Tükürük ve Transpozisyon Numune Havuzunu Kullanan Büyük Ölçekli SARS-CoV-2 Testi

Özet

Protokolün, SARS-CoV-2 için büyük ölçekli testler yapmayı veya gelecekteki viral salgınlar için hazırlık planları geliştirmeyi düşünen üniversiteler ve diğer kuruluşlar için bir plan görevi görmesi amaçlanıyor.

Özet

Bulaşıcı bireylerin tanımlanması ve izolasyonu ile yakın temaslıların karantinaya alınması, COVID-19'un yayılmasını yavaşlatmak için kritik öneme sahiptir. COVID-19'un asemptomatik taşıyıcıları için bir sürveyans veya tarama kapasitesinde büyük ölçekli testler, hem viral yayılma hakkında veri hem de şüpheli salgınlar sırasında bireyleri hızlı bir şekilde test etmek için takip yeteneği sağlar. Michigan Eyalet Üniversitesi'ndeki COVID-19 erken teşhis programı, 2020 sonbaharından bu yana gözetim veya tarama kapasitesinde büyük ölçekli testler kullanıyor. Burada uyarlanan yöntemler, uygun maliyetli, reaktifi koruyan iki boyutlu havuzlama şeması ile eşleştirilmiş tükürüğün güvenilirliğinden, büyük numune hacminden ve kendi kendine toplama avantajlarından yararlanır. Süreç, kitlerin birçok bileşeni ve tahlilin kolayca ikame edilmesiyle, tedarik eksikliklerine uyarlanabilir olacak şekilde tasarlanmıştır. SARS-CoV-2 numunelerinin toplanması ve işlenmesi için özetlenen süreçler, tükürükte güvenilir bir şekilde ifade edilen gelecekteki viral patojenleri test etmek için uyarlanabilir. Üniversiteler veya diğer kuruluşlar için bu planı sağlayarak, gelecekteki viral salgınlar için hazırlık planları geliştirilebilir.

Giriş

SARS-CoV-2 virüsünün neden olduğu COVID-19 salgını, bugüne kadar 6,2 milyondan fazla insanın ölümüne neden oldu ve sayılar her geçen gün artıyor¹. SARS-CoV-2 için altın test standardı, nükleokapsid, zarf, spike ve RNA'ya bağımlı RNA polimeraz genleri² gibi viral genomu hedeflemek için tasarlanmış primerlerle kantitatif gerçek zamanlı (RT-q) PCR'dir. Pandeminin başlangıcında, SARS-CoV-2 testi için yeterli kapasite ciddi şekilde eksikti. Doğrulanmış tahlillerin, test bileşenlerinin, klinik personelin ve pandemi düzeyinde, toplu testlere uyum sağlamak için hızla genişlemeye hazırlıksız bir altyapının eksikliğinden kaynaklandı. Eksiklikler nedeniyle, test merkezleri genellikle teste uygun olmak için bir doktorun sevkini gerektiriyordu. Bu eksiklikler, test onayı için gecikmelere, rahatsız edici nazofaringeal numune toplama için uzun kuyruklara ve sonuçlar için uzun bekleme sürelerine neden oldu. Ek olarak, bu kısıtlamalar nedeniyle, test çabaları, SARS-CoV-2'yi bilmeden yayan pre-semptomatik, hafif veya asemptomatik taşıyıcıları barındıramadı. Kolayca erişilebilir, yaygın testlerin olmaması muhtemelen COVID-19'un kontrolsüz yayılmasına katkıda bulundu.

Büyük ölçekli aralık testi, gözetim veya tarama olarak gerçekleştirilebilir. Her ikisi de yüksek yoğunluklu veya yüksek riskli iletim alanlarında yerel pozitiflik oranlarını izlemek için kullanılabilir ve halk sağlığı kararları almak için kullanılabilir. Sürveyans testi, bir popülasyonda hastalığın görülme sıklığını ve prevalansını izlemek için tasarlanmıştır ve bireysel teşhis için kullanılmaz³. Sürveyans sonuçları tipik olarak kimliksizleştirilir ve katılımcılara geri gönderilmez; Gözetim testi yapan laboratuvarların klinik olarak sertifikalandırılmasına veya FDA tarafından yetkilendirilmiş bir test kullanmaları gerekmemektedir. Tarama, sonuçların bireysel katılımcılara geri gönderilmesine izin verir, ancak Amerika Birleşik Devletleri'ndeki tarama laboratuvarlarının bir Klinik Laboratuvar İyileştirme Değişiklikleri (CLIA) sertifikasına sahip olması ve geçerli tüm CLIA gereksinimlerini karşılaması gerekir.

Michigan Eyalet Üniversitesi (MSU) erken teşhis programı Eylül 2020'de başladı ve 350.000'den fazla numuneyi işledi. Program, bir araştırma grubunun, yüksek talep gerektiren test malzemeleri gerektirmeyen son derece hassas bir SARS-CoV-2 testi tasarlama çabalarından ortaya çıktı 4,5,6,7,8. Hedefler, klinik laboratuvarların kapasiteyi artırmalarına ve tedarik eksikliklerini karşılamak için esnek süreçler geliştirmelerine yardımcı olmak ve aynı zamanda MSU İnsan Tıbbı Koleji için bir işe dönüş planı oluşturmak için bir tarama stratejisi geliştirmekti. İlk çabalar, SARS-CoV-2 için alternatif toplama, ekstraksiyon ve miktar tayini yöntemlerine odaklandı. Yüksek talep ve müteakip nazofaringeal sürüntü kıtlığı, bukkal sürüntülerle toplanan ön nares örneklerinin değerlendirilmesine yol açtı ve reaktif kıtlığı, Wuhan, Çin'den gelen erken raporlardan uyarlanan bir örnek ekstraksiyon yönteminin geliştirilmesine yol açtı⁹. Ön burun örneklerinde SARS-CoV-2'yi tespit etme duyarlılığını artırmak için, damlacık dijital PCR, RT-qPCR ^6,7 ile değiştirildi. Damlacık dijital PCR oldukça hassas olmasına ve bir uç nokta okuması ile mutlak değerler sağlayabilmesine rağmen, teknoloji için güvenilir yüksek verimli enstrümantasyonun olmaması nedeniyle kullanımının büyük ölçekli testler için uygun olmadığı belirlendi. Ek olarak, insan RNase P seviyelerine dayalı olarak ön nar örneklerinin kendi kendine toplanması son derece değişkendi, bu da kitle testi için yeterince güvenilir olmadığını düşündürdü.

Nazofaringeal ve ön nares sürüntülerine bir alternatif tükürük toplanmasıdır. SARS-CoV, H1N1 ve MERS gibi solunum yolu virüslerinin tümü tarihsel olarak tükürükte tespit edildi^10,11,12,13. Bunun daha sonra SARS-CoV-2 ^14,15,16,17 için doğru olduğu kanıtlandı. Tükürük ve nazofaringeal numuneler arasındaki doğrudan karşılaştırma, tükürüğün eşleşen numunelerde nazofaringeal sürüntülerden daha yüksek viral titreler verdiğini ve tekrarlanan numune toplama ile tükürüğün daha az değişken olduğunu gösterdi¹⁴. Tükürüğün ayrıca Omicron gibi bazı varyantlarda Delta^16'ya kıyasla daha hassas olduğu bildirilmiştir. Tükürük toplamanın ek faydaları, yüksek talep gören malzemeler olmadan saha dışında kendi kendine toplamanın göreceli kolaylığı, gerekirse numuneyi tekrar tekrar test etme yeteneği, numune toplama için yerinde personel gereksinimlerinin ortadan kaldırılması ve viral bulaşma potansiyelini artırabilecek katılımcı kuyruklarından kaçınılmasıdır. Laboratuvarda monte edilen tükürük kiti, laboratuvar tahlil geliştiricileri, paketleme okulundaki uzmanlar, üniversite marka uzmanları, güvenlik görevlileri ve kutu ve etiketleme sistemini üreten harici üretim ortakları arasında bir işbirliği olarak geliştirilmiştir.

Tükürük örnekleri bol miktarda genetik başlangıç materyali sunarken ve RT-qPCR hassas, güvenilir sonuçlar sağlarken, reaktiflerin (primer/problar ve ana karışım) maliyeti, tek tek numunelerin büyük ölçekli testini numune bazında bireysel olarak maliyetli bir çaba haline getirmiştir. Astar/problar ve ana karışım prosesin en pahalı bileşenleri olduğundan, amaç, kullanımlarını genişletecek ve dolayısıyla numune başına maliyeti azaltacak çözümler aramaktı. SARS-CoV-2 testi için topluluktaki insidansa ve test duyarlılığına dayalı olarak numune havuzu boyutunun sistemik olarak optimize edilmesi^{önerilmiştir 18}. Bununla birlikte, herhangi bir büyüklükteki havuzlar SARS-CoV-2'nin varlığını gösterdiğinde, havuzdaki tüm katılımcıların yeniden test edilmesi gerekir, bu da zaman kaybına ve yayılma fırsatlarının artmasına neden olur. Bu sınırlamaları ele almak için, Zilinskas ve diğerleri¹⁹ tarafından gözetim testinin kısıtlamaları altında ilk geçişi gerçekleştirmek için önerilen süreç gibi iki boyutlu bir havuzlama yöntemi kullanıldı. Bu işlemde, 96 ayrı numune, 12 sütun ve sekiz sıradan oluşan 96 oyuklu bir plakaya yerleştirilir. Her numune, iki farklı reaksiyon plakası üzerinde sekizli bir havuza ve 12'li bir havuza dahil edilir. Bu, her numunenin iki havuzla benzersiz bir şekilde temsil edilmesine neden olur. Koordinatlara dayalı olarak havuzların evrişiminin çözülmesi, potansiyel olarak pozitif örnekleri tanımlar. SARS-CoV-2'nin tespit edilmediği havuzlardaki numuneler, sürveyans testinden taramaya geçmez. Bu arada, sürveyans sürecinde pozitif test eden kişilerden alınan numuneler, CLIA onaylı bir tarama süreci ile yeniden çıkarılır. Pozitif olduğu doğrulanırsa, bireylere sonuçları verilir, üniversite doktorunun ofisine sevk edilir, temas takibi başlatılır ve sağlık departmanına bildirilir. Toplamda, bir bireyin numunesi, pozitif ilan edilmeden önce üç ayrı reaksiyonda, iki kez gözetim havuzlarında ve bir kez tek bir doğrulayıcı ekran olarak test edilir ve yanlış pozitif olasılığını azaltır. Numune havuzu, numuneleri tek tek çalıştırmaktan ~%80 daha az reaktif kullanır ve bu da numune başına ~12 ABD doları maliyetle sonuçlanır.

Tükürük kiti, havuzlama stratejisi ve tahlil geliştirme sürecinin ötesinde, ekip ayrıca kitlerin dağıtımı, numunelerin toplanması ve sonuçların raporlanması için bir lojistik plan geliştirdi. Programa katılanlar kitlerini alırlar, benzersiz alfanümerik kodu tüplerine kaydederler, numunelerini üretirler ve günlük olarak alındıkları ve laboratuvara taşındıkları birçok bırakma kutusundan birine bırakırlar. Laboratuvar numuneleri işler, teknik süpervizör sonuçları inceler ve yükler ve katılımcılara sonuç portalını kontrol etmeleri için bildirim gönderilir. Bu işlem, bir numunenin yatırıldığı andan itibaren 24-48 saatlik bir geri dönüş süresine sahiptir. Kurumun tüm bölümlerinden gelen işbirliği, bu hibrit gözetim ve tarama sürecinin başarılı bir şekilde büyük ölçekli bir şekilde uygulanmasının anahtarıydı. İhtiyaç duyulan test programı ve altyapısına ilişkin aşağıdaki prosedürler ve açıklamalar, gelecekteki gözetim ve/veya tarama amaçları için testin nasıl ölçeklendirileceğine ilişkin planlar olarak tasarlanmıştır.

Protokol

Erken Teşhis Programı için yöntemlerin optimize edilmesi için yapılan çalışmalar, Michigan State Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı. Tüm figürler uydurma örneklerle yeniden üretildi ve gözlemlenen insan sonuçlarını temsil ediyor. Makalede gösterilen hiçbir veri, bilgi veya sonuç, Michigan Eyalet Üniversitesi Erken Teşhis Programının herhangi bir katılımcısına ait değildir.

1. Kit üretimi

NOT: Kit montajı sırasında, kit bileşeninin kontaminasyonunu önlemek için her zaman maske, eldiven, göz koruması ve laboratuvar önlüğü kullanın.

1. Kit bileşenlerinin hazırlanması
   1. Kalıcı bir işaretleyici kullanarak, 25 mL konik tüp üzerinde 1 mL'lik bir çizgi çizin. Kalıcı bir işaretleyici kullanarak, transfer pipeti üzerinde 1 mL'yi gösteren bir çizgi çizin.
   2. 5 mL'lik numune tüpüne dört seramik boncuk ekleyin. Numune tüpüne 1 mL RNA stabilizasyon solüsyonu pipetleyin ve tüpü kapatın. Benzersiz bir tanımlayıcı koddan oluşan bir halter etiketini, üstte veri matrisi barkodu ve yanda alfanümerik kodda tekrarlanan tanımlayıcı ile tüpten numune almak için yapıştırın.
      NOT: Seramik boncuklar RNase/DNaz içermez ve daha fazla sterilize edilmeleri gerekmez.
2. 25 mL'lik bir konik tüp, 5 mL'lik bir numune tüpü, transfer pipeti ve küçük biyolojik tehlike torbasını kit kutusuna yerleştirin (Ek Şekil 1).
   NOT: Konik boruların DNase/RNaz içermesi gerekmez. Numunenin bütünlüğü, RNA stabilizasyon çözeltisi ile korunur.

2. Kit, kendi kendine numune toplama için kullanır

1. Kit talimatlarına göre, katılımcılardan numune vermeden 30 dakika önce yemek yememelerini veya içmemelerini isteyin. Katılımcılardan 1 mL tükürük toplanana kadar (işaretli çizgi) 25 mL konik tüpe tükürmelerini isteyin.
2. Pipeti kullanarak, 1 mL tükürüğü (işaretli çizgiye kadar) RNA stabilizasyon solüsyonu ve seramik boncuklar içeren 5 mL numune tüpüne aktarın. Numune tüpünü kapatın ve 15 saniye sallayın.
3. Katılımcılardan örneğe atanan alfanümerik kodu belirlenen web sitesine kaydetmelerini isteyin. İşiniz bittiğinde, numune tüpünü küçük biyolojik tehlike torbasına koymalarını ve bir toplama kutusuna atmalarını isteyin.

3. RNA izolasyonu için numune alımı ve hazırlanması

NOT: Tüm adımlar, biyolojik muhafaza kapaklı bir biyogüvenlik kabininde veya santrifüj kovasında gerçekleştirilir.

1. Biyolojik tehlike torbasındayken kalite kontrol için numuneleri dezenfekte edin ve görsel olarak inceleyin.
2. Aşağıdaki durumlarda numuneyi reddedin (Şekil 1): numune doğal olmayan renkteyse (yani yeşil, mavi) veya gıda parçacıkları veya kan içeriyorsa; numune sızdırıyor veya eksik boncuklar; numunenin beklenen hacmi yanlış (<1.5 mL veya >3 mL); Numunenin eklenmiş bir barkodu veya alfanümerik kodu yoktur.
   1. Numune reddedilirse, numuneyi tarayın ve numunenin neden reddedildiğine dair bir notla birlikte bir ret dosyasına kaydedin. Örnek, tanımlayıcısı olmadığı için reddedilirse, örneği ret dosyasında Barkod Yok olarak kaydedin.
3. Numune reddedilmezse, biyolojik tehlike torbasını makasla kesin ve numune tüpünü çıkarın. Tüpü 15 saniye boyunca vorteksleyin, ardından numune tüpünü döner kovalı bir santrifüj için bir tüp adaptörüne yerleştirin.
4. Tüp adaptörleri dolduğunda, biyolojik muhafaza kapağını santrifüj kovasının üzerine sabitleyin ve santrifüje aktarın. Numuneleri 2 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüjleyin ve numuneleri biyogüvenlik kabinine geri koyun.
   NOT: Santrifüjleme, döküntüleri peletlemek ve tükürükteki daha viskoz materyali tüpün dibine zorlamak için kullanılır. Bu, süreçte proteinaz K'ye olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Tam bir çalışma 768 numuneden oluşur (RNA izolasyonundan sonra numuneyle dolu sekiz adet 96 oyuklu plaka).
5. Peletlenmiş malzemeyi rahatsız etmeden, numune tüplerini, raf numarasını (96-1), tarihi ve numunelerin toplanacağı/değerlendirileceği ilgili grubu içeren Çalışma Kimliği ile önceden etiketlenmiş 8 yuvalı bir tüp rafına aktarın (grubu belirtmek için bir tanımlayıcı, yani A grubu günün ilk çalışmasıdır).
6. 96 yuvalı tüp rafları dolduğunda veya hiç numune kalmadığında, el tipi bir barkod tarayıcı kullanarak tüpleri bir plaka harita dosyasına tarayın (Tam havuzlar için Ek Dosya 1 ; Yarım boyutlu havuzlar için Ek Dosya 2 ). Bir barkodun çalışmaması durumunda, numuneyi kaydetmek için tüp üzerindeki alfanümerik kodu kullanın.
   NOT: Bitişik barkodların taranmasını önlemek için bir maske gereklidir. Opak kağıtta bir delik açılarak ve ardından lamine edilerek bir maske yapılabilir. Plaka harita dosyasına taranan barkodlar, 96 yuvalı raftakiyle aynı yönde görünecektir.
7. Numune tüplerini rafa %70 etanol püskürtün ve bir kağıt havluyla kurulayın.
   NOT: Tüpleri delmek yerine silmek barkodlara zarar verebilir.
8. Her numune tüpünden 200 μL tükürük numunesini 96 derin kuyu plakasının ilgili kuyucuğuna aktarın. Her numune tüpünden 96 μL tükürük numunesini 96 derin kuyu plakasının ilgili kuyucuğuna aktarın. Numuneler aktarılamayacak kadar viskozsa, tekrar vorteks yapın ve santrifüjleyin. Sorun devam ederse numuneyi reddedin.
   NOT: Tükürük örnekleri lifli olabilir ve teknisyen dikkatli olmazsa aktarım sırasında plaka boyunca bir salyangoz izi bırakabilir. Bu, başlangıçta yanlış pozitiflere ve sonunda onay adımında yeniden çalıştırılması gereken daha fazla örneğe yol açabilir (bkz. bölüm 6).
9. Tüm numuneler aktarıldığında, 96 derin kuyulu plakayı silikon bir paspasla örtün ve oda sıcaklığında saklayın. Potansiyel olarak pozitif numunelerin onaylanması için 96 yuvalı rafları kalan numunelerle birlikte kaydedin ve saklayın.
   NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.

4. RNA izolasyonu

1. 96 oyuklu bir RNA izolasyon kartuşunu Run ID ile etiketleyin ve boş bir toplama plakasının üzerine yerleştirin.
   NOT: Numune içeren plakalar bu noktada biyogüvenlik kabininden çıkarılabilir.
2. Silikon matı 96 derin kuyulu plakadan çıkarın. 96 derin kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 400 μL viral yükleme tamponu aktarın.
3. Her numuneyi iki ila dört kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve tüm numuneyi 96 oyuklu RNA izolasyon kartuşundaki ilgili sütuna aktarın.
   NOT: Büyük hacimlerin karıştırılması, gelişigüzel yapılırsa komşu kuyuların kirlenmesine yol açabilecek kabarcıklar oluşturacaktır. Kasıtlı bir şekilde karıştırmak bu riski azaltabilir ve sonraki işlemenin bütünlüğünü koruyabilir.
4. Numuneleri kartuşa yüklemek için toplama plakasının üstündeki RNA izolasyon kartuşunu 4,100 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. RNA izolasyon kartuşunu temiz bir toplama plakasına aktarın.
5. RNA izolasyon kartuşunun her kuyucuğuna 500 μL yıkama tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüjleyin. RNA izolasyon kartuşunu temiz bir toplama plakasına aktarın.
6. RNA izolasyon kartuşunun her kuyucuğuna 500 μL yıkama tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüjleyin. RNA izolasyon kartuşunu temiz bir toplama plakasına aktarın.
7. RNA izolasyon kartuşunun her kuyucuğuna 500 μL %100 etanol ekleyin ve 5 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüjleyin. RNA izolasyon kartuşunu temiz bir toplama plakasına aktarın.
   NOT: Numune bu noktada kolondan tam olarak geçmediyse, numune çok viskozdur veya numunedeki küçük kalıntı parçaları kolonu tıkamaktadır. Aşağı akış havuzlama sürecini kirletmemek için numunenin kartuştan tamamen çıkarılması ve numune numarasının ret dosyasına eklenmesi gerekir.
8. Sütunları kurutmak için toplama plakasının üstündeki RNA izolasyon kartuşunu 4,100 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. RNA izolasyon kartuşunu, Çalışma Kimliği ve kelime satırı ile etiketlenmiş temiz bir elüsyon plakasına aktarın, ardından her ikisini de temiz bir toplama plakasının üzerine yerleştirin.
9. RNA izolasyon kartuşunun her bir kuyucuğuna 25 μL DNase / RNaz içermeyen moleküler dereceli su ekleyin. RNA'yı elüte etmek için 10 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüjleyin. Numune tamamen boşalmazsa, numuneyi 5 dakika boyunca yeniden santrifüjleyin.
10. Elüsyon plakalarını önceden soğutulmuş soğuk plakalara aktarın ve üzerini kapatın. Hemen numune havuzuna ve RT-qPCR'ye geçin.

5. Numune havuzu ve RT-qPCR

NOT: İşlem, iki plakalı bir sistemde kurulur ( Şekil 2'de görüldüğü gibi). Elüsyon RNA plaka numarası, üretilen kolon plaka numarasına ve satır plakası harfine (A = 1, B = 2, C = 3, vb.) karşılık gelir. Evrişim giderme amaçları için, sütun plakası satır harfi, RNA elüsyon plakasından gelen satır harfine karşılık gelecektir ve satır plakası sütun numarası, RNA elüsyon plakası sütun numarasına karşılık gelecektir. Örneğin, C4 konumundaki RNA plakası #6'daki bir numune, F4 sıra reaksiyon plakası konumunda ve C6 sütun reaksiyon plakası konumunda bulunacaktır.

1. Yeni bir elüsyon plakasını Run ID ve kelime satırı ile etiketleyin ve önceden soğutulmuş soğuk bir plakaya yerleştirin. Sıra elüsyon plakası üzerindeki her bir oyuktan 10 μL RNA'yı kolon elüsyon plakasındaki karşılık gelen satıra aktarın, böylece orijinal elüsyon plakasının bir kopyasını yapın (Şekil 2).
   NOT: Sütun ile işaretlenmiş elüsyon plakaları sütun yönünde havuzlanacak ve sıra ile işaretlenmiş elüsyon plakaları sıra yönünde havuzlanacaktır.
2. Sütun havuzlanmış plaka için, plaka boyunca her bir kuyucuktan gelen tüm hacmi, Çalışma Kimliği plaka numarasına karşılık gelen sütun numarasına aktarın. Sıra havuzlanmış plaka için, plakanın her bir kuyucuğundan yukarı veya aşağı hacmin tamamını, Çalışma Kimliği plaka numarasına karşılık gelen sıra numarasına aktarın (1 = A, 2 = B, vb.; Şekil 2).
3. Toplanan her numunenin 13 μL'sini 96 oyuklu bir reaksiyon plakasının karşılık gelen sütununa veya satırına aktarın (Şekil 2).
4. Bu protokol için, SARS-CoV-2'yi tespit etmek için nükleokapsid (N), ORF1ab ve spike (S) genlerine karşı üç prob ve dahili kontrol olarak MS2 fajını hedefleyen dördüncü bir primer prob kullanın. Havuzlanmış örneklerde, ana karışıma bir MS2 faj pozitif kontrolü ekleyin. Ayrı ayrı çalıştırılan numunelerde, MS2 fajını RNA izolasyon kartuşundaki numuneye dökün ve ekstraksiyon kontrolü olarak kullanın.
   NOT: Ana karışım, astar probları, floresan boyalar ve söndürücüler teste göre değişecektir. Uygun oranlar ve floresan kanalları her laboratuvar tarafından belirlenmelidir.
5. Reaksiyon plakası üzerindeki pozitif kontrol kuyusuna 2 μL pozitif kontrol solüsyonu ve 11 μL DNase/RNaz içermeyen moleküler dereceli su ekleyerek pozitif kontrolü hazırlayın (Şekil 2).
6. Reaksiyon plakası üzerindeki negatif kontrol kuyusuna 13 μL DNase/RNaz içermeyen moleküler dereceli su ekleyerek şablonsuz kontrolü hazırlayın.
7. Üreticinin talimatlarına göre ana karışımı yapın ve MS2 faj pozitif kontrolünde ani artış yapın. Numuneler veya kontroller içeren 96 oyuklu reaksiyon plakalarının her bir kuyucuğuna 7 μL ana karışım dağıtın. Floresan ışığına maruz kalmayı sınırlayın.
8. Reaksiyon plakalarını optik film ile örtün ve numuneleri iyice karıştırmak için 2 dakika boyunca girdaplayın. Reaksiyon plakalarını 650 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
9. Plakaları RT-PCR sistemine aktarın ve ana karışım için uygun döngü parametreleriyle çalıştırın. Burada kullanılan ana karışım için şu döngüler çalıştırıldı: 25 °C 2 dakika, 53 °C 10 dakika, 95 °C 2 dakika, 40 döngü 95 °C 3 saniye ve 60 °C 30 saniye.
10. Örnekler çalıştırıldıktan sonra, potansiyel pozitif örnekleri manuel olarak (Şekil 3) ve bir R Script Shiny Uygulaması aracılığıyla belirlemek için havuzların evrişimini çözün.
    1. Sonuçları sütun ve satır reaksiyon plakalarından elektronik tablo dosyaları olarak dışa aktarın. Havuz evrişimini kaldırma R betiği Shiny uygulamasını açın (kaynak kodu şu adreste mevcuttur: https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP).
    2. Plaka haritasını, sütunu ve satırı dosyaya sürükleyip bırakın ve uygulamayı çalıştırın. Uygulamadan üretilen listeyi kaydedin.
       NOT: Uygulamadan üretilen liste, plaka haritasına girilen tüm barkodları ve havuz evrişim çözme komut dosyasına göre muhtemelen pozitif mi yoksa negatif mi olduklarını içerir. Potansiyel pozitifler olarak işaretlenen bu örnekler ayrı ayrı yeniden işlenir.

6. Pozitif numunelerin doğrulanması

1. Test edilmesi gereken her numune için iki adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü ve bir RNA ekstraksiyon kolonunu etiketleyin. Numuneyi, MS2 fajını ve viral yükleme tamponunu karıştırmak için bir mikrosantrifüj tüpü ve RNA elüsyon adımı için ikinci mikrosantrifüj tüpünü kullanın.
2. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne 5 μL MS2 Faj RNA'sı ekleyin. Potansiyel olarak pozitif numunenin 200 μL'sini tüpe aktarın ve tüpe 400 μL viral yükleme tamponu ekleyin, pipetleme ile karıştırın.
3. Tüm içeriği temiz bir toplama tüpünde önceden etiketlenmiş RNA ekstraksiyon kolonuna aktarın. 10.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Aspirat, toplama tüpünden akar.
4. RNA ekstraksiyon kolonuna 500 μL yıkama tamponu ekleyin ve 2 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Aspirat, toplama tüpünden akar.
5. RNA ekstraksiyon kolonuna 500 μL yıkama tamponu ekleyin ve 2 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Aspirat, toplama tüpünden akar.
6. RNA ekstraksiyon kolonuna 500 μL %100 etanol ekleyin ve 1 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. RNA ekstraksiyon kolonunu temiz bir toplama tüpüne aktarın ve kolonu kurutmak için 1 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
7. RNA ekstraksiyon kolonunu, elüsyon için önceden etiketlenmiş 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. RNA ekstraksiyon kolonuna 25 μL DNase/RNaz içermeyen moleküler dereceli su ekleyin. RNA'yı toplamak ve tüpü ıslak buza aktarmak için 2 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
8. Ana karışımı üreticinin talimatlarına göre yapın. Numuneyi içerecek 96 oyuklu bir reaksiyon plakasının her bir oyuğuna 7 μL ana karışım dağıtın. İzole edilen her RNA'nın 13 μL'sini reaksiyon plakasına aktarın.
   NOT: Ana karışım, havuzlanmış örnek protokolünde kullanılanla aynıdır ancak MS2 faj RNA artışını içermez.
9. Reaksiyon plakası üzerindeki pozitif kontrol kuyusuna 2 μL pozitif kontrol çözeltisi ve 11 μL DNase/RNaz içermeyen moleküler dereceli su ekleyerek pozitif kontrolü hazırlayın. Reaksiyon plakası üzerindeki negatif kontrol kuyusuna 13 μL DNase/RNaz içermeyen moleküler dereceli su ekleyerek şablonsuz kontrolü hazırlayın.
10. Reaksiyon plakalarını optik film ile örtün ve numuneleri iyice karıştırmak için 2 dakika vorteks yapın. Reaksiyon plakalarını 650 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Plakaları RT-PCR sistemine aktarın ve ana karışım için uygun döngü parametreleriyle çalıştırın.
    1. Burada belirtilen ana karışım için 25 °C'yi 2 dakika, 53 °C'yi 10 dakika, 95 °C'yi 2 dakika, 40 döngüyü 3 saniye boyunca 95 °C'ye ve 60 °C'yi 30 saniyeye kadar kullanın.

Sonuçlar

Bugüne kadar laboratuvar tarafından alınan numunelerin büyük çoğunluğu kabul edilmiş ve ilk görsel kalite kontrol adımını geçmiştir. Bir numuneyi reddetme ihtiyacı, numunenin işlenmesini ve/veya numunenin genel sonuçlarını olumsuz yönde etkileyebilecek nedenlerle sınırlıdır. Spesifik olarak, tüpteki yanlış hacim, tükürük için doğal olmayan kıvam veya renk, numune homojenizasyonuna yardımcı olmak için kullanılan seramik boncukların olmaması ve eksik...

Tartışmalar

Numune işleme sırasında dikkatli olunması gereken adımlar vardır. Numune hacmine, kıvamına, rengine ve eklenen boncukların varlığına bakan ilk kalite kontrol adımı, prosesin genel başarısı için kritik öneme sahiptir. Doğru miktarda tükürük içermeyen örneklere sahip tüpler, çok az tükürük yeterli genetik materyale neden olamayacağından yanlış bir negatif üretebilir; tersine, çok fazla tükürük, RNA tamponu ile doğru oranda olmaz ve RNA bozulması mey...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Step MM, no ROX	Thermo Fisher	A28523
1.2 mlDeep well Plates	Fisher	AB0564
100 mL reagent reservoirs	Corning	4872
2.8 mm Ceramic Beads	OMNI	19-646
25 ml conical w/screw cap	VWR	76338-496
50mL V bottom reservoirs	Costar	4870
5430-High-Speed Centrifuge	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf Tube	Fisher	14282300
8 strip tubes for QuantStudio	life technologies	4316567
Beta Mercaptoethanol	Fisher	AC125472500
Ethanol 200 Proof, Molecular Biology Grade	Fisher	BP28184
Microamp Endura Optical 96-well fast clear reaction plate with barcode	life technologies	4483485
Microamp Fast Optical 96 well plate	Fisher	4346906
Mini Microcentrifuge	Corning Medical	6770
optical caps for strip tubes	life technologies	AB-1820
Optical Film	Thermo Fisher	4311971
PCR plate sealing film Non-optical	Fisher	AB-0558
PCR Plate semi-skirted	Fisher	14230244
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
Quick RNA Viral Kit confirmation	Zymo	R1035
Reagent Reservoir, 100ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
Small Biohazard Bags	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19 kit	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrifuge	Thermo Fisher	75009525
Transfer Pipet	Fisher	22170404
Viral 96 Kit	Zymo	R1041
Vortex Mixer	Fisher	2215414