרוזי קרמיקה לצינור הדגימה של 5 מ"ל. הכניסו 1 מ"ל של תמיסת ייצוב RNA לתוך צינור הדגימה וסגרו את הצינור. צרף מדבקת משקולת המורכבת מקוד זיהוי ייחודי לצינור הדגימה עם ברקוד מטריצת הנתונים בחלקו העליון והמזהה חוזר על עצמו בקוד אלפאנומרי בצד.
      הערה: חרוזי הקרמיקה נטולי RNase/DNase ואין צורך לעקר אותם עוד יותר.
  2. הנח צינור חרוטי של 25 מ"ל, צינור דגימה של 5 מ"ל, פיפט העברה ושקית ביולוגית קטנה לתוך קופסת הערכה (איור משלים 1).
    הערה: צינורות חרוטיים אינם צריכים להיות נטולי DNase/RNase. שלמות הדגימה נשמרת על ידי תמיסת ייצוב ה- RNA.

2. הערכה משמשת לאיסוף דגימה עצמית

  1. בהתאם להוראות הערכה, בקשו מהמשתתפים לא לאכול או לשתות 30 דקות לפני מתן דגימה. בקשו מהמשתתפים לירוק לתוך הצינור החרוטי של 25 מ"ל עד שנאסף 1 מ"ל רוק (קו מסומן).
  2. בעזרת הפיפט, העבירו 1 מ"ל רוק (עד לקו המסומן) לתוך צינור הדגימה של 5 מ"ל המכיל תמיסת ייצוב RNA וחרוזי קרמיקה. סגור ונער את צינור הדגימה למשך 15 שניות.
  3. בקשו מהמשתתפים לרשום את הקוד האלפאנומרי שהוקצה לדגימה באתר הייעודי. לאחר שתסיים, בקש מהם להניח את צינור הדגימה בשקית ביולוגית קטנה ולהפקיד בפח איסוף.

3. צריכת דגימות והכנה לבידוד RNA

הערה: כל השלבים מתבצעים בארון בטיחות ביולוגית או בדלי צנטריפוגה עם מכסה הכלה ביולוגית.

  1. חיטוי ובדיקה ויזואלית של דגימות לבקרת איכות בעודן בשקית הסכנה הביולוגית.
  2. דחו את הדגימה אם (איור 1): הדגימה היא בצבע לא טבעי (כלומר, ירוק, כחול) או מכילה חלקיקי מזון או דם; הדגימה דולפת או חסרה חרוזים; לדגימה יש נפח צפוי שגוי (<1.5 מ"ל או >3 מ"ל); לדוגמא לא מצורף ברקוד או קוד אלפאנומרי.
    1. אם הדגימה נדחתה, סרוק ורשום את הדגימה בקובץ דחייה עם הערה מדוע הדגימה נדחתה. אם הדגימה נדחית מכיוון שאין לה מזהים, רשום את הדגימה כללא ברקוד בקובץ הדחייה.
  3. אם הדגימה לא נדחתה, חתוך את שקית הסכנה הביולוגית במספריים והסר את צינור הדגימה. מערבל את הצינור למשך 15 שניות ואז הנח את צינור הדגימה לתוך מתאם צינור לצנטריפוגה של דלי נדנדה.
  4. לאחר שמתאמי הצינור מלאים, אבטח את מכסה ההכלה הביולוגית מעל דלי הצנטריפוגה והעביר לצנטריפוגה. דגימות צנטריפוגה ב-4,100 x גרם למשך 2 דקות והחזרת דגימות לארון הבטיחות הביולוגית.
    הערה: צנטריפוגה משמשת לגלולה של פסולת ודחיפה של חומר צמיג יותר ברוק לתחתית הצינור. זה מבטל את הצורך בחלבון K בתהליך. ריצה מלאה מורכבת מ-768 דגימות (שמונה צלחות של 96 בארות מלאות בדגימה לאחר בידוד RNA).
  5. מבלי להפריע לחומר הגלולה, העבר את צינורות הדגימה למתלה צינורות עם 96 חריצים המסומן מראש עם מזהה ההפעלה הכולל את מספר המתלה (1-8), התאריך והקבוצה המתאימה איתה יאוגדו הדגימות / יוערכו (מזהה לציון הקבוצה, כלומר, קבוצה A היא הריצה הראשונה של היום).
  6. כאשר מדפי צינורות 96 חריצים מלאים או שלא נותרו דגימות, באמצעות סורק ברקוד כף יד, סרוק צינורות לקובץ מפת צלחת (קובץ משלים 1 למאגרים מלאים; תיק משלים 2 לבריכות בגודל חצי). במקרה שברקוד לא עובד, השתמש בקוד האלפאנומרי על השפופרת כדי לרשום את הדגימה.
    הערה: נדרשת מסיכה כדי למנוע סריקה של ברקודים סמוכים. ניתן להכין מסכה על ידי חיתוך חור בנייר אטום ואז למינציה שלה. ברקודים שנסרקו לקובץ מפת הלוחות יופיעו באותו כיוון כמו במדף 96 החריצים.
  7. מרססים את צינורות הדגימה במדף עם 70% אתנול ומייבשים במגבת נייר.
    הערה: ניגוב הצינורות במקום לטפוח עלול לגרום נזק לברקודים.
  8. סמן צלחת באר בעומק 96 עם קיבולת באר של 2 מ"ל עם מזהה ההפעלה. העבר 200 מיקרוליטר של דגימת רוק מכל צינור דגימה לבאר המתאימה של צלחת הבאר בעומק 96. אם הדגימות צמיגות מכדי להעביר, מערבולת וצנטריפוגה שוב. דחה דגימה אם הבעיה נשארת.
    הערה: דגימות רוק יכולות להיות חוטיות ולהשאיר שובל חילזון על פני הצלחת במהלך ההעברה אם הטכנאי אינו זהיר. זה יכול להוביל לתוצאות חיוביות שגויות ראשוניות ולדגימות נוספות שבסופו של דבר יצטרכו להריץ מחדש בשלב האישור (ראה סעיף 6).
  9. כאשר כל הדגימות מועברות, מכסים את צלחת הבאר בעומק 96 במחצלת סיליקון ושומרים בטמפרטורת החדר. שמור ואחסן את מדפי 96 החריצים עם הדגימות הנותרות לאישור דגימות שעלולות להיות חיוביות.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

4. בידוד RNA

  1. סמן מחסנית בידוד RNA של 96 בארות עם מזהה ההפעלה והנח אותה על גבי לוחית איסוף ריקה.
    הערה: בשלב זה ניתן להסיר צלחות המכילות דגימות מארון הבטיחות הביולוגית.
  2. הסר את שטיח הסיליקון מצלחת הבאר העמוקה 96. העבירו 400 מיקרוליטר של מאגר טעינה ויראלית לכל באר בצלחת 96 הבארות העמוקות.
  3. מערבבים כל דגימה על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה פעמיים עד ארבע פעמים ומעבירים את כל הדגימה לעמודה המתאימה במחסנית בידוד ה-RNA של 96 בארות.
    הערה: ערבוב נפחים גדולים ייצור בועות שעלולות להוביל לזיהום בארות שכנות אם יבוצע באופן אקראי. ערבוב בצורה מכוונת יכול להפחית את הסיכון הזה ולהגן על שלמות העיבוד במורד הזרם.
  4. צנטריפוגה את מחסנית בידוד ה-RNA על גבי לוחית האיסוף ב-4,100 x גרם למשך 10 דקות כדי לטעון דגימות על המחסנית. העבר את מחסנית בידוד ה-RNA לצלחת איסוף נקייה.
  5. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל באר של מחסנית בידוד ה-RNA והצנטריפוגה ב-4,100 x גרם למשך 5 דקות. העבר את מחסנית בידוד ה-RNA לצלחת איסוף נקייה.
  6. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל באר של מחסנית בידוד ה-RNA והצנטריפוגה ב-4,100 x גרם למשך 5 דקות. העבר את מחסנית בידוד ה-RNA לצלחת איסוף נקייה.
  7. הוסף 500 מיקרוליטר של 100% אתנול לכל באר של מחסנית בידוד ה-RNA והצנטריפוגה ב-4,100 x גרם למשך 5 דקות. העבר את מחסנית בידוד ה-RNA לצלחת איסוף נקייה.
    הערה: אם המדגם לא עבר את העמודה במלואה בשלב זה, הדגימה צמיגה מדי או שחתיכות קטנות של פסולת בדגימה סותמות את העמודה. יש להסיר את הדגימה לחלוטין מהמחסנית כדי לא לזהם את תהליך האיגום במורד הזרם, ולהוסיף את מספר המדגם לקובץ הדחייה.
  8. צנטריפוגה את מחסנית בידוד ה-RNA על גבי לוחית האיסוף ב-4,100 x גרם למשך 5 דקות לייבוש העמודים. העבר את מחסנית בידוד ה-RNA על לוחית פליטה נקייה המסומנת במזהה ההפעלה ובשורת המילה, ולאחר מכן הנח את שניהם על גבי לוחית איסוף נקייה.
  9. הוסף 25 מיקרוליטר של מים בדרגה מולקולרית נטולת DNase/RNase לכל באר של מחסנית בידוד ה-RNA. צנטריפוגה ב-4,100 x גרם למשך 10 דקות כדי לחסל את ה-RNA. אם הדגימה אינה נפלטת לחלוטין, צנטריפוגה מחדש את הדגימה למשך 5 דקות.
  10. מעבירים את צלחות הפליטה לצלחות קרות שצוננו מראש ומכסים. המשך מיד לאיגום דגימות ו-RT-qPCR.

5. איגום דוגמאות ו-RT-qPCR

הערה: התהליך מוגדר במערכת דו-צלחות (כפי שניתן לראות באיור 2). מספר לוחית ה-RNA של הפליטה תואם את מספר לוחית העמודה המיוצר ואת אות לוחית השורה (A = 1, B = 2, C = 3 וכו'). למטרות דה-קונבולוציה, אות השורה של לוחית העמודה תתאים לאות השורה מלוחית שטיפת ה-RNA, ומספר העמודה של לוחית השורה יתאים למספר העמודה של לוחית הפליטה של ה-RNA. לדוגמה, דגימה בלוחית RNA #6 במיקום C4 תימצא במיקום לוחית התגובה בשורה F4, ובמיקום לוחית התגובה של העמודה C6.

  1. סמן לוחית פליטה חדשה עם מזהה ההפעלה ושורת המילה, והניח על צלחת קרה מקוררת מראש. העבירו 10 μL של RNA מכל באר על לוחית הפליטה של השורה לשורה המתאימה על לוחית הפליטה של העמודה, ובכך יוצרים עותק של לוחית הפליטה המקורית (איור 2).
    הערה: לוחות הפליטה המסומנים בעמודה יאוגדו בכיוון העמודה ולוחות הפליטה המסומנים בשורה יאוגדו בכיוון השורה.
  2. עבור לוחית העמודה המאגרת, העבר את כל הנפח מכל באר על פני הלוח למספר העמודה המתאים למספר לוחית הזיהוי של ההפעלה. עבור לוחית השורה המצורפת, העבר את כל הנפח מכל באר למעלה או למטה בלוח למספר השורה המתאים למספר לוחית זיהוי ההפעלה (1 = A, 2 = B וכו'; איור 2).
  3. העבירו 13 μL מכל דגימה מאוגדת לתוך העמודה או השורה המתאימה של לוחית תגובה של 96 בארות (איור 2).
  4. עבור פרוטוקול זה, השתמש בשלוש בדיקות כנגד הגנים נוקלאוקפסיד (N), ORF1ab וספייק (S) כדי לזהות SARS-CoV-2, ובדיקה רביעית המכוונת לפאג' MS2 כבקרה פנימית. בדגימות המאוגדות, הכניסו בקרה חיובית של פאג' MS2 לתערובת המאסטר. בדגימות המופעלות בנפרד, ספייק פאג' MS2 לתוך הדגימה על מחסנית בידוד ה-RNA והשתמש כבקרת מיצוי.
    הערה: תערובת מאסטר, בדיקות פריימר, צבעי פלורסנט ומרווה ישתנו בהתאם לבדיקה. יש לקבוע יחסים מתאימים ותעלות פלואורסצנטיות על ידי כל מעבדה.
  5. הכינו את הבקרה החיובית על ידי הוספת 2 μL של תמיסת בקרה חיובית ו-11 μL של מים בדירוג מולקולרי נטול-DNase/RNase לבאר הבקרה החיובית על לוחית התגובה (איור 2).
  6. הכן את הבקרה ללא תבנית על ידי הוספת 13 מיקרוליטר של מים בדרגה מולקולרית נטולת DNase/RNase לבאר הבקרה השלילית על לוחית התגובה.
  7. הכינו תערובת מאסטר בהתאם להוראות היצרן והגדילו את השליטה החיובית בפאג'ים MS2. הוצא 7 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לכל באר של לוחות התגובה של 96 הבארות המכילות דגימות או בקרות. הגבל את החשיפה לאור פלורסנט.
  8. מכסים את לוחות התגובה בסרט אופטי ומערבולת למשך 2 דקות כדי לערבב היטב דגימות. צלחות תגובת צנטריפוגה ב 650 x גרם למשך 5 דקות.
  9. העבירו את הלוחות למערכת RT-PCR ופעלו עם פרמטרי רכיבה המתאימים לתערובת המאסטר. עבור תערובת מאסטר המשמשת כאן, הופעלו המחזורים הבאים: 25 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 53 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
  10. לאחר הפעלת הדגימות, בצע דה-קונבולוציה של המאגרים כדי לזהות דגימות חיוביות פוטנציאליות באופן ידני (איור 3) ובאמצעות אפליקציית R Script Shiny.
    1. ייצא תוצאות מלוחות תגובה של עמודות ושורות כקובצי גיליון אלקטרוני. פתח את אפליקציית סקריפט Deconvolution R של המאגר (קוד מקור זמין בכתובת: https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP).
    2. גרור ושחרר את מפת הלוחות, העמודות וקבצי השורות לאפליקציה והפעל את האפליקציה. שמור את הרשימה שהופקה מהיישום.
      הערה: הרשימה המופקת מהאפליקציה מכילה את כל הברקודים שהוזנו למפת הלוחות והאם הם ככל הנראה חיוביים או שליליים על סמך סקריפט פירוק הבריכה. דגימות אלה שסומנו כחיוביות פוטנציאליות מעובדות מחדש בנפרד.

6. אימות דגימות חיוביות

  1. סמן שני צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ועמודת מיצוי RNA עבור כל דגימה שצריך לבדוק. השתמש בצינור מיקרו-צנטריפוגה אחד לערבוב דגימה, פאג' MS2 ומאגר טעינה ויראלי, ובצינור המיקרו-צנטריפוגה השני לשלב שטיפת ה-RNA.
  2. הוסף 5 מיקרוליטר של MS2 Phage RNA לצינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. העבירו 200 מיקרוליטר מהדגימה החיובית הפוטנציאלית לצינור והוסיפו 400 מיקרוליטר של מאגר טעינה ויראלית לצינור, ערבבו על ידי פיפטינג.
  3. העבירו את כל התוכן לעמודת מיצוי ה-RNA המסומנת מראש בצינור איסוף נקי. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם למשך 2 דקות. לשאוף לזרום דרך צינור האיסוף.
  4. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמודת מיצוי ה-RNA והצנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 2 דקות. לשאוף לזרום דרך צינור האיסוף.
  5. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמודת מיצוי ה-RNA והצנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 2 דקות. לשאוף לזרום דרך צינור האיסוף.
  6. הוסף 500 מיקרוליטר של 100% אתנול לעמודת מיצוי ה-RNA והצנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה אחת. העבירו את עמודת מיצוי ה-RNA לצינור איסוף נקי וצנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה אחת לייבוש העמודה.
  7. העבר את עמודת מיצוי ה-RNA לצינור מיקרו-צנטריפוגה מסומן מראש בנפח 1.5 מ"ל לצורך פליטה. הוסף 25 מיקרוליטר של מים בדרגה מולקולרית ללא DNase/RNase לעמודת מיצוי RNA. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 2 דקות לאיסוף ה-RNA והעברת הצינור לקרח רטוב.
  8. הכינו תערובת מאסטר לפי הוראות היצרן. הוציאו 7 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לכל באר של צלחת תגובה של 96 בארות שתכיל את הדגימה. מעבירים 13 מיקרוליטר מכל RNA מבודד לתוך לוחית התגובה.
    הערה: תערובת המאסטר זהה לזו המשמשת בפרוטוקול הדגימה המאוחדת, אך אינה כוללת את ספייק ה-RNA של פאג' MS2.
  9. הכן את הבקרה החיובית על ידי הוספת 2 מיקרוליטר של תמיסת בקרה חיובית ו-11 מיקרוליטר של מים בדרגה מולקולרית נטולת DNase/RNase לבאר הבקרה החיובית על לוחית התגובה. הכן את הבקרה ללא תבנית על ידי הוספת 13 מיקרוליטר של מים בדרגה מולקולרית נטולת DNase/RNase לבאר הבקרה השלילית על לוחית התגובה.
  10. מכסים את לוחות התגובה בסרט אופטי ומערבולת למשך 2 דקות כדי לערבב היטב דגימות. צלחות תגובת צנטריפוגה ב 650 x גרם למשך 5 דקות. העבירו את הלוחות למערכת RT-PCR ופעלו עם פרמטרי רכיבה המתאימים לתערובת המאסטר.
    1. עבור תערובת מאסטר המצוינת כאן, השתמש ב-25 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 53 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הרוב המכריע של הדגימות שהתקבלו במעבדה עד כה התקבלו ועברו את שלב בקרת האיכות החזותי. הצורך לדחות דגימה מוגבל לסיבות שיכולות להשפיע לרעה על עיבוד הדגימה ו/או על התוצאות הכוללות של הדגימה. באופן ספציפי, נפח שגוי בשפופרת, עקביות או צבע שאינם טבעיים לרוק, היעדר חרוזי קרמיקה המ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במהלך עיבוד הדגימה, ישנם שלבים הדורשים תשומת לב מדוקדקת. שלב בקרת האיכות הראשוני הבוחן את נפח הדגימה, העקביות, הצבע והנוכחות של חרוזים נוספים הוא קריטי להצלחה הכוללת של התהליך. שפופרות עם דגימות שאינן מכילות את הכמות הנכונה של רוק עלולות לייצר תוצאה שלילית כוזבת, מכיוון ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין גילויים כספיים לגבי השיטות, האספקה, הציוד או הריאגנטים.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות למשתתפים במחקרים שאושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת מישיגן סטייט ששימשו לאופטימיזציה של השיטות (STUDY00004265, STUDY00004383, STUDY00005109), כמו גם לאלה שיצאו לאסוף דגימות ששימשו לבדיקת השיטות (ד"ר קייטי מילר, אנה סטול, בריאן דיילי, ד"ר קלאודיה פינקלשטיין). מאמץ זה נתמך על ידי אוניברסיטת מישיגן סטייט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 Step MM, no ROXThermo FisherA28523
1.2 mlDeep well PlatesFisherAB0564
100 mL reagent reservoirsCorning4872
2.8 mm Ceramic BeadsOMNI19-646
25 ml conical w/screw capVWR76338-496
50mL V bottom reservoirsCostar4870
5430-High-Speed CentrifugeEppendorf22620601
5ml Eppendorf TubeFisher14282300
8 strip tubes for QuantStudiolife technologies4316567
Beta MercaptoethanolFisherAC125472500
Ethanol 200 Proof, Molecular Biology GradeFisherBP28184
Microamp Endura Optical 96-well fast clear reaction plate with barcodelife technologies4483485
Microamp Fast Optical 96 well plateFisher4346906
Mini MicrocentrifugeCorning Medical6770
optical caps for strip tubeslife technologiesAB-1820
Optical FilmThermo Fisher4311971
PCR plate sealing film Non-opticalFisherAB-0558
PCR Plate semi-skirtedFisher14230244
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.1 mLThermo FisherA28136
Quick RNA Viral Kit confirmationZymoR1035
Reagent Reservoir, 100mlDOT229298
RNA ShieldZymoR1200-1L
Small Biohazard BagsFisher180000
Taqpath RTPCR COVID19 kitThermo FisherA47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus CentrifugeThermo Fisher75009525
Transfer PipetFisher22170404
Viral 96 KitZymoR1041
Vortex MixerFisher2215414

References

  1. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , Available from: https://covid19.who.int/ (2022).
  2. John Hopkins Center for Health Security. Center for Health Security. Comparison of National RT-PCR primers, probes, and protocols for SARS-CoV-2 diagnostics. John Hopkins Center for Health Security. , Centerforhealthsecurity.Org 5(2020).
  3. Oleske, D. M. Screening and surveillance for promoting population health. Epidemiology and the Delivery of Health Care Services. , Springer. MA. 131-150 (2009).
  4. Patterson, J. R., Cole-Strauss, A., Beck, J. S., Sortwell, C. E., Lipton, J. W. Isolation of SARS-Cov2 RNA from humans without high demand reagents. protocols.io. , (2020).
  5. Patterson, J. R., Cole-Strauss, A., Beck, J. S., Sortwell, C. E., Lipton, J. W. Modified nasal swab for detection of Sars-Cov2. protocols.io. , (2020).
  6. Patterson, J. R., Cole-Strauss, A., Beck, J. S., Sortwell, C. E., Lipton, J. W. Detection of Sars-Cov2 using droplet digital PCR. protocols.io. , (2020).
  7. Patterson, J. R., Cole-Strauss, A., Beck, J. S., Sortwell, C. E., Lipton, J. W. Detection of Sars-Cov2 using qPCR. protocols.io. , (2020).
  8. Patterson, J. R., Cole-Strauss, A., Beck, J. S., Sortwell, C. E., Lipton, J. W. Detection of SARS-Cov2 without high demand reagents (singleplex assays). protocols.io. , (2020).
  9. Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
  10. Wang, W. K., et al. Detection of SARS-associated coronavirus in throat wash and saliva in early diagnosis. Emerging Infectious. Diseases. 10 (7), 1213-1219 (2004).
  11. Niedrig, M., Patel, P., El Wahed, A. A., Schädler, R., Yactayo, S. Find the right sample: A study on the versatility of saliva and urine samples for the diagnosis of emerging viruses. BMC Infectious. Disease. 18 (1), 707(2018).
  12. Bilder, L., MacHtei, E. E., Shenhar, Y., Kra-Oz, Z., Basis, F. Salivary detection of H1N1 virus: A clinical feasibility investigation. Journal of Dental Research. 90 (9), 1136-1139 (2011).
  13. To, K. K. W., et al. Saliva as a diagnostic specimen for testing respiratory virus by a point-of-care molecular assay: a diagnostic validity study. Clinical Microbiology and Infection. 25 (3), 372-378 (2019).
  14. Wyllie, A. L., et al. Saliva or nasopharyngeal swab specimens for detection of SARS-CoV-2. New England Journal of Medicine. 383 (13), 1283-1286 (2020).
  15. Novel Coronavirus Information Center. , ELSEVIER. Available from: https://www.elsevier.com/connect/coronavirus-information-center (2021).
  16. Marais, G., Hsiao, N., Iranzadeh, A., Doolabh, D., Enoch, A. Saliva swabs are the preferred sample for Omicron detection. medrvix. , (2021).
  17. Chu, C. Y., et al. Performance of saliva and mid-turbinate swabs for detection of the beta variant in South Africa. The Lancet. Infectious Diseases. 21 (10), 1354(2021).
  18. Mentus, C., Romeo, M., DiPaola, C. Analysis and applications of adaptive group testing methods for COVID-19. medRxiv. , (2020).
  19. Žilinskas, J., Lančinskas, A., Guarracino, M. R. Pooled testing with replication as a mass testing strategy for the COVID-19 pandemics. Scientific Reports. 11 (1), 3459(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

SARS CoV 2COVID 19

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved