Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

Resumo

A clareza óptica é uma grande vantagem para o trabalho biológico e fisiológico celular no peixe-zebra. Métodos robustos para a medição do crescimento celular em animais individuais são descritos que permitem novos insights sobre como o crescimento do músculo esquelético e dos tecidos vizinhos são integrados com o crescimento de todo o corpo.

Resumo

Vários métodos podem ser usados para visualizar células individuais em todo o corpo de peixes-zebra embrionários, larvais ou juvenis vivos. Mostramos que peixes vivos com membranas plasmáticas marcadas fluorescentemente podem ser escaneados em um microscópio confocal de varredura a laser, a fim de determinar o volume de tecido muscular e o número de fibras musculares presentes. Abordagens eficientes para a medição do número e tamanho celular em animais vivos ao longo do tempo são descritas e validadas contra métodos de segmentação mais árduos. São descritos métodos que permitem o controle da atividade elétrica muscular e, portanto, contrátil. A perda de atividade contrátil do músculo esquelético reduziu muito o crescimento muscular. Em larvas, é descrito um protocolo que permite a reintrodução da atividade contrátil evocada elétrica padronizada. Os métodos descritos minimizam o efeito da variabilidade interindividual e permitirão a análise do efeito de estímulos elétricos, genéticos, medicamentosos ou ambientais em uma variedade de parâmetros de crescimento celular e fisiológico no contexto do organismo vivo. O acompanhamento a longo prazo dos efeitos medidos de uma intervenção definida no início da vida em indivíduos pode ser subsequentemente realizado.

Introdução

O crescimento regulado do tecido, compreendendo o aumento do número de células (hiperplasia) e/ou do tamanho celular (hipertrofia), é um fator crucial no desenvolvimento, regeneração e adaptação ecológica e evolutiva. Apesar dos enormes avanços na compreensão genética molecular da biologia celular e do desenvolvimento nas últimas décadas, a compreensão mecanicista da regulação do tamanho dos tecidos e órgãos ainda está em sua infância. Uma das razões para essa lacuna no conhecimento é a dificuldade de quantificar o crescimento tecidual em organismos vivos com a necessária precisão espacial e temporal.

Vários aspectos do crescimento de organismos inteiros podem ser medidos repetidamente ao longo do tempo, revelando curvas de crescimento para cada indivíduo ^1,2,3,4,5. Métodos de varredura cada vez mais sofisticados, como a absorciometria dupla de raios X (DXA), a tomografia computadorizada (TC) e a ressonância magnética (RM), permitem o rastreamento do crescimento de órgãos inteiros e outras regiões do corpo (por exemplo, músculos esqueléticos identificados individualmente) em indivíduos isolados, humanos e em organismos modelo 6,7,8,9,10 . No entanto, esses métodos ainda não têm a resolução de revelar células individuais e, portanto, as ligações entre os comportamentos celulares e o crescimento do nível tecidual têm sido difíceis de discernir. Para fazer tais ligações, os estudos tradicionais muitas vezes se basearam em coortes de animais individuais semelhantes, alguns dos quais são sacrificados em pontos de tempo sucessivos e, em seguida, analisados em detalhes citológicos. Tais abordagens requerem a média das mudanças observadas entre grupos de indivíduos (de preferência semelhantes, mas ainda assim variáveis) e, portanto, sofrem de uma falta de resolução temporal e espacial, tornando difícil encontrar eventos correlacionados no nível celular sugestivos de causa e efeito.

Estudos em organismos modelo de invertebrados, inicialmente em C. elegans e D. melanogaster, contornaram esses problemas desenvolvendo microscopia óptica para alcançar a resolução celular e medir com precisão o crescimento ao longo do tempo em indivíduos individuais. Tais estudos têm revelado comportamentos de linhagem celular surpreendentemente invariantes no crescimento desses pequenos organismos-modelo 11,12,13,14,15,16,17. No entanto, muitos animais, incluindo todos os vertebrados, têm linhagens celulares indeterminadas e controlam o crescimento de tecidos por meio de misteriosos processos de feedback que servem para transformar o programa de crescimento geneticamente codificado em um organismo tridimensional funcional com todos os seus tecidos e órgãos constituintes adequadamente combinados em tamanho. Para entender esses processos complexos de crescimento, é desejável visualizar tecidos ou órgãos inteiros ao longo do tempo em indivíduos individuais que possam ser manipulados experimentalmente por intervenções genéticas, farmacológicas ou outras em um momento de escolha e o efeito posteriormente analisado.

Cada músculo esquelético vertebrado tem um tamanho, forma e função definidos, e interações bem caracterizadas com tecidos adjacentes, como osso, tendão e nervos. Alguns músculos são pequenos, ficam logo abaixo da pele e, portanto, são bons candidatos para estudos de imagem de alta resolução. Semelhante à maioria dos órgãos, cada músculo cresce ao longo da vida embrionária, pós-natal e juvenil, antes de atingir um tamanho adulto estável. O músculo, no entanto, também tem uma capacidade única de mudar de tamanho durante a vida adulta, dependendo do uso e da nutrição¹⁸, e essa propriedade tem um grande impacto na aptidão do organismo, no desempenho esportivo e na vida independente. A perda de massa muscular e função na velhice, a sarcopenia, é uma questão de crescente preocupação para as sociedades frente ao envelhecimento da população 19,20,21.

Nós e outros temos focado no crescimento de blocos definidos de tecido muscular esquelético no corpo segmentarmente repetitivo de larvas de peixe-zebra, como um sistema aparentemente fechado contendo várias centenas de células nas quais o crescimento, manutenção e reparo tecidual podem ser observados e manipulados 22,23,24,25,26. Embora alguns trabalhos quantitativos tenham sido relatados anteriormente 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35^, nenhum método detalhado e validado de medir o crescimento muscular em detalhes celulares em organismos vertebrados individuais ao longo do tempo está disponível. Aqui um protocolo eficiente de como realizar tais medições repetidas é descrito, juntamente com a validação, e um exemplo de seu uso para analisar mudanças no crescimento hipertrófico e hiperplásico em resposta à atividade elétrica alterada é fornecido.

Protocolo

Todas as pesquisas descritas foram realizadas em conformidade com as diretrizes institucionais e sob licenças adequadas do Ministério do Interior do Reino Unido, de acordo com a Lei Animal (Procedimentos Científicos) de 1986 e modificações subsequentes. Os embriões/larvas devem ser criados a 28,5 °C até à conclusão da gastrulação, mas podem então ser mantidos a 22-31 °C para controlar a taxa de desenvolvimento. Os peixes podem ser escaneados ou estimulados à temperatura ambiente.

1. Anestesiar larvas de peixe-zebra

1. Cruzar peixes adultos repórteres fluorescentes adequados, como Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)^vu119Tg referência³⁶ ou Tg(α-actina:mCherry-CAAX)^pc22Tg referência 37 e coletar embriões conforme descrito³⁸.
2. No momento da escolha, como 2 dias após a fertilização (dpf), anestesiar embriões brevemente usando meio de peixe contendo tricaína (água de peixe ou meio E3) e rastrear EGFP ou mCherry sob um microscópio de fluorescência, como uma Leica MZ16F. Se alguém tem muitos embriões, selecione aqueles com o sinal mais brilhante. Devolver os embriões ao meio normal dos peixes imediatamente após o rastreio.

2. Peixes de montagem para varredura confocal

1. Ligue o sistema de varredura a laser confocal e os lasers, para deixar o sistema se estabilizar por 30-60 min.
   NOTA: Aqui, usamos um microscópio Zeiss LSM 5 Exciter com suporte de materiais verticais (o que aumenta a distância de trabalho) equipado com uma objetiva de imersão em água de 20x/1,0 W.
2. Preparar 1% de agarose de baixa fusão (LMA) e manter num bloco de calor de 37 °C para utilização repetida num tubo de 1,5 ml. Para evitar o choque térmico, remova a alíquota LMA do bloco de calor e deixe-a esfriar até um pouco acima da configuração antes de aplicar na larva, testando contra a pele para julgar a temperatura apropriada, como ao avaliar a temperatura do leite em pó para bebês.
3. Selecione os peixes a serem montados e anestesiar transitoriamente cada peixe por sua vez com Tricaína (0,6 mM em meio de peixe).
4. Pegue uma placa de Petri de 60 mm de diâmetro que tenha sido revestida com uma camada de agarose a 1% e coloque no palco de um microscópio de dissecação.
5. Transfira a larva com uma pipeta Pasteur de plástico de 1 mL para a placa de Petri revestida de 60 mm e remova o máximo de meio transferido possível. Em seguida, ainda usando a pipeta Pasteur, coloque de 5 a 10 gotas de LMA no peixe e posicione-se rapidamente horizontalmente em vista lateral com pinça (ou uma agulha de vidro fina polida pelo fogo) antes que o LMA se fixe. Para uma imagem ideal, é desejável posicionar a larva perto da superfície superior do LMA.
   1. Alternativamente, usando uma pipeta Pasteur de plástico de 1 mL, colete a larva com o mínimo de meio de peixe possível e transfira a larva para a alíquota do LMA resfriado. Permita que a larva afunde por 5 s para ficar totalmente cercada por LMA. Em seguida, recupere a larva e transfira-a em uma gota de LMA para a placa de Petri revestida de agarose. Oriente e posicione rapidamente a larva conforme descrito acima.
6. Orientar a larva com os seus eixos anteroposterior e dorsoventral a menos de 10° da horizontal (ver a nota «Sobre o erro e a sua correcção», ponto 4.6 infra).
   1. Se a larva não estiver corretamente montada horizontalmente perto da superfície da gota de agarose, remova e reincorpore. As larvas podem ser facilmente recuperadas por sucção suave usando uma pipeta Pasteur de plástico microfina de 1 mL, e o LMA pode ser removido suavemente usando Kimwipes. A prática realmente faz a perfeição no procedimento de montagem; passar uma tarde incorporando algumas larvas sem importância antes de tentar isso em um experimento real.
      NOTA: No projeto do microscópio: Muitos laboratórios usam microscópios confocais invertidos para imagens através de uma folha de cobertura. Descobrimos que a incorporação repetida e remoção de peixes mantidos em agarose sob uma folha de cobertura para observação em um microscópio invertido leva a uma maior perda de amostras durante a varredura repetida do que no procedimento descrito com um microscópio vertical. Por esta razão, recomenda-se o uso de um sistema vertical, se disponível. No entanto, uma chave para dados de alta qualidade é a seleção adequada e o uso de parâmetros objetivos e de varredura, um assunto muito grande para discussão aqui.

3. Varredura confocal

1. Quando o LMA estiver definido, inunde o prato com cerca de 10 mL de meio de peixe contendo tricaína. Se estiver planejando capturar pilhas confocais, deixe o peixe montado descansar por pelo menos 10 minutos antes de prosseguir para a varredura, pois ocorre algum inchaço de agarose.
2. Carregue o prato de amostra para o estágio do sistema confocal, localize a larva e concentre-se na somita desejada. O somite 17 pode ser escolhido devido à sua facilidade de localização perto do respiradouro anal e facilidade de imagem. Verifique contando somitos de anterior.
   NOTA: O primeiro somito é fundido atrás da orelha e não tem borda anterior, mas pode ser facilmente observado como tendo fibras musculares estriadas.
3. Configure como se quisesse capturar uma pilha Z definindo topo (ou seja, logo acima da pele) e fundo (ou seja, logo abaixo da notocorda, de modo a incluir todo o somite, mesmo que o peixe esteja montado ligeiramente inclinado). Ambos os lados esquerdo e direito podem ser capturados conforme desejado. Isso garantirá que todas as varreduras rápidas do YZ capturem a(s) região(ões) desejada(s).
4. Capture uma imagem XY da seguinte maneira. Oriente a área de varredura em relação ao peixe, conforme o software confocal permitir. Posicione o peixe com o eixo anteroposterior paralelo ao eixo X fotografado e o eixo dorsoventral paralelo ao eixo Y com o somite 17 no centro do campo, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1. Concentre-se em um plano de nível médio no miótomo superior no qual todas as metades do somito epaxial e hipaxial juntamente com os mioseptos verticais e horizontais são visíveis e capture uma imagem XY de alta resolução. Lembre-se de nomear e salvar a imagem.
5. Capture uma ou mais imagens YZ da seguinte maneira. Nos Resultados Representativos (abaixo) a precisão dos métodos de 2 fatias e 4 fatias é comparada. Na abordagem de 2 fatias, são empregadas varreduras XY e YZ únicas. Na abordagem de 4 fatias, três exames YZ são calculados em média para fornecer uma estimativa mais precisa do volume do miótomo. Se exigido pelo software confocal, reoriente o campo de varredura.
   1. Desenhar uma linha precisamente dorsal a ventral através do somite escolhido perpendicular ao eixo anteroposterior do peixe em uma posição anteroposterior selecionada. Execute uma varredura de linha Z-stack.
   2. Repita a varredura da linha YZ três vezes em posições anteroposteriores definidas ao longo do miótomo selecionado para capturar YZa, YZm e YZp. Os resultados representativos são apresentados na Figura 2A. Nomeie e salve essas imagens junto com a imagem XY relacionada.
      NOTA: Na seleção de planos YZ: O miótomo é em forma de V e sua forma muda durante o crescimento. Para obter a avaliação mais precisa do volume do miótomo 17 com o método de 4 fatias, posicione YZa na ponta anterior do miotoma, YZp nas pontas posteriores do miótomo nos extremos dorsal e ventral e YZm a meio caminho entre YZa e YZp. Supondo que o somite se afunile uniformemente, a média das medidas de cada seção YZ representará o miótomo como um todo. Para o método de 2 fatias, a varredura YZ única deve ser posicionada na extremidade posterior do miosepto horizontal, que corresponde aproximadamente ao centro anteroposterior do miótomo de interesse (como YZm). Alternativamente, um conjunto de três seções YZ pode ser tomado na anterior, média e posterior do miosepto horizontal, mas, como mostrado abaixo, tal medida irá superestimar ligeiramente ou subestimar o volume do miótomo (para somitos rostral e caudal, respectivamente, devido ao afunilamento do miótomo). Fundamentalmente, a consistência no posicionamento do(s) plano(s) de fatia YZ entre peixes e experimentos é fundamental para a reprodutibilidade.

4. Análise

1. Como o miótomo muda de tamanho ao longo do peixe de forma gradual, trabalhe sempre com o mesmo somite em estudos comparativos.
2. Para medir e calcular o volume do miótomo, use o software confocal (como os arquivos .lsm criados usando o software de microscópio Zeiss ZEN) ou o software universal de análise de imagem de código aberto, como Fiji/ImageJ.
   NOTA: Se estiver alterando os formatos de arquivo, verifique se o tamanho da etapa Z foi transferido corretamente, pois nem todos os softwares podem ler os formatos de arquivo confocais proprietários corretamente. Por exemplo, para importar uma imagem de varredura de linha ZEN para Fiji, primeiro use o comando Arquivo/Exportar para exportar como .tif na janela Imagem de resolução total - formato de plano único e, em seguida, importe para Fiji. Embora o YZ scan.lsm possa ser aberto diretamente em Fiji, as imagens YZ resultantes geralmente são compactadas na dimensão Z devido à avaliação incorreta do tamanho da etapa Z.
3. Análise utilizando ZEN
   1. Primeiro, abra os arquivos scan.lsm XY no ZEN. Vá para a guia Gráficos e selecione a ferramenta Linha. Desenhe uma linha entre os dois mioseptos verticais do somite 17 abrangendo todo o comprimento do miótomo (paralelo ao eixo anteroposterior do peixe). Marque a caixa M para revelar os valores da medição (Comprimento = 89,71 μm, consulte o Arquivo Suplementar 2).
   2. Abra os arquivos scan.lsm do YZ . Na guia Gráficos , selecione a ferramenta Bezier fechado . Desenhe ao redor do perímetro do miotoma. Uma vez concluída, marque a caixa M, isso revelaria o valor da medição (Área = 11980,01 μm², consulte o Arquivo Suplementar 3).
   3. Registre os valores de cada medição manualmente em uma planilha. Faça a média das medições do CSA conforme necessário. O volume do miótomo pode ser calculado como Volume = Comprimento do miótomo x CSA, ou seja, 89,71 μm x 11980,01 μm² = 1,075 x 10⁶ μm³.
4. Análise usando Fiji/ImageJ
   1. Abra os arquivos scan.lsm XY em Fiji/ImageJ. Verifique se as imagens XY abertas diretamente em Fiji estão corretamente calibradas em escala, como deveriam ser.
   2. Selecione a ferramenta Linha reta nos ícones. Desenhe uma linha ao longo do comprimento do somite 17, conforme descrito na etapa 4.3.1. Defina os parâmetros de medição indo para Analisar, selecione Definir medidas..., e marque as seguintes caixas Área e Exibir rótulo. Para medir, basta pressionar a tecla de atalho M ou ir para o menu Analisar e selecionar Medir. Uma janela pop-up resultante lista todos os valores de medição (ou seja, Comprimento = 90,023 μm; consulte Arquivo Suplementar 4). Os resultados podem ser salvos na forma de .csv e abertos no Microsoft Excel ou similar para análise subsequente.
   3. Para medir CSA nas imagens YZ , abra imagens YZ no formato .tif, conforme descrito na etapa 4.2.
   4. Calibre as imagens de .tif YZ à medida que elas não são calibradas quando exportadas. Os parâmetros para a calibração podem ser obtidos no ZEN acessando as Informações das imagens selecionadas: registre os valores de Escala X (0,489 μm) e Escala Z (0,890 μm; consulte o Arquivo Suplementar 5). Em seguida, enquanto as imagens estiverem abertas em Fiji, vá para Imagem e selecione Propriedades.... Insira 0,489 μm para a largura e a altura do pixel e 0,890 μm para a profundidade do Voxel. Marque a caixa Global para aplicar a calibração universalmente se a medição repetida de imagens YZ for antecipada (consulte o Arquivo Suplementar 6).
      NOTA: Certifique-se de que todas as imagens YZ são capturadas usando os mesmos parâmetros de digitalização; reinicie Fiji/ImageJ ou modifique os valores de calibração se um novo conjunto de calibração for necessário.
   5. Para medir o CSA das imagens YZ calibradas, selecione a ferramenta Seleções de polígonos nos ícones. Desenhe em torno do perímetro da somita e pressione M para revelar os valores da medição (Área = 11980,395 μm²; consulte o Arquivo Suplementar 7). O volume do miótomo pode ser calculado como Volume = Comprimento do miótomo x CSA, ou seja, 90,023 μm x 11980,395 μm² = 1,079 x 10⁶ μm³.
   6. Repita as medições nas outras imagens XY e YZ. Recomenda-se usar o mesmo software para todas as medições dentro de uma série experimental para consistência. A estimativa de volume de cada software é semelhante, mas não idêntica, devido às ferramentas de desenho distintas, ou seja, ZEN = 1,074 × 10 6 μm 3 e Fiji/ImageJ = 1,079 × 10⁶ μm³. O crescimento do miótomo entre dois pontos de tempo (ou seja, 3 a 4 dpf) pode ser calculado como: (Volume 4 dpf - Volume 3 _dpf)/ Volume _{3 dpf} × 100%.
      Observação : sobre o erro e sua correção. Durante a montagem, o peixe deve ser orientado com seu plano sagital (ou seja, os eixos anteroposterior e dorsoventral) o mais próximo possível da horizontal, para evitar guinada e rolagem, respectivamente. Isso ocorre porque tanto o comprimento L do miótomo medido a partir da varredura XY quanto o CSA medido a partir de uma varredura YZ serão superestimados se o peixe mostrar guinada (rotação em torno do eixo dorsoventral) devido à montagem anteroposterior oblíqua. Nem o passo nem o rolo durante a montagem devem afetar as medições após a digitalização, conforme descrito na secção 3. No entanto, a rotação dorsoventral (rolo) degrada a qualidade da imagem. A trigonometria simples mostra que até 10° de guinada dará 3% de erro na medida do volume, como medido L e CSA cada aumento em proporção a (cosq)-1, onde q é o ângulo afastado da horizontal ^{anteroposterior} (guinada). 15° e 20° off darão 7% e 13% de superestimativas de volume, respectivamente.
      Como a notocorda é cilíndrica, a inclusão de toda a notocorda na varredura YZ pode ser usada para calcular o ângulo e a extensão da obliquidade a partir da orientação e magnitude dos eixos maior e menor e, assim, corrigir o L e o CSA medidos para maximizar a precisão. CSA corrigido = CSA medido x Eixo menor Notocordd/Eixo maior Notochord. L corrigido = L medido x eixo menor da notocorda/eixo da notocorda na direção Z do microscópio.
      Uma consideração adicional permite a correção adicional de L. À medida que o miótomo cresce, ele se inclina no plano coronal (normal ao eixo dorsoventral) de tal forma que o miótomo medial é ligeiramente anterior ao miotomo lateral. Vistos de dorsal, os mioseptos verticais nos lados esquerdo e direito formam uma ampla divisa apontando para o lado anterior. Se a guinada for baixa, essa morfologia não afeta a medição de L. Mas se a guinada for significativa, a correção trigonométrica torna-se desafiadora e uma abordagem melhor é medir o L verdadeiro diretamente, estimando as coordenadas XYZ dos dois pontos onde os mioseptos verticais anterior e posterior encontram a notocorda no miosepto horizontal. A trigonometria simples permite o cálculo de L verdadeiro a partir dessas coordenadas como L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)²]. Os pontos fracos desta última abordagem são que a) a seleção dos pontos pode variar de acordo com o operador e b) nenhum registro visual dos pontos escolhidos é mantido. Esta consideração não afeta a correção da CSA.

5. Método opcional: Remover e reintroduzir a atividade elétrica muscular

1. Crie uma câmara de estimulação.
   1. Pegue uma placa de poço de 6 x 35 mm, crie duas pequenas aberturas (<5 mm de diâmetro, 1 cm de distância) em cada lado de cada poço (veja a Figura 1) usando um ferro de solda estreito.
      NOTA: Manuseie o ferro de solda quente com cuidado e trabalhe em um exaustor, se desejar, para evitar a inalação de vapor.
   2. Enfie um par de fios de prata ou platina (~20 cm de comprimento) através das aberturas de cada poço (ver Figura 1). O material adesivo reutilizável (por exemplo, BluTack) pode ser aplicado perto das aberturas para manter os fios no lugar e garantir uma separação de 1 cm entre os fios (consulte a Figura 1).
2. A 3 dpf, divida os peixes em três condições: Peixe médio Controle, Inativo e Inativo + Stim.
   1. Para os grupos Inativo e Inativo+Stim, anestesiar larvas às 72 horas pós-fertilização (hpf) com Tricaína (0,6 mM).
      NOTA: Seguindo a referência³⁸, as alíquotas congeladas da unidade populacional de tricazina são descongeladas e diluídas (meio de peixe de 40 μL/ml, até uma concentração final de 0,6 mM) antes da adição ao peixe. Não adicione tricaine diretamente na água contendo peixes, pois alguns peixes podem receber altas doses. O estoque de tricaína deve ser usado dentro de um mês e nunca ser recongelado.
   2. Para os peixes médios Controle de peixes, deixe-os não anestesiados.
3. Em momento(s) selecionado(s) após o início da exposição à tricapina (ou seja, a 80 hpf), prepare o grupo Inactive+Stim para estimulação.
   1. Preparar 60 mL de agarose a 2% (1,2 g de agarose em pó em 60 mL de meio peixe) e derreter totalmente com micro-ondas, esfriar, adicionar tricapina e despejar 4 mL em cada poço da câmara de estimulação (Figura 1).
   2. Adicione imediatamente pentes personalizados de 4 poços entre os eletrodos (criados pelo corte de plásticos (por exemplo, polipropileno) das dimensões desejadas e pela união usando Supercola; veja a Figura 1). Aguarde 10 minutos para o gel definir. Remova os pentes cuidadosamente para criar quatro poços retangulares.
   3. Encha cada poço com água tricaina e coloque uma única larva Inactive+Stim anestesiada em cada poço usando uma micropipeta, com seu eixo anteroposterior perpendicular aos eletrodos (ver Figura 1).
   4. Verifique sob o microscópio fluorescente de dissecação se cada peixe está totalmente anestesiado dentro de cada poço da câmara.
4. Conecte um estimulador gerador de padrões eletrofisiológicos ajustável à câmara por meio de um controlador de polaridade, usando clipes de crocodilo conectados a cada um dos eletrodos de um lado da câmara (veja a Figura 1).
   NOTA: O controlador de polaridade é usado para inverter a polaridade a cada 5 s, de modo a evitar eletrólise e corrosão dos eletrodos.
5. Estimule os peixes. Por exemplo, 1s com um trem de 200, 20 V pulsos, com 0,5 ms de duração de pulso e 4,5 ms de separação de pulso, uma vez a cada 5 s dá um regime eficaz de resistência à contração tetânica repetida.
6. Verifique regularmente sob o microscópio para confirmar se os peixes estão sendo estimulados; o estímulo elétrico de exemplo deve induzir uma contração bilateral visível e um leve movimento, uma vez a cada 5 s.
7. Para um regime de resistência/força elevada, estimule o peixe a uma frequência elevada para uma luta de 5 min, três vezes, com cada luta separada por 5 min de descanso.
   NOTA: Enquanto os peixes de um lado da câmara estão descansando, os clipes de crocodilo podem ser conectados ao par de eletrodos do outro lado da câmara, e esses peixes adicionais estimulados.
8. Após a estimulação, remova cuidadosamente os peixes de cada poço, lavando-os suavemente com uma pipeta de plástico e retorne à incubadora em meio de peixe fresco contendo tricaine.
9. Despeje a água tricaine de dentro da câmara e use fórceps para cortar e remover a agarose de cada poço. Lave os poços com água da torneira e deixe secar.
   NOTA: Se estiver usando eletrodos de fio de prata, ocasionalmente o óxido de prata pode se acumular na superfície do fio após um experimento de estimulação. Como o óxido de prata é menos condutor do que a prata, para manter a reprodutibilidade, esfregue cuidadosamente o óxido de prata do fio usando Kimwipes antes de reutilizar a configuração.

Resultados

Uma medida rápida e precisa do volume de somite
Um método de preparação de amostras, aquisição de dados e análise volumétrica que permite a rápida medição do crescimento muscular em larvas de peixe-zebra é descrito. O tamanho do músculo pode ser medido em animais vivos usando peixes marcados em suas membranas plasmáticas com uma GFP direcionada à membrana (β-actina: HRAS-EGFP) ou mCherry (α-actina: mCherry-CAAX). As larvas foram anestesiadas transitoriamente com tric...

Discussão

Aqui relatamos um método para estimativa precisa e eficiente do volume muscular de larvas vivas de peixe-zebra em estágios ou em variantes genéticas em que a pigmentação não é um grande obstáculo à imagem e quando a anestesia transitória e/ou imobilização é bem tolerada. Considerando que empregamos a microscopia confocal de varredura a laser, as abordagens descritas são aplicáveis à microscopia confocal ou de folha de luz de disco giratório e a qualquer outro método que crie pilhas de imagens em planos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive, Blu Tack	Bostik	-	-
Aerosol vacuum	-	-	-
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	-
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414	Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heater	Cole-Parmer	SBH130	-
BODIPY FL C5-ceramide	Thermo Scientific	D3521	To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires	-	-	-
Fiji/imageJ	National Institutes of Health, NIH	-	-
Fish medium, Fish water	-	-	Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium	-	-	E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscope	Leica	Leica MZ16F	Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needle	World Precision Instruments, Inc.	1B100-6	To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulator	Grass Instruments	S88	Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	13258179	-
Laser scanning microscope (LSM)	Zeiss	Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880	LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate	Thermo Scientific	140675	-
Objective, 20×/1.0W water immersion	Zeiss	-	-
Pasteur Pipette, Graduated 1 mL	Starlab Group	E1414-0100	-
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL	Starlab Group	E1414-1100	-
Petri dish, 60 mm	Sigma-Aldrich	P5481	-
Plasmid, CMV-Cerulean	Christina L. Hammond (University of Bristol)		pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAX	Henry Roehl (University of Sheffield)	-	For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller	Hoefer Scientific Instruments	PC750	-
Soldering iron	-	-	-
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521	Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
Volocity	Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc	-	-
Watchmaker forceps, No. 5	-	-	-
Wire, Platinum	Goodfellow	PT005142/12	0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, Silver	Acros Organics	317730010	0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFP	David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)	-	ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX	Peter D. Currrie (ARMI, Monash University)	-	ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP	-	-	ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
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