JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الوضوح البصري هو ميزة رئيسية للعمل البيولوجي والفسيولوجي للخلية في أسماك الزرد. يتم وصف طرق قوية لقياس نمو الخلايا في الحيوانات الفردية التي تسمح برؤى جديدة حول كيفية دمج نمو العضلات الهيكلية والأنسجة المجاورة مع نمو الجسم كله.

Abstract

يمكن استخدام عدد من الطرق لتصور الخلايا الفردية في جميع أنحاء الجسم من أسماك الزرد الجنينية أو اليرقية أو الأحداث الحية. لقد أظهرنا أنه يمكن مسح الأسماك الحية ذات الأغشية البلازمية ذات العلامات الفلورية في مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري من أجل تحديد حجم الأنسجة العضلية وعدد الألياف العضلية الموجودة. يتم وصف النهج الفعالة لقياس عدد الخلايا وحجمها في الحيوانات الحية بمرور الوقت والتحقق من صحتها مقابل طرق تجزئة أكثر صعوبة. يتم وصف الطرق التي تسمح بالتحكم في النشاط الكهربائي للعضلات ، وبالتالي الانقباض. فقدان نشاط انقباض العضلات الهيكلية قلل بشكل كبير من نمو العضلات. في اليرقات ، يتم وصف بروتوكول يسمح بإعادة إدخال نشاط الانقباض النمطي المستحضر كهربائيا. تقلل الطرق الموصوفة من تأثير التباين بين الأفراد وستسمح بتحليل تأثير المحفزات الكهربائية أو الوراثية أو الدوائية أو البيئية على مجموعة متنوعة من معلمات النمو الخلوي والفسيولوجي في سياق الكائن الحي. يمكن إجراء متابعة طويلة الأجل للآثار المقاسة لتدخل محدد في وقت مبكر من الحياة على الأفراد في وقت لاحق.

Introduction

نمو الأنسجة المنظمة ، بما في ذلك الزيادة في عدد الخلايا (فرط التنسج) و / أو حجم الخلية (التضخم) ، هو عامل حاسم في التنمية والتجديد والتكيف البيئي والتطوري. على الرغم من التقدم الهائل في الفهم الجيني الجزيئي لكل من البيولوجيا الخلوية والتنموية على مدى العقود الأخيرة ، إلا أن الفهم الميكانيكي لتنظيم الأنسجة وحجم الأعضاء لا يزال في مهده. أحد أسباب هذه الثغرة في المعرفة هو صعوبة قياس نمو الأنسجة في الكائنات الحية بدقة مكانية وزمنية ضرورية.

يمكن قياس الجوانب المختلفة لنمو الكائنات الحية بأكملها بشكل متكرر بمرور الوقت ، مما يكشف عن منحنيات النمو لكل فرد1،2،3،4،5. تسمح طرق المسح الضوئي المتطورة بشكل متزايد ، مثل قياس امتصاص الأشعة السينية المزدوجة (DXA) ، والتصوير المقطعي المحوسب (CT) ، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، بتتبع نمو أعضاء كاملة ومناطق الجسم الأخرى (على سبيل المثال ، عضلات الهيكل العظمي الفردية المحددة) في الأفراد الفرديين ، سواء في البشر أو في الكائنات الحية النموذجية6،7،8،9،10 . ومع ذلك ، فإن هذه الطرق ليس لديها بعد القرار للكشف عن الخلايا الفردية ، وبالتالي كان من الصعب تمييز الروابط بين السلوكيات الخلوية ونمو مستوى الأنسجة. ولإقامة مثل هذه الروابط، غالبا ما اعتمدت الدراسات التقليدية على مجموعات من الحيوانات الفردية المماثلة، والتي يتم التضحية بعدد قليل منها في نقاط زمنية متتالية ثم تحليلها بالتفصيل الخلوي. وتتطلب هذه النهج متوسط التغيرات المرصودة عبر مجموعات من الأفراد (يفضل أن يكونوا متشابهين، ولكن مع ذلك متغيرين)، وبالتالي يعانون من نقص في الدقة الزمنية والمكانية، مما يجعل من الصعب العثور على أحداث مترابطة على المستوى الخلوي توحي بالسبب والنتيجة.

وقد تحايلت الدراسات التي أجريت على الكائنات الحية النموذجية لللافقاريات، في البداية في C. elegans و D. melanogaster، على هذه المشاكل من خلال تطوير الفحص المجهري البصري لتحقيق الدقة الخلوية وقياس النمو بدقة بمرور الوقت لدى الأفراد الفرديين. وقد كشفت مثل هذه الدراسات عن سلوكيات سلالة الخلايا الثابتة بشكل لافت للنظر في نمو هذه الكائنات الحية النموذجية الصغيرة11،12،13،14،15،16،17. ومع ذلك ، فإن العديد من الحيوانات ، بما في ذلك جميع الفقاريات ، لديها سلالات خلايا غير محددة ، وتتحكم في نمو الأنسجة من خلال عمليات التغذية المرتدة الغامضة التي تعمل على تحويل برنامج النمو المشفر وراثيا إلى كائن حي ثلاثي الأبعاد وظيفي مع جميع أنسجته وأعضائه المكونة لها متطابقة بشكل مناسب في الحجم. لفهم عمليات النمو المعقدة هذه ، من المستحسن تصوير أنسجة أو أعضاء كاملة بمرور الوقت في أفراد فرديين يمكن التلاعب بهم تجريبيا عن طريق التدخلات الوراثية أو الدوائية أو غيرها في وقت الاختيار وتحليل التأثير لاحقا.

كل عضلة هيكلية فقارية لها حجم وشكل ووظيفة محددة ، وتفاعلات مميزة بشكل جيد مع الأنسجة المجاورة ، مثل العظام والأوتار والأعصاب. بعض العضلات صغيرة ، وتقع تحت الجلد مباشرة ، وبالتالي فهي مرشحة جيدة لدراسات التصوير عالية الدقة. على غرار معظم الأعضاء ، تنمو كل عضلة طوال الحياة الجنينية وما بعد الولادة والأحداث ، قبل الوصول إلى حجم بالغ مستقر. ومع ذلك ، تتمتع العضلات أيضا بقدرة فريدة على تغيير الحجم خلال حياة البالغين ، اعتمادا على الاستخدام والتغذية18 ، وهذه الخاصية لها تأثير كبير على اللياقة البدنية للكائنات الحية ، والأداء الرياضي ، والعيش المستقل. فقدان كتلة العضلات ووظيفتها في سن الشيخوخة ، ساركوبينيا ، هو قضية تثير قلقا متزايدا للمجتمعات التي تواجه شيخوخة السكان19،20،21.

لقد ركزنا نحن وآخرون على نمو كتل محددة من الأنسجة العضلية الهيكلية في الجسم المتكرر جزئيا ليرقات الزرد ، كنظام مغلق على ما يبدو يحتوي على عدة مئات من الخلايا حيث يمكن ملاحظة نمو الأنسجة وصيانتها وإصلاحها والتلاعب بها22،23،24،25،26. في حين تم الإبلاغ سابقا عن بعض الأعمال الكمية 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ، لا تتوفر طريقة مفصلة ومعتمدة لقياس نمو العضلات بالتفاصيل الخلوية في الكائنات الفقارية الفردية بمرور الوقت. هنا يتم وصف بروتوكول فعال لكيفية إجراء مثل هذه القياسات المتكررة ، إلى جانب التحقق من الصحة ، ويتم توفير مثال على استخدامه لتحليل التغيرات في كل من النمو الضخامي والمفرط استجابة للنشاط الكهربائي المتغير.

Protocol

تم إجراء جميع الأبحاث الموصوفة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وبموجب تراخيص مناسبة من وزارة الداخلية البريطانية وفقا لقانون الحيوان (الإجراءات العلمية) لعام 1986 والتعديلات اللاحقة. يجب تربية الأجنة / اليرقات عند 28.5 درجة مئوية حتى الانتهاء من عملية المعدة ولكن يمكن الاحتفاظ بها بعد ذلك عند 22-31 درجة مئوية للتحكم في معدل التطور. يمكن مسح الأسماك ضوئيا أو تحفيزها في درجة حرارة الغرفة.

1. تخدير يرقات الزرد

  1. عبر مناسبة الفلورسنت مراسل الأسماك البالغة مثل Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg المرجع 36 أو Tg(α-actin:mCherry-CAAX)pc22Tg المرجع37 وجمع الأجنة كما هو موضح38.
  2. في الوقت الذي تختاره ، مثل يومين بعد الإخصاب (dpf) ، قم بتخدير الأجنة لفترة وجيزة باستخدام وسط الأسماك المحتوي على Tricaine (إما ماء السمك أو وسط E3) ، وفحص EGFP أو mCherry تحت المجهر الفلوري ، مثل Leica MZ16F. إذا كان لدى المرء العديد من الأجنة ، فحدد تلك التي تحتوي على ألمع إشارة. إعادة الأجنة إلى وسط الأسماك الطبيعي مباشرة بعد الفحص.

2. تصاعد الأسماك للمسح البؤري

  1. قم بتشغيل نظام المسح الضوئي بالليزر البؤري وأشعة الليزر، للسماح للنظام بالاستقرار لمدة 30-60 دقيقة.
    ملاحظة: هنا ، استخدمنا مجهر Zeiss LSM 5 Exciter مع حامل مواد مستقيم (مما يعزز مسافة العمل) مجهز بهدف غمر الماء 20x / 1.0 واط.
  2. تحضير 1٪ من الأغاروز منخفض الانصهار (LMA) والاحتفاظ بها في كتلة حرارية 37 درجة مئوية للاستخدام المتكرر في أنبوب 1.5 مل. لتجنب الصدمة الحرارية ، قم بإزالة aliquot LMA من كتلة الحرارة واتركه يبرد إلى أعلى من الإعداد مباشرة قبل تطبيقه على اليرقة ، واختبر على جلد المرء للحكم على درجة الحرارة المناسبة ، كما هو الحال عند تقييم درجة حرارة حليب الأطفال الصناعي.
  3. اختر الأسماك المراد تركيبها وقم بتخدير كل سمكة بشكل عابر بدورها باستخدام Tricaine (0.6 mM في وسط الأسماك).
  4. خذ طبق بتري قطره 60 مم تم طلاؤه بطبقة من 1٪ من الأغاروز وضعه على مسرح مجهر تشريح.
  5. انقل اليرقة باستخدام ماصة باستور بلاستيكية سعة 1 مل إلى طبق بتري المطلي بسعة 60 مم وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط المنقول. بعد ذلك ، مع الاستمرار في استخدام ماصة باستور ، ضع 5 إلى 10 قطرات من LMA على الأسماك ووضعها بسرعة أفقيا في العرض الجانبي باستخدام ملقط (أو إبرة زجاجية دقيقة مصقولة بالنار) قبل ضبط LMA. للتصوير الأمثل ، من المستحسن وضع اليرقة بالقرب من السطح العلوي ل LMA.
    1. بدلا من ذلك ، باستخدام ماصة باستور البلاستيكية 1 مل ، قم بجمع اليرقة بأقل وسط سمكي ممكن ، ونقل اليرقة إلى أليكوت من LMA المبردة. اسمح لليرقة بالغرق لمدة 5 ثوان لتصبح محاطة بالكامل ب LMA. ثم ، استرجع اليرقة وانقلها في قطرة من LMA إلى طبق Petri المغطى بالأغاروس. توجيه بسرعة ووضع اليرقة كما هو موضح أعلاه.
  6. قم بتوجيه اليرقة بكل من محاورها الأمامية الخلفية والظهرية البطنية ضمن 10 درجات من الأفقي (انظر الملاحظة "حول الخطأ وتصحيحه" ، عند النقطة 4.6 أدناه).
    1. إذا لم يتم تثبيت اليرقة بشكل صحيح أفقيا بالقرب من سطح قطرة الأغاروز ، فقم بإزالتها وإعادة تضمينها. يمكن استرداد اليرقات بسهولة عن طريق الشفط اللطيف باستخدام ماصة باستور البلاستيكية الدقيقة 1 مل ، ويمكن إزالة LMA بلطف باستخدام Kimwipes. الممارسة حقا تجعل الكمال في إجراء التركيب. قضاء فترة ما بعد الظهر في تضمين بعض اليرقات غير المهمة قبل تجربة ذلك في تجربة حقيقية.
      ملاحظة: في تصميم المجهر: تستخدم العديد من المختبرات المجاهر البؤرية المقلوبة للتصوير من خلال غطاء زجاجي. لقد وجدنا أن تكرار تضمين وإزالة الأسماك المحتجزة في الأغاروز تحت غطاء للمراقبة في المجهر المقلوب يؤدي إلى فقدان أكبر للعينات أثناء المسح المتكرر مقارنة بالإجراء الموصوف باستخدام مجهر مستقيم. لهذا السبب ، يوصى باستخدام نظام مستقيم ، إن وجد. ومع ذلك ، فإن مفتاح البيانات عالية الجودة هو الاختيار والاستخدام المناسبين لمعلمات الهدف والمسح الضوئي ، وهو موضوع كبير جدا للمناقشة هنا.

3. المسح البؤري

  1. عندما يتم تعيين LMA ، قم بإغراق الطبق بحوالي 10 مل من وسط السمك المحتوي على Tricaine. إذا كنت تخطط لالتقاط أكوام متحدة البؤرة ، اترك الأسماك المثبتة ترتاح لمدة 10 دقائق على الأقل قبل الشروع في المسح الضوئي ، حيث يحدث بعض تورم الأغاروز.
  2. قم بتحميل طبق العينة إلى مرحلة النظام البؤري ، وحدد موقع اليرقة وركز على السوميت المطلوب. يمكن اختيار Somite 17 بسبب سهولة توطينه بالقرب من فتحة الشرج وسهولة التصوير. تحقق عن طريق عد السوميت من الأمام.
    ملاحظة: يتم دمج السوميت الأول خلف الأذن وليس له حدود أمامية ، ولكن يمكن ملاحظة أنه يحتوي بسهولة على ألياف عضلية مخططة.
  3. قم بالإعداد كما لو كنت تلتقط مكدسا Z عن طريق تحديد الجزء العلوي (أي فوق الجلد مباشرة) والأسفل (أي أسفل notochord مباشرة ، بحيث يشمل السوميت بأكمله ، حتى لو كانت الأسماك مثبتة بشكل منحرف قليلا). يمكن التقاط كل من الجانبين الأيسر والأيمن حسب الرغبة. سيضمن ذلك أن جميع عمليات مسح YZ السريعة تلتقط المنطقة (المناطق) المطلوبة.
  4. التقط صورة XY على النحو التالي. قم بتوجيه منطقة المسح الضوئي فيما يتعلق بالأسماك ، كما يسمح برنامج confocal . ضع الأسماك مع المحور الأمامي الخلفي الموازي للمحور X المصور والمحور الظهري البطني الموازي للمحور Y مع السوميت 17 في وسط الحقل كما هو موضح في الملف التكميلي 1. ركز على مستوى متوسط المستوى في العضلة العلوية التي يكون فيها نصفي السوميت المحوري والتنويم المغناطيسي بالكامل مرئيين مع العضلة المحورية الرأسية والأفقية ويلتقطان صورة XY عالية الدقة. تذكر تسمية الصورة وحفظها.
  5. التقط صورة YZ واحدة أو أكثر على النحو التالي. في النتائج التمثيلية (أدناه) تتم مقارنة دقة طرق 2-slice و 4-slice. في نهج 2-slice ، يتم استخدام عمليات مسح XY و YZ واحدة. في نهج 4 شرائح ، يتم حساب متوسط ثلاث عمليات مسح YZ لإعطاء تقدير أكثر دقة لحجم myotome. إذا تطلب البرنامج البؤري ذلك، فأعد توجيه حقل الفحص.
    1. ارسم خطا ظهريا إلى بطنيا بدقة عبر السوميت المختار عموديا على المحور الأمامي الخلفي للسمكة في موضع أمامي خلفي محدد. قم بإجراء فحص خط مكدس Z.
    2. كرر فحص خط YZ ثلاث مرات في مواضع أمامية خلفية محددة على طول العضلة المحددة لالتقاط YZa و YZm و YZp. وترد النتائج التمثيلية في الشكل 2 ألف. قم بتسمية هذه الصور وحفظها مع صورة XY ذات الصلة.
      ملاحظة: عند اختيار طائرات YZ: يكون العضل على شكل حرف V ويتغير شكله أثناء النمو. للحصول على التقييم الأكثر دقة لحجم العضل 17 باستخدام طريقة 4 شرائح، ضع YZa على الطرف الأمامي من العضلة ، YZp على الأطراف الخلفية للعضل عند الأطراف الظهرية والبطنية القصوى ، و YZm في منتصف الطريق بين YZa و YZp. بافتراض أن السوميت يتناقص بشكل موحد ، فإن متوسط القياسات من كل قسم YZ سيمثل العضل ككل. بالنسبة لطريقة 2-slice ، يجب وضع فحص YZ الفردي في الطرف الخلفي من الحاجز العضلي الأفقي ، والذي يتوافق تقريبا مع المركز الأمامي الخلفي للعضلة ذات الأهمية (مثل YZm). بدلا من ذلك ، يمكن أخذ مجموعة من ثلاثة أقسام YZ في الجزء الأمامي والأوسط والخلفي من الحاجز العضلي الأفقي ، ولكن ، كما هو موضح أدناه ، فإن هذا القياس سيزيد قليلا عن حجم العضلة أو يقلل من تقديره (بالنسبة للسوميت السطحي والذيلي ، على التوالي ، بسبب استدقاق عضلة العضلات). في الأساس ، يعد الاتساق في تحديد موقع مستوى (طائرات) شريحة YZ بين الأسماك والتجارب أمرا أساسيا للتكرار.

4. التحليل

  1. مع تغير حجم العضل على طول الأسماك بطريقة متدرجة ، اعمل دائما مع نفس السوميت في الدراسات المقارنة.
  2. لقياس وحساب حجم myotome ، استخدم البرنامج البؤري (مثل ملفات .lsm التي تم إنشاؤها باستخدام برنامج مجهر Zeiss ZEN) أو برنامج تحليل الصور العالمي مفتوح المصدر ، مثل Fiji / ImageJ.
    ملاحظة: في حالة تغيير تنسيقات الملفات، تأكد من نقل حجم الخطوة Z بشكل صحيح، حيث لا يمكن لجميع البرامج قراءة تنسيقات الملفات البؤرية الخاصة بشكل صحيح. على سبيل المثال، لاستيراد صورة مسح ضوئي لسطر ZEN إلى فيجي، استخدم أولا الأمر ملف/تصدير للتصدير .tif في نافذة الصورة كاملة الدقة - تنسيق مستوى واحد، ثم الاستيراد إلى فيجي. على الرغم من أنه يمكن فتح YZ scan.lsm مباشرة في فيجي ، إلا أن صور YZ الناتجة يتم ضغطها بشكل عام في البعد Z بسبب التقييم غير الصحيح لحجم الخطوة Z.
  3. التحليل باستخدام ZEN
    1. أولا، افتح ملفات XY scan.lsm في ZEN. انتقل إلى علامة التبويب الرسومات وحدد أداة الخط. ارسم خطا بين الميوسيبتا العموديين للسوميت 17 يمتد على طول العضل بالكامل (بالتوازي مع المحور الأمامي الخلفي للسمكة). حدد المربع M للكشف عن قيم القياس (الطول = 89.71 ميكرومتر، راجع الملف التكميلي 2).
    2. افتح ملفات YZ scan.lsm. ضمن علامة التبويب الرسومات ، حدد أداة Bezier المغلقة . ارسم حول محيط العضلة العضلية. بمجرد الانتهاء ، حدد المربع M ، وهذا من شأنه أن يكشف عن قيمة القياس (المساحة = 11980.01 ميكرومتر2 ، انظر الملف التكميلي 3).
    3. سجل قيم كل قياس يدويا في جدول بيانات. متوسط قياسات CSA كما هو مطلوب. يمكن حساب حجم العضلة على أنها الحجم = طول العضل × CSA ، أي 89.71 ميكرومتر × 11980.01 ميكرومتر2 = 1.075 × 106 ميكرومتر3.
  4. التحليل باستخدام فيجي/ImageJ
    1. افتح ملفات XY scan.lsm في فيجي/ImageJ. تحقق مما إذا كانت صور XY المفتوحة مباشرة في فيجي تتم معايرتها بشكل صحيح في الحجم ، كما ينبغي أن تكون.
    2. حدد أداة الخط المستقيم من الرموز. ارسم خطا على طول السوميت 17 كما هو موضح في الخطوة 4.3.1. قم بتعيين معلمات القياس بالانتقال إلى تحليل، ثم حدد تعيين القياسات...، وحدد المربعات التالية المنطقة وتسمية العرض. للقياس، ما عليك سوى الضغط على مفتاح التشغيل السريع M، أو الانتقال إلى قائمة تحليل وتحديد قياس. تسرد نافذة منبثقة ناتجة جميع قيم القياس (أي الطول = 90.023 ميكرومتر؛ انظر الملف التكميلي 4). يمكن حفظ النتائج في شكل .csv وفتحها في Microsoft Excel أو ما شابه ذلك للتحليل اللاحق.
    3. لقياس CSA على صور YZ، افتح صور YZ بتنسيق .tif كما هو موضح في الخطوة 4.2.
    4. قم بمعايرة صور YZ .tif لأنها غير معايرة عند تصديرها. يمكن الحصول على معلمات المعايرة في ZEN من خلال الانتقال إلى معلومات الصور المحددة: سجل قيم Scaling X (0.489 μm) و Scaling Z (0.890 μm ؛ راجع الملف التكميلي 5). بعد ذلك ، بينما تكون الصور مفتوحة في فيجي ، انتقل إلى صورة وحدد خصائص .... أدخل 0.489 ميكرومتر لعرض البكسل وارتفاع البكسل ، و 0.890 ميكرومتر لعمق Voxel. حدد المربع عمومي لتطبيق المعايرة عالميا إذا كان من المتوقع تكرار قياس صور YZ (انظر الملف التكميلي 6).
      ملاحظة: تأكد من التقاط جميع صور YZ باستخدام نفس معلمات المسح الضوئي ؛ أعد تشغيل Fiji/ImageJ أو عدل قيم المعايرة إذا كانت هناك حاجة إلى مجموعة جديدة من المعايرة.
    5. لقياس CSA لصور YZ المعايرة، حدد أداة تحديدات المضلع من الرموز. ارسم حول محيط السوميت ، واضغط على M للكشف عن قيم القياس (المساحة = 11980.395 ميكرومتر2 ؛ انظر الملف التكميلي 7). يمكن حساب حجم العضلة على أنها الحجم = طول العضل × CSA ، أي 90.023 ميكرومتر × 11980.395 ميكرومتر2 = 1.079 × 106 ميكرومتر3.
    6. كرر القياسات على صور XY وYZ الأخرى. يوصى باستخدام نفس البرنامج لجميع القياسات داخل سلسلة تجريبية من أجل الاتساق. تقدير الحجم من كل برنامج متشابه ولكنه غير متطابق بسبب أدوات الرسم المتميزة ، أي ZEN = 1.074 × 10 6 μm 3 و Fiji / ImageJ = 1.079 × 106 μm3. يمكن حساب نمو العضلة بين نقطتين زمنيتين (أي 3 إلى 4 dpf) على النحو التالي: (المجلد 4 dpf - المجلد 3 dpf) / المجلد 3 dpf × 100٪.
      ملاحظة: حول الخطأ وتصحيحه. أثناء التركيب ، يجب توجيه الأسماك بمستواها السهمي (أي المحاور الأمامية الخلفية والظهرية البطنية) أقرب ما يمكن إلى الأفقي ، لتجنب الانحناء واللف ، على التوالي. وذلك لأن كلا من طول العضل L الذي تم قياسه من فحص XY و CSA المقاسة من مسح YZ سيتم المبالغة في تقديره إذا أظهرت الأسماك انحرافا (دوران حول المحور الظهري البطني) بسبب التركيب الأمامي الخلفي المائل. يجب ألا يؤثر الميل أو اللفة أثناء التركيب على القياسات بعد المسح الضوئي كما هو موضح في القسم 3. ومع ذلك، فإن الدوران الظهري البطني (اللفة) يقلل من جودة الصورة. يوضح علم المثلثات البسيط أن ما يصل إلى 10 درجات من الانحراف سيعطي خطأ بنسبة 3٪ في قياس الحجم ، حيث يتم قياس L و CSA لكل زيادة بما يتناسب مع (cosq)-1 ، حيث q هي الزاوية البعيدة عن الأفقي الأمامي الخلفي (yaw). سيعطي خصم 15 درجة و 20 درجة 7٪ و 13٪ مبالغ فيه في تقدير الحجم ، على التوالي.
      نظرا لأن notochord أسطواني ، يمكن استخدام تضمين notochord بأكمله في مسح YZ لحساب زاوية ومدى الميل من اتجاه وحجم المحاور الرئيسية والثانوية وبالتالي تصحيح L و CSA المقاسة لتحقيق أقصى قدر من الدقة. CSA المصححة = قياس CSA × محور Notochord الثانوي / محور Notochord الرئيسي. L المصحح = L المقاس × محور Notochord الثانوي / محور Notochord في اتجاه المجهر Z .
      ويسمح النظر مرة أخرى بإدخال تصويب إضافي على L. مع نمو العضلة ، فإنها تنحرف في المستوى الإكليلي (طبيعي إلى المحور الظهري البطني) بحيث يكون العضل الإنسي أماميا قليلا للعضلة الجانبية. عند النظر إليها من الظهرية ، تشكل myosepta الرأسية على الجانبين الأيسر والأيمن شيفرون عريض يشير إلى الأمام. إذا كان الانحراف منخفضا ، فإن هذا المورفولوجيا لا يؤثر على قياس L. ولكن إذا كان الانحراف كبيرا ، يصبح التصحيح المثلثي صعبا والنهج الأفضل هو قياس True L مباشرة عن طريق تقدير إحداثيات XYZ للنقطتين حيث يلتقي العضلة العضلية الرأسية الأمامية والخلفية ب notochord في الحاجز العضلي الأفقي. يسمح علم المثلثات البسيط بحساب True L من هذه الإحداثيات ك L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)2]. نقاط الضعف في هذا النهج الأخير هي أنه أ) يمكن أن يختلف اختيار النقاط مع المشغل و ب) لا يتم الاحتفاظ بأي سجل مرئي للنقاط المختارة. ولا يؤثر هذا الاعتبار على تصحيح اتفاق الأمن الجماعي.

5. طريقة اختيارية: إزالة وإعادة إدخال النشاط الكهربائي للعضلات

  1. إنشاء غرفة تحفيز.
    1. خذ صفيحة بئر 6 × 35 مم ، وقم بإنشاء فتحتين صغيرتين (قطرهما <5 مم ، ومسافة 1 سم) على كل جانب من جوانب كل بئر (انظر الشكل 1) باستخدام مكواة لحام ضيقة.
      ملاحظة: تعامل مع مكواة اللحام الساخنة بعناية واعمل في غطاء الدخان إذا رغبت في ذلك لتجنب استنشاق البخار.
    2. خيط زوجا من الأسلاك الفضية أو البلاتينية (طولها ~ 20 سم) من خلال فتحات كل بئر (انظر الشكل 1). يمكن تطبيق مادة لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام (مثل BluTack) بالقرب من الفتحات للحفاظ على الأسلاك في مكانها ، وضمان فصل 1 سم بين الأسلاك (انظر الشكل 1).
  2. عند 3 dpf ، قسم الأسماك إلى ثلاثة شروط: الأسماك المتوسطة التحكم ، غير النشطة ، وغير النشطة + Stim.
    1. بالنسبة للمجموعات غير النشطة وغير النشطة + Stim ، قم بتخدير اليرقات في 72 ساعة بعد الإخصاب (hpf) باستخدام Tricaine (0.6 mM).
      ملاحظة: وفقا للمرجع38، تذوب الأليكوتات المجمدة من مخزون التريكاين وتخفف (40 ميكرولتر/مل من وسط الأسماك، إلى تركيز نهائي قدره 0.6 ملليمتر) قبل إضافتها إلى الأسماك. لا تضيف تريكاين مباشرة إلى الماء الذي يحتوي على الأسماك ، لأن بعض الأسماك يمكن أن تتلقى جرعات عالية. يجب استخدام مخزون Tricaine في غضون شهر وعدم إعادة تجميده أبدا.
    2. بالنسبة للأسماك متوسطة التحكم في الأسماك ، اتركها دون تخدير.
  3. في وقت (أوقات) محدد بعد بداية التعرض للتريكاين (أي عند 80 hpf) ، قم بإعداد مجموعة Inactive + Stim للتحفيز.
    1. تحضير 60 مل من 2 ٪ من الأغاروز (1.2 غرام من مسحوق الأغاروز في 60 مل من وسط السمك) ، وتذوب بالكامل باستخدام الميكروويف ، بارد ، إضافة tricaine وصب 4 مل في كل بئر من غرفة التحفيز (الشكل 1).
    2. أضف على الفور أمشاط 4 آبار مصنوعة حسب الطلب بين الأقطاب الكهربائية (التي تم إنشاؤها عن طريق قطع البلاستيك (مثل البولي بروبيلين) ذات الأبعاد المطلوبة والالتصاق ببعضها البعض باستخدام Superglue ؛ انظر الشكل 1). اتركيه لمدة 10 دقائق حتى يتم ضبط الجل. إزالة الأمشاط بعناية لإنشاء أربعة آبار مستطيلة.
    3. املأ كل بئر بماء التريكاين وضع يرقة واحدة غير نشطة + Stim مخدرة في كل بئر باستخدام ماصة دقيقة ، مع محورها الأمامي الخلفي عموديا على الأقطاب الكهربائية (انظر الشكل 1).
    4. تحقق تحت المجهر الفلورسنت تشريح ما إذا كانت كل سمكة مخدرة بالكامل داخل كل بئر من الغرفة.
  4. قم بتوصيل محفز توليد نمط كهروفسيولوجي قابل للتعديل بالغرفة عبر وحدة تحكم القطبية ، باستخدام مشابك التماسيح المتصلة بكل من الأقطاب الكهربائية على جانب واحد من الغرفة (انظر الشكل 1).
    ملاحظة: يتم استخدام وحدة التحكم في القطبية لعكس القطبية كل 5 ثوان ، وذلك لمنع التحليل الكهربائي وتآكل الأقطاب الكهربائية.
  5. تحفيز الأسماك. على سبيل المثال ، 1s مع قطار من نبضات 200 ، 20 فولت ، مع مدة نبض 0.5 مللي ثانية وفصل نبض 4.5 مللي ثانية ، مرة واحدة كل 5 ثوان يعطي نظام فعال لمقاومة الانكماش المتكرر للكتائب.
  6. تحقق بانتظام تحت المجهر للتأكد من تحفيز الأسماك ؛ مثال التحفيز الكهربائي يجب أن يحفز انكماشا ثنائيا مرئيا وحركة طفيفة ، مرة واحدة كل 5 ثوان.
  7. بالنسبة لنظام المقاومة / القوة العالية ، قم بتحفيز الأسماك بتردد عال لمدة 5 دقائق ، ثلاث مرات ، مع فصل كل نوبة بمقدار 5 دقائق من الراحة.
    ملاحظة: بينما تستريح الأسماك على جانب واحد من الغرفة ، يمكن توصيل مقاطع التماسيح بزوج القطب الكهربائي على الجانب الآخر من الغرفة ، ويتم تحفيز تلك الأسماك الإضافية.
  8. بعد التحفيز ، قم بإزالة الأسماك بعناية من كل بئر عن طريق تنظيفها بلطف باستخدام ماصة بلاستيكية والعودة إلى الحاضنة في وسط أسماك طازج يحتوي على تريكاين.
  9. صب الماء التريكاين بعيدا من داخل الغرفة واستخدم الملقط لقطع وإزالة الأغاروز من كل بئر. شطف الآبار بماء الصنبور واتركها حتى تجف.
    ملاحظة: في حالة استخدام أقطاب سلكية فضية، قد يتراكم أكسيد الفضة أحيانا على سطح السلك بعد تجربة التحفيز. نظرا لأن أكسيد الفضة أقل توصيلا من الفضة ، للحفاظ على قابلية التكاثر ، افرك أكسيد الفضة بعناية من السلك باستخدام Kimwipes قبل إعادة استخدام الإعداد.

النتائج

قياس سريع ودقيق لحجم السوميت
يتم وصف طريقة لإعداد العينات والحصول على البيانات والتحليل الحجمي الذي يسمح بالقياس السريع لنمو العضلات في يرقات أسماك الزرد. يمكن قياس حجم العضلات في الحيوانات الحية باستخدام الأسماك الموسومة على أغشية البلازما الخاصة بها باستخدام GFP مستهدف بالغ?...

Discussion

هنا نبلغ عن طريقة للتقدير الدقيق والفعال لحجم العضلات من يرقات الزرد الحية في مراحل أو في المتغيرات الجينية التي لا يكون فيها التصبغ عائقا كبيرا أمام التصوير وعندما يكون التخدير العابر و / أو التجميد جيد التحمل. في حين أننا استخدمنا المجهر البؤري للمسح الضوئي بالليزر ، فإن الأساليب الموصو...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

المؤلفون مدينون بشدة لجهود أعضاء مختبر هيوز الدكتور سيتارامايا أتيلي وجانا كوث وفرناندا باجانكا وفيكتوريا سي ويليامز ويانيف هينيتس وجورجيا بيرجامين وفلاديمير سنيتكوف لتطوير البروتوكولات الموصوفة ، وإلى هنري روهل وكريستينا هاموند وديفيد لانجيناو وبيتر كوري لمشاركة البلازميدات أو خطوط الزرد. SMH هو عالم في مجلس البحوث الطبية (MRC) مع منحة البرنامج G1001029 و MR / N021231 / 1 و MR / W001381 / 1support. عقد MA برنامج تدريب الدكتوراه MRC دكتوراه من كلية كينغز كوليدج لندن. استفاد هذا العمل من المدخلات المثلثية لديفيد م. روبنسون ، الباحث والمرشد والصديق.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesive, Blu TackBostik--
Aerosol vacuum ---
AgaroseSigma-AldrichA9539-
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heaterCole-ParmerSBH130-
BODIPY FL C5-ceramideThermo ScientificD3521To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires---
Fiji/imageJNational Institutes of Health, NIH--
Fish medium, Fish water--Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium--E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscopeLeicaLeica MZ16FFluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needleWorld Precision Instruments, Inc.1B100-6To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulatorGrass InstrumentsS88Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task WipersKimberly-Clark Professional13258179-
Laser scanning microscope (LSM) ZeissZeiss LSM 5 Exciter
Zeiss LSM 880		LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plateThermo Scientific140675-
Objective, 20×/1.0W water immersionZeiss--
Pasteur Pipette, Graduated 1 mLStarlab GroupE1414-0100-
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mLStarlab GroupE1414-1100-
Petri dish, 60 mmSigma-AldrichP5481-
Plasmid, CMV-CeruleanChristina L. Hammond (University of Bristol)pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAXHenry Roehl (University of Sheffield)-For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used);
synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller Hoefer Scientific InstrumentsPC750-
Soldering iron---
TricaineSigma-AldrichE10521Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
VolocityPerkin Elmer/Quorum Technologies Inc--
Watchmaker forceps, No. 5---
Wire, PlatinumGoodfellowPT005142/120.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, SilverAcros Organics3177300100.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFPDavid M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)-ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAXPeter D. Currrie (ARMI, Monash University)-ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP--ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
ZEN softwareZeiss--

References

  1. Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
  2. Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
  3. Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
  4. Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
  5. Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
  6. Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
  7. Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
  8. Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
  9. Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
  10. Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
  11. Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
  12. Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
  13. Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  14. Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
  15. Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
  16. Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
  17. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  18. Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
  19. Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
  20. Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
  21. Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
  22. Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
  23. Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
  24. Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
  25. Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
  26. Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
  27. Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
  28. Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
  29. Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
  30. Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
  31. Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
  32. Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
  33. Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
  34. Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
  35. Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
  36. Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
  37. Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
  38. Westerfield, M. . The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  39. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  40. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
  41. Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
  42. Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
  43. Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
  44. Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
  45. Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
  46. Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
  47. Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
  48. Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved