Test SARS-CoV-2 su larga scala con saliva e pooling di campioni di trasposizione

Riepilogo

Il protocollo è destinato a fungere da modello per le università e altre organizzazioni che prendono in considerazione test su larga scala per SARS-CoV-2 o lo sviluppo di piani di preparazione per future epidemie virali.

Abstract

L'identificazione e l'isolamento degli individui contagiosi, insieme alla quarantena dei contatti stretti, sono fondamentali per rallentare la diffusione del COVID-19. I test su larga scala in una capacità di sorveglianza o screening per i portatori asintomatici di COVID-19 forniscono sia dati sulla diffusione virale che la capacità di follow-up di testare rapidamente le persone durante i focolai sospetti. Dall'autunno del 2020, il programma di diagnosi precoce del COVID-19 presso la Michigan State University utilizza test su larga scala con capacità di sorveglianza o screening. I metodi qui adattati sfruttano l'affidabilità, l'elevato volume di campione e i vantaggi dell'auto-raccolta della saliva, abbinati a uno schema di pooling bidimensionale economico e conservatore dei reagenti. Il processo è stato progettato per essere adattabile alle carenze di approvvigionamento, con molti componenti dei kit e del test facilmente sostituibili. I processi descritti per la raccolta e l'elaborazione dei campioni di SARS-CoV-2 possono essere adattati per testare in modo affidabile la presenza di futuri agenti patogeni virali espressi in modo affidabile nella saliva. Fornendo questo modello per le università o altre organizzazioni, è possibile sviluppare piani di preparazione per future epidemie virali.

Introduzione

La pandemia di COVID-19, causata dal virus SARS-CoV-2, ha causato la morte di oltre 6,2 milioni di persone fino ad oggi, con numeri in aumento ogni giorno¹. Il gold standard dei test per SARS-CoV-2 è la PCR quantitativa in tempo reale (RT-q), con primer progettati per colpire il genoma virale, come i geni nucleocapside, envelope, spike e RNA polimerasi^{RNA-dipendente 2}. All'inizio della pandemia, la capacità sufficiente per i test SARS-CoV-2 era gravemente carente. È nato dalla mancanza di test convalidati, componenti di test, personale clinico e un'infrastruttura impreparata a espandersi rapidamente per ospitare test di massa a livello pandemico. A causa delle carenze, i centri di test spesso richiedevano il rinvio di un medico per essere idonei al test. Queste carenze hanno comportato ritardi nell'approvazione dei test, lunghe code per la scomoda raccolta dei campioni nasofaringei e lunghi tempi di attesa per i risultati. Inoltre, a causa di questi vincoli, gli sforzi di test non potevano accogliere portatori pre-sintomatici, lievi o asintomatici che diffondevano inconsapevolmente il SARS-CoV-2. La mancanza di test diffusi e facilmente accessibili ha probabilmente contribuito alla diffusione incontrollata del COVID-19.

I test a intervalli su larga scala possono essere eseguiti sia come sorveglianza che come screening. Entrambi possono essere utilizzati per monitorare i tassi di positività locali in aree ad alta densità o ad alto rischio di trasmissione e possono essere utilizzati per prendere decisioni di salute pubblica. I test di sorveglianza hanno lo scopo di monitorare l'incidenza e la prevalenza della malattia in una popolazione e non vengono utilizzati per la diagnostica individuale³. I risultati della sorveglianza in genere vengono anonimizzati e non restituiti ai partecipanti; i laboratori che conducono test di sorveglianza non devono essere clinicamente certificati, né sono tenuti a utilizzare un test autorizzato dalla FDA. Lo screening consente di restituire i risultati ai singoli partecipanti, ma i laboratori di screening negli Stati Uniti devono avere un certificato CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) e soddisfare tutti i requisiti CLIA applicabili.

Il programma di diagnosi precoce della Michigan State University (MSU) è iniziato nel settembre 2020 e ha elaborato oltre 350.000 campioni. Il programma è nato dagli sforzi di un gruppo di ricerca per progettare un test SARS-CoV-2 altamente sensibile che non richiedesse forniture di test ad alta domanda 4,5,6,7,8. Gli obiettivi erano aiutare i laboratori clinici ad aumentare la capacità e sviluppare processi flessibili per soddisfare le carenze di approvvigionamento, sviluppando al contempo una strategia di screening per stabilire un piano di ritorno al lavoro per il MSU College of Human Medicine. Gli sforzi iniziali si sono concentrati su metodi alternativi di raccolta, estrazione e quantificazione per SARS-CoV-2. L'elevata domanda e la conseguente carenza di tamponi nasofaringei hanno portato alla valutazione di campioni di narici anteriori raccolti con tamponi buccali, mentre la carenza di reagenti ha portato allo sviluppo di un metodo di estrazione del campione adattato dai primi rapporti di Wuhan, Cina⁹. Per aumentare la sensibilità per la rilevazione di SARS-CoV-2 nei campioni di narici anteriori, la PCR digitale con goccioline è stata sostituita con RT-qPCR ^6,7. Sebbene la PCR digitale a goccia sia altamente sensibile e possa fornire valori assoluti con una lettura del punto finale, è stato stabilito che il suo utilizzo non era fattibile per test su larga scala a causa della mancanza di strumentazione affidabile ad alto rendimento per la tecnologia. Inoltre, l'auto-raccolta di campioni di narici anteriori basata sui livelli di RNasi P umana era estremamente variabile, suggerendo che non era sufficientemente affidabile per i test di massa.

Un'alternativa ai tamponi nasofaringei e narici anteriori è la raccolta della saliva. I virus respiratori come SARS-CoV, H1N1 e MERS sono stati storicamente rilevati nella saliva 10,11,12,13. Questo è stato successivamente dimostrato vero per SARS-CoV-2 14,15,16,17. Il confronto diretto tra la saliva e i campioni nasofaringei ha mostrato che la saliva produce titoli virali più elevati rispetto ai tamponi nasofaringei nei campioni abbinati e che la saliva è meno variabile con la raccolta ripetuta del campione¹⁴. È stato anche segnalato che la saliva è più sensibile in alcune varianti, come Omicron, rispetto a Delta¹⁶. Ulteriori vantaggi della raccolta della saliva sono la relativa facilità di auto-raccolta fuori sede senza forniture ad alta domanda, la possibilità di ripetere ripetutamente il test del campione se necessario, l'eliminazione dei requisiti di personale in loco per la raccolta dei campioni e l'eliminazione delle code dei partecipanti che potrebbero aumentare il potenziale di trasmissione virale. Il kit di saliva assemblato in laboratorio è stato sviluppato in collaborazione tra sviluppatori di saggi di laboratorio, esperti della scuola di imballaggio, esperti di branding universitari, responsabili della sicurezza e partner di produzione esterni che hanno prodotto la scatola e il sistema di etichettatura.

Mentre i campioni di saliva offrono un ampio materiale genetico di partenza e la RT-qPCR fornisce risultati sensibili e affidabili, il costo dei reagenti (primer/sonde e master mix) ha reso l'analisi su larga scala di singoli campioni un'impresa costosa su base individuale, per campione. Poiché il primer/sonde e la miscela master sono i componenti più costosi del processo, l'obiettivo era quello di cercare soluzioni che ne estendessero l'uso e quindi diminuissero il costo per campione. Per il test SARS-CoV-2 è stata proposta l'ottimizzazione sistemica delle dimensioni del pool di campioni in base all'incidenza nella comunità e alla sensibilità del test¹⁸. Tuttavia, quando i pool di qualsiasi dimensione indicano la presenza di SARS-CoV-2, tutti i partecipanti al pool devono essere sottoposti a un nuovo test, con conseguente perdita di tempo e aumento delle opportunità di diffusione. Per affrontare queste limitazioni, è stato impiegato un metodo di pooling bidimensionale, come il processo proposto da Zilinskas e altri¹⁹ per condurre un primo passaggio sotto le restrizioni dei test di sorveglianza. In questo processo, 96 campioni individuali vengono inseriti in una piastra a 96 pozzetti composta da 12 colonne e otto righe. Ogni campione è incluso in un pool di otto e un pool di 12 su due diverse piastre di reazione. In questo modo ogni campione viene rappresentato in modo univoco con i due pool. La deconvoluzione delle vasche in base alle coordinate identifica i campioni potenzialmente positivi. I campioni in pool in cui il SARS-CoV-2 non è stato rilevato non passano dai test di sorveglianza allo screening. Nel frattempo, i campioni di individui risultati positivi al test nel processo di sorveglianza vengono nuovamente estratti attraverso un processo di screening approvato dalla CLIA. Se confermato positivo, le persone ricevono il risultato, vengono indirizzate all'ufficio del medico universitario, viene avviato il tracciamento dei contatti e viene informato il dipartimento sanitario. In totale, il campione di un individuo viene testato in tre reazioni separate prima di essere dichiarato positivo, due volte in pool di sorveglianza e una volta come singolo screening di conferma, riducendo le possibilità di un falso positivo. Il pooling dei campioni utilizza ~80% in meno di reagenti rispetto all'esecuzione di campioni singolarmente, con un costo di ~$12 per campione.

Oltre al kit di saliva, alla strategia di pooling e al processo di sviluppo del test, il team ha anche sviluppato un piano logistico per la distribuzione dei kit, la raccolta dei campioni e la segnalazione dei risultati. I partecipanti al programma ritirano il loro kit, registrano il codice alfanumerico univoco sulla loro provetta, producono il loro campione e lo depositano in uno dei tanti cassonetti di raccolta dove vengono prelevati quotidianamente e trasportati al laboratorio. Il laboratorio elabora i campioni, il supervisore tecnico esamina e carica i risultati e i partecipanti ricevono una notifica per controllare il portale dei risultati. Questo processo ha un tempo di consegna di 24-48 ore dal momento in cui un campione viene depositato. La collaborazione di tutte le parti dell'istituzione è stata fondamentale per il successo dell'implementazione su larga scala di questo processo ibrido di sorveglianza e screening. Le seguenti procedure e descrizioni del programma di test e dell'infrastruttura necessaria sono intese come modelli su come aumentare i test per futuri scopi di sorveglianza e/o screening.

Protocollo

Gli studi condotti per ottimizzare i metodi per il programma di diagnosi precoce sono stati approvati dal Michigan State University Institutional Review Board. Tutte le cifre sono state riprodotte con campioni artificiosi e sono rappresentative dei risultati umani osservati. Nessun dato, informazione o risultato mostrato nel manoscritto proviene da alcun partecipante al programma di rilevamento precoce della Michigan State University.

1. Produzione del kit

NOTA: Durante l'assemblaggio del kit, indossare sempre maschere, guanti, protezioni per gli occhi e camici da laboratorio per evitare la contaminazione dei componenti del kit.

1. Preparazione dei componenti del kit
   1. Utilizzando un pennarello indelebile, tracciare una linea che indichi 1 mL sulla provetta conica da 25 mL. Utilizzando un pennarello indelebile, tracciare una linea che indichi 1 mL sulla pipetta di trasferimento.
   2. Aggiungere quattro perle di ceramica alla provetta da 5 mL. Inserire 1 mL di soluzione di stabilizzazione dell'RNA nella provetta del campione e chiudere la provetta. Attaccare un adesivo con bilanciere costituito da un codice identificativo univoco alla provetta del campione con il codice a barre a matrice di dati sulla parte superiore e l'identificatore ripetuto in codice alfanumerico sul lato.
      NOTA: Le perle di ceramica sono prive di RNasi/DNasi e non devono essere ulteriormente sterilizzate.
2. Inserire una provetta conica da 25 mL, una provetta per campioni da 5 mL, una pipetta di trasferimento e una piccola sacca per il rischio biologico nella confezione del kit (Figura 1 supplementare).
   NOTA: I tubi conici non devono essere privi di DNasi/RNasi. L'integrità del campione è preservata dalla soluzione di stabilizzazione dell'RNA.

2. Usi del kit per la raccolta di campioni autonomi

1. Secondo le istruzioni del kit, chiedi ai partecipanti di non mangiare o bere 30 minuti prima di fornire un campione. Chiedere ai partecipanti di sputare nella provetta conica da 25 ml fino a raccogliere 1 ml di saliva (linea segnata).
2. Utilizzando la pipetta, trasferire 1 mL di saliva (fino alla linea contrassegnata) nella provetta da 5 mL contenente la soluzione di stabilizzazione dell'RNA e le perle di ceramica. Chiudere e agitare la provetta del campione per 15 s.
3. Chiedere ai partecipanti di registrare il codice alfanumerico assegnato al campione sul sito web designato. Una volta fatto, chiedi loro di mettere la provetta del campione in un piccolo sacchetto per il rischio biologico e di depositarla in un contenitore di raccolta.

3. Assunzione del campione e preparazione per l'isolamento dell'RNA

NOTA: Tutte le fasi si svolgono in una cabina di biosicurezza o in un secchio da centrifuga con coperchio di biocontenimento.

1. Disinfetta e ispeziona visivamente i campioni per il controllo di qualità mentre sono ancora nella sacca per il rischio biologico.
2. Rifiutare il campione se (Figura 1): il campione è di colore non naturale (ad es. verde, blu) o contiene particelle di cibo o sangue; il campione perde o mancano le perline; il campione ha un volume atteso errato (<1,5 mL o >3 mL); Il campione non ha un codice a barre o un codice alfanumerico allegato.
   1. Se il campione viene rifiutato, scansionarlo e registrarlo in un file di rifiuto con una nota sul motivo per cui il campione è stato rifiutato. Se il campione viene rifiutato perché non dispone di identificatori, registrare il campione come Nessun codice a barre nel file di rifiuto.
3. Se il campione non viene rifiutato, aprire il sacchetto per il rischio biologico con le forbici e rimuovere la provetta del campione. Agitare la provetta per 15 secondi, quindi posizionare la provetta del campione in un adattatore per provette per una centrifuga a secchio oscillante.
4. Una volta che gli adattatori delle provette sono pieni, fissare il coperchio di biocontenimento sopra il secchio della centrifuga e trasferirlo nella centrifuga. Centrifugare i campioni a 4.100 x g per 2 minuti e rimettere i campioni nella cappa di biosicurezza.
   NOTA: La centrifugazione viene utilizzata per pellettare i detriti e forzare più materiale viscoso nella saliva sul fondo del tubo. Ciò elimina la necessità di proteinasi K nel processo. Una corsa completa consiste di 768 campioni (otto piastre da 96 pozzetti piene di campione dopo l'isolamento dell'RNA).
5. Senza disturbare il materiale pellettato, trasferire le provette in un rack per provette da 96 slot pre-etichettato con l'ID di corsa che include il numero del rack (1-8), la data e il gruppo corrispondente con cui i campioni verranno raggruppati/valutati (un identificatore per indicare il gruppo, ad esempio, il gruppo A è la prima corsa della giornata).
6. Quando i rack per provette da 96 slot sono pieni o non rimangono campioni, utilizzando uno scanner di codici a barre portatile, scansionare le provette in un file mappa su piastra (File supplementare 1 per pool pieni; File supplementare 2 per piscine di dimensioni dimezzate). Nel caso in cui un codice a barre non funzioni, utilizzare il codice alfanumerico sulla provetta per registrare il campione.
   NOTA: È necessaria una maschera per impedire la scansione di codici a barre adiacenti. Una maschera può essere realizzata praticando un foro nella carta opaca, quindi laminandola. I codici a barre scansionati nel file della mappa delle lastre appariranno con lo stesso orientamento del rack a 96 slot.
7. Spruzzare le provette del campione nel rack con etanolo al 70% e asciugarle tamponando con un tovagliolo di carta.
   NOTA: Pulire i tubi invece di tamponare può danneggiare i codici a barre.
8. Etichettare una piastra a 96 pozzetti profondi con una capacità di 2 mL con l'ID di esecuzione. Trasferire 200 μL di campione di saliva da ciascuna provetta al pozzetto corrispondente della piastra a 96 pozzetti. Se i campioni sono troppo viscosi per essere trasferiti, agitare e centrifugare di nuovo. Rifiuta il campione se il problema persiste.
   NOTA: I campioni di saliva possono essere filamentosi e lasciare una scia di lumaca sulla piastra durante il trasferimento se il tecnico non presta attenzione. Ciò può portare a falsi positivi iniziali e a un maggior numero di campioni che dovranno essere rieseguiti nella fase di conferma (vedere la sezione 6).
9. Una volta trasferiti tutti i campioni, coprire la piastra a 96 pozzetti con un tappetino in silicone e conservarla a temperatura ambiente. Conservare e conservare i rack da 96 slot con i campioni rimanenti per la conferma di campioni potenzialmente positivi.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. Isolamento dell'RNA

1. Etichettare una cartuccia di isolamento dell'RNA a 96 pozzetti con l'ID di corsa e posizionarla sopra una piastra di raccolta vuota.
   NOTA: A questo punto le piastre contenenti i campioni possono essere rimosse dalla cabina di biosicurezza.
2. Rimuovere il tappetino in silicone dalla piastra a 96 pozzetti. Trasferire 400 μl di tampone per la carica virale in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti profondi.
3. Miscelare ciascun campione pipettando delicatamente su e giù da due a quattro volte e trasferire l'intero campione nella colonna corrispondente nella cartuccia di isolamento dell'RNA a 96 pozzetti.
   NOTA: La miscelazione di grandi volumi creerà bolle che possono portare alla contaminazione dei pozzi vicini se eseguita a casaccio. La miscelazione deliberata può ridurre questo rischio e proteggere l'integrità della lavorazione a valle.
4. Centrifugare la cartuccia di isolamento dell'RNA sulla parte superiore della piastra di raccolta a 4.100 x g per 10 minuti per caricare i campioni sulla cartuccia. Trasferire la cartuccia di isolamento dell'RNA in una piastra di raccolta pulita.
5. Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio a ogni pozzetto della cartuccia di isolamento dell'RNA e centrifugare a 4.100 x g per 5 minuti. Trasferire la cartuccia di isolamento dell'RNA in una piastra di raccolta pulita.
6. Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio a ogni pozzetto della cartuccia di isolamento dell'RNA e centrifugare a 4.100 x g per 5 minuti. Trasferire la cartuccia di isolamento dell'RNA in una piastra di raccolta pulita.
7. Aggiungere 500 μl di etanolo al 100% a ogni pozzetto della cartuccia di isolamento dell'RNA e centrifugare a 4.100 x g per 5 minuti. Trasferire la cartuccia di isolamento dell'RNA in una piastra di raccolta pulita.
   NOTA: Se a questo punto il campione non è passato completamente attraverso la colonna, significa che il campione è troppo viscoso o che piccoli pezzi di detriti nel campione ostruiscono la colonna. Il campione deve essere rimosso completamente dalla cartuccia per non contaminare il processo di pooling a valle e il numero del campione deve essere aggiunto al file di scarto.
8. Centrifugare la cartuccia di isolamento dell'RNA sulla parte superiore della piastra di raccolta a 4.100 x g per 5 minuti per asciugare le colonne. Trasferire la cartuccia di isolamento dell'RNA su una piastra di eluizione pulita etichettata con l'ID di esecuzione e la riga di parole, quindi posizionare entrambe sopra una piastra di raccolta pulita.
9. Aggiungere 25 μL di acqua di grado molecolare priva di DNasi/RNasi a ciascun pozzetto della cartuccia di isolamento dell'RNA. Centrifugare a 4.100 x g per 10 minuti per eluire l'RNA. Se il campione non eluisce completamente, centrifugare nuovamente il campione per 5 minuti.
10. Trasferire le piastre di eluizione su piastre fredde pre-raffreddate e coprire. Procedere immediatamente con il pooling dei campioni e la RT-qPCR.

5. Raggruppamento dei campioni e RT-qPCR

NOTA: Il processo è impostato in un sistema a due piastre (come mostrato nella Figura 2). Il numero della piastra dell'RNA di eluizione corrisponde al numero della piastra della colonna prodotta e alla lettera della piastra della riga (A = 1, B = 2, C = 3, ecc.). Ai fini della deconvoluzione, la lettera della riga della piastra della colonna corrisponderà alla lettera della riga della piastra di eluizione dell'RNA e il numero della colonna della piastra della riga corrisponderà al numero della colonna della piastra di eluizione dell'RNA. Ad esempio, un campione nella piastra di RNA #6 in posizione C4 si troverà nella posizione F4 della piastra di reazione della riga e nella posizione C6 della piastra di reazione della colonna.

1. Etichettare una nuova piastra di eluizione con l'ID della corsa e la riga della parola e posizionarla su una piastra fredda pre-raffreddata. Trasferire 10 μL di RNA da ciascun pozzetto sulla piastra di eluizione della riga alla riga corrispondente sulla piastra di eluizione della colonna, creando così una copia della piastra di eluizione originale (Figura 2).
   NOTA: La colonna contrassegnata con le piastre di eluizione verrà raggruppata nella direzione della colonna e la riga contrassegnata con le piastre di eluizione verrà raggruppata nella direzione della riga.
2. Per la piastra raggruppata della colonna, trasferire l'intero volume da ciascun pozzetto attraverso la piastra nel numero di colonna che corrisponde al numero della piastra ID corsa. Per la piastra raggruppata a file, trasferire l'intero volume da ciascun pozzetto su o giù per la piastra nel numero di fila che corrisponde al numero di piastra Run ID (1 = A, 2 = B, ecc.; Figura 2).
3. Trasferire 13 μl di ciascun campione aggregato nella colonna o nella riga corrispondente di una piastra di reazione a 96 pozzetti (Figura 2).
4. Per questo protocollo, utilizzare tre sonde contro i geni nucleocapside (N), ORF1ab e spike (S) per rilevare SARS-CoV-2 e una quarta sonda primer mirata al fago MS2 come controllo interno. Nei campioni aggregati, inserire un controllo positivo al fago MS2 nella miscela master. Nei campioni analizzati singolarmente, inserire il fago MS2 nel campione sulla cartuccia di isolamento dell'RNA e utilizzarlo come controllo di estrazione.
   NOTA: La master mix, le sonde di primer, i coloranti fluorescenti e i quencher variano in base al saggio. I rapporti appropriati e i canali fluorescenti devono essere determinati da ciascun laboratorio.
5. Preparare il controllo positivo aggiungendo 2 μL di soluzione di controllo positivo e 11 μL di acqua di grado molecolare priva di DNasi/RNasi al pozzetto di controllo positivo sulla piastra di reazione (Figura 2).
6. Preparare il controllo senza stampo aggiungendo 13 μl di acqua di grado molecolare priva di DNasi/RNasi al pozzetto di controllo negativo sulla piastra di reazione.
7. Preparare la miscela master secondo le istruzioni del produttore e aumentare il controllo positivo dei fagi MS2. Erogare 7 μl di miscela master in ciascun pozzetto delle piastre di reazione a 96 pozzetti che contengono campioni o controlli. Limitare l'esposizione alla luce fluorescente.
8. Coprire le piastre di reazione con pellicola ottica e vortice per 2 minuti per mescolare bene i campioni. Centrifugare le piastre di reazione a 650 x g per 5 min.
9. Trasferire le piastre nel sistema RT-PCR ed eseguire con i parametri di ciclo appropriati per la miscela master. Per la master mix qui utilizzata, sono stati eseguiti i seguenti cicli: 25 °C per 2 min, 53 °C per 10 min, 95 °C per 2 min, 40 cicli di 95 °C per 3 s e 60 °C per 30 s.
10. Una volta eseguiti i campioni, eseguire una deconvoluzione dei pool per identificare i potenziali campioni positivi manualmente (Figura 3) e tramite un'app R Script Shiny.
    1. Esporta i risultati dalle piastre di reazione di colonne e righe come file di fogli di calcolo. Aprire l'app Shiny per lo script R di deconvoluzione del pool (codice sorgente disponibile all'indirizzo: https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP).
    2. Trascina e rilascia la mappa delle piastre, le colonne e i file di riga nell'app ed esegui l'app. Salva l'elenco prodotto dall'app.
       NOTA: L'elenco prodotto dall'app contiene tutti i codici a barre inseriti nella mappa delle piastre e se sono probabilmente positivi o negativi in base allo script di deconvoluzione del pool. Questi campioni contrassegnati come potenziali positivi vengono rielaborati singolarmente.

6. Convalida dei campioni positivi

1. Etichettare due provette per microcentrifuga da 1,5 ml e una colonna di estrazione dell'RNA per ogni campione che deve essere testato. Utilizzare una provetta per microcentrifuga per miscelare il campione, il fago MS2 e il tampone di carica virale e la seconda provetta per microcentrifuga per la fase di eluizione dell'RNA.
2. Aggiungere 5 μL di MS2 Phage RNA alla provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Trasferire 200 μl del campione potenzialmente positivo nella provetta e aggiungere 400 μl di tampone per la carica virale nella provetta, miscelare mediante pipettaggio.
3. Trasferire l'intero contenuto nella colonna di estrazione dell'RNA pre-marcata in una provetta di raccolta pulita. Centrifugare a 10.000 x g per 2 min. Aspirare il flusso dal tubo di raccolta.
4. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio alla colonna di estrazione dell'RNA e centrifugare a 10.000 x g per 2 minuti. Aspirare il flusso dal tubo di raccolta.
5. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio alla colonna di estrazione dell'RNA e centrifugare a 10.000 x g per 2 minuti. Aspirare il flusso dal tubo di raccolta.
6. Aggiungere 500 μl di etanolo al 100% alla colonna di estrazione dell'RNA e centrifugare a 10.000 x g per 1 minuto. Trasferire la colonna di estrazione dell'RNA in una provetta di raccolta pulita e centrifugare a 10.000 x g per 1 minuto per asciugare la colonna.
7. Trasferire la colonna di estrazione dell'RNA in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL pre-marcata per l'eluizione. Aggiungere 25 μl di acqua molecolare priva di DNasi/RNasi alla colonna di estrazione dell'RNA. Centrifugare a 10.000 x g per 2 minuti per raccogliere l'RNA e trasferire la provetta sul ghiaccio umido.
8. Preparare la miscela master secondo le istruzioni del produttore. Erogare 7 μl di miscela master in ciascun pozzetto di una piastra di reazione a 96 pozzetti che conterrà il campione. Trasferire 13 μL di ciascun RNA isolato nella piastra di reazione.
   NOTA: La master mix è la stessa utilizzata nel protocollo del campione aggregato ma non include il picco di RNA del fago MS2.
9. Preparare il controllo positivo aggiungendo 2 μL di soluzione di controllo positivo e 11 μL di acqua di grado molecolare priva di DNasi/RNasi al pozzetto di controllo positivo sulla piastra di reazione. Preparare il controllo senza stampo aggiungendo 13 μl di acqua di grado molecolare priva di DNasi/RNasi al pozzetto di controllo negativo sulla piastra di reazione.
10. Coprire le piastre di reazione con pellicola ottica e vortice per 2 minuti per mescolare bene i campioni. Centrifugare le piastre di reazione a 650 x g per 5 min. Trasferire le piastre nel sistema RT-PCR ed eseguire con i parametri di ciclo appropriati per la miscela master.
    1. Per la master mix qui indicata, utilizzare 25 °C per 2 min, 53 °C per 10 min, 95 °C per 2 min, 40 cicli di 95 °C per 3 s e 60 °C per 30 s.

Risultati

La stragrande maggioranza dei campioni ricevuti dal laboratorio fino ad oggi è stata accettata e ha superato la fase iniziale di controllo visivo della qualità. La necessità di rifiutare un campione è limitata ai motivi che possono influenzare negativamente l'elaborazione del campione e/o i risultati complessivi del campione. In particolare, il volume errato della provetta, la consistenza o il colore non naturale della saliva, l'assenza di perle di ceramica utilizzate per facilitare ...

Discussione

Durante l'elaborazione del campione, ci sono passaggi che richiedono molta attenzione. La fase iniziale del controllo qualità, che esamina il volume del campione, la consistenza, il colore e la presenza di perle aggiunte, è fondamentale per il successo complessivo del processo. Le provette con campioni che non contengono la giusta quantità di saliva potrebbero produrre un falso negativo, poiché una quantità insufficiente di saliva comporterebbe una quantità insufficiente di materia...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Step MM, no ROX	Thermo Fisher	A28523
1.2 mlDeep well Plates	Fisher	AB0564
100 mL reagent reservoirs	Corning	4872
2.8 mm Ceramic Beads	OMNI	19-646
25 ml conical w/screw cap	VWR	76338-496
50mL V bottom reservoirs	Costar	4870
5430-High-Speed Centrifuge	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf Tube	Fisher	14282300
8 strip tubes for QuantStudio	life technologies	4316567
Beta Mercaptoethanol	Fisher	AC125472500
Ethanol 200 Proof, Molecular Biology Grade	Fisher	BP28184
Microamp Endura Optical 96-well fast clear reaction plate with barcode	life technologies	4483485
Microamp Fast Optical 96 well plate	Fisher	4346906
Mini Microcentrifuge	Corning Medical	6770
optical caps for strip tubes	life technologies	AB-1820
Optical Film	Thermo Fisher	4311971
PCR plate sealing film Non-optical	Fisher	AB-0558
PCR Plate semi-skirted	Fisher	14230244
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
Quick RNA Viral Kit confirmation	Zymo	R1035
Reagent Reservoir, 100ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
Small Biohazard Bags	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19 kit	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrifuge	Thermo Fisher	75009525
Transfer Pipet	Fisher	22170404
Viral 96 Kit	Zymo	R1041
Vortex Mixer	Fisher	2215414