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要約

光学的透明度は、ゼブラフィッシュの細胞生物学的および生理学的研究にとって大きな利点です。骨格筋および隣接組織の成長が全身の成長とどのように統合されるかについての新しい洞察を可能にする、個々の動物の細胞増殖を測定するための堅牢な方法が説明されています。

要約

生きた胚、幼虫または幼体のゼブラフィッシュの体全体の個々の細胞を視覚化するために、いくつかの方法を用いることができる。蛍光マークされた原形質膜を持つ生きた魚を共焦点レーザー走査顕微鏡でスキャンして、筋肉組織の体積と存在する筋線維の数を決定できることを示しています。生きた動物の細胞数とサイズを経時的に測定するための効率的なアプローチが説明され、より困難なセグメンテーション法に対して検証されています。筋肉の電気的、したがって収縮性の活動の制御を可能にする方法が記載されている。骨格筋収縮活動の喪失は、筋肉の成長を大幅に減少させました。幼虫では、パターン化された電気的誘発収縮活性の再導入を可能にするプロトコルが記載されている。記載された方法は、個体間変動の影響を最小限に抑え、生物の状況における様々な細胞および生理学的成長パラメータに対する電気的、遺伝的、薬物的、または環境刺激の効果の分析を可能にするであろう。その後、個人に対する定義された早期介入の測定された効果の長期フォローアップを行うことができます。

概要

細胞数の増加(過形成)および/または細胞サイズ(肥大)を含む調節された組織成長は、発生、再生、および生態学的および進化的適応における重要な要素です。ここ数十年で細胞生物学と発生生物学の両方の分子遺伝学的理解が大幅に進歩したにもかかわらず、組織と臓器のサイズの制御の機構的理解はまだ始まったばかりです。知識におけるこの不足の理由の1つは、必要な空間的および時間的精度で生物の組織成長を定量化することの難しさです。

生物全体の成長のさまざまな側面を経時的に繰り返し測定することができ、個々の成長曲線を明らかにすることができます1,2,3,4,5。二重X線吸収測定法(DXA)、コンピューター断層撮影(CT)、磁気共鳴画像法(MRI)などのますます洗練されたスキャン方法により、ヒトとモデル生物の両方の単一の個人における臓器全体および他の身体領域(たとえば、個々の識別された骨格筋)の成長の追跡が可能になります6,7,8,9,10.しかし、これらの方法では個々の細胞を明らかにする分解能がまだないため、細胞の挙動と組織レベルの成長との関連を特定することは困難でした。このようなリンクを作成するために、従来の研究では、類似した個々の動物のコホートに依存することが多く、そのうちのいくつかは連続した時点で犠牲にされ、細胞学的に詳細に分析されます。このようなアプローチでは、(できれば類似しているが、それでも変動する)個人のグループ間で観察された変化を平均化する必要があるため、時間的および空間的分解能の欠如に悩まされ、原因と結果を示唆する細胞レベルで相関イベントを見つけるのが困難です。

無脊椎動物のモデル生物に関する研究は、最初はC.エレガンスとD.メラノガスターでしたが、光学顕微鏡を開発して細胞分解能を達成し、単一の個体の経時的な成長を正確に測定することで、これらの問題を回避しました。このような研究は、これらの小さなモデル生物の成長における著しく不変な細胞系譜挙動を明らかにしました11、12、13、14、15、16、17。しかし、すべての脊椎動物を含む多くの動物は、不確定な細胞系譜を持ち、遺伝的にコードされた成長プログラムを、そのすべての構成組織と器官が適切に一致する機能的な3次元生物に変えるのに役立つ神秘的なフィードバックプロセスによって組織の成長を制御します。これらの複雑な成長過程を理解するためには、選択した時点で遺伝的、薬理学的または他の介入によって実験的に操作され、その後効果を分析できる単一の個体において、組織全体または臓器全体を経時的に画像化することが望ましい。

各脊椎動物の骨格筋は、定義されたサイズ、形状、機能、および骨、腱、神経などの隣接組織との十分に特徴付けられた相互作用を持っています。一部の筋肉は小さく、皮膚のすぐ下にあるため、高解像度の画像検査に適しています。ほとんどの臓器と同様に、各筋肉は、安定した成人のサイズに達する前に、胎児、出生後、および若年期を通じて成長します。しかし、筋肉には、使用と栄養に応じて、成人期にサイズを変える独自の能力もあり18、この特性は、生物のフィットネス、スポーツパフォーマンス、および自立生活に大きな影響を与えます。老年期の筋肉量と機能の低下であるサルコペニアは、人口の高齢化に直面している社会にとってますます懸念されている問題です19,20,21。

私たちらは、ゼブラフィッシュ幼虫のセグメント的に繰り返される体における骨格筋組織の定義されたブロックの成長に、組織の成長、維持、および修復を観察および操作できる数百の細胞を含む明らかに閉じたシステムとして焦点を当てました22,23,24,25,26。いくつかの定量的研究は以前に報告されていますが25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、個々の脊椎動物生物の細胞の詳細で筋肉成長を経時的に測定する詳細で検証された方法は利用できません。ここでは、そのような繰り返し測定を実行する方法のための効率的なプロトコルが検証とともに説明され、変化した電気的活動に応答して肥大および過形成成長の両方の変化を分析するためのその使用例が提供される。

プロトコル

記載されているすべての研究は、1986年の動物(科学的手順)法およびその後の修正に従って、制度上のガイドラインに準拠し、英国内務省からの適切なライセンスの下で実施されました。胚/幼虫は原腸形成が完了するまで28.5°Cで飼育する必要がありますが、その後、発生速度を制御するために22〜31°Cに保つことができます。魚は室温でスキャンまたは刺激することができます。

1.ゼブラフィッシュの幼虫を麻酔する

  1. Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg参照36またはTg(α-アクチン:mCherry-CAAX)pc22Tg参照37などの適切な蛍光レポーター成魚を交配し、38に記載のように胚を収集する。
  2. 受精後2日(dpf)などの選択時に、トリカイン含有魚培地(魚水またはE3培地のいずれか)を使用して胚を短時間麻酔し、ライカMZ16Fなどの蛍光顕微鏡下でEGFPまたはmCherryをスクリーニングします。胚が多い場合は、最も明るい信号を持つ胚を選択します。スクリーニング後すぐに胚を通常の魚培地に戻す。

2.共焦点スキャン用の魚の取り付け

  1. 共焦点レーザースキャンシステムとレーザーの電源を入れて、システムを30〜60分間安定させます。
    注:ここでは、20倍/1.0 Wの水浸対物レンズを備えた直立材料スタンド(作動距離を延長する)を備えたツァイスLSM 5励起顕微鏡を使用しました。
  2. 1%低融点アガロース(LMA)を調製し、1.5 mLチューブで繰り返し使用するために37°Cのヒートブロックに保持します。ヒートショックを避けるために、ヒートブロックからLMAアリコートを取り出し、設定のすぐ上まで冷ましてから幼虫に塗布し、粉ミルクの温度を評価するときと同様に、皮膚に対してテストして適切な温度を判断します。
  3. マウントする魚を選択し、トリカイン(魚の培地で0.6 mM)で各魚を順番に一時的に麻酔します。
  4. 1%アガロースの層でコーティングされた直径60mmのペトリ皿を取り、解剖顕微鏡のステージに置きます。
  5. 幼虫を1 mLのプラスチックパスツールピペットで60 mmコーティングされたペトリ皿に移し、できるだけ多くの移した培地を取り除きます。次に、パスツールピペットを使用して、LMAを5〜10滴魚の上に置き、LMAが固まる前に鉗子(または火で磨かれた細かいガラス針)を使用して側面図で水平にすばやく配置します。最適なイメージングのためには、幼虫をLMAの上面近くに配置することが望ましい。
    1. あるいは、1 mLのプラスチックパスツールピペットを使用して、できるだけ少ない魚の培地で幼虫を収集し、幼虫を冷却されたLMAのアリコートに移します。幼虫を5秒間沈めて、LMAに完全に囲まれます。次に、幼虫を回収し、LMAを一滴入れてアガロースでコーティングしたペトリ皿に移します。上記のように幼虫の向きをすばやく調整して配置します。
  6. 前後軸と背腹側軸の両方を水平から10°以内に向ける幼虫の向きを変えます(以下のポイント4.6の「エラーとその修正について」のメモを参照)。
    1. 幼虫がアガロース液滴の表面近くに水平に正しく取り付けられていない場合は、取り外して再度埋め込みます。幼虫は、極細の1 mLプラスチックパスツールピペットを使用して穏やかに吸引することで簡単に回収でき、LMAはキムワイプを使用して穏やかに除去できます。練習は本当に取り付け手順で完璧になります。実際の実験でこれを試す前に、重要でない幼虫を埋め込む午後を過ごしてください。
      注:顕微鏡の設計について:多くのラボでは、カバーガラス越しのイメージングに倒立共焦点顕微鏡を使用しています。倒立顕微鏡で観察するためにカバーガラスの下にアガロースに保持された魚を繰り返し埋め込んだり除去したりすると、正立顕微鏡で説明した手順よりも繰り返しスキャン中にサンプルの損失が大きくなることがわかりました。このため、可能であれば、直立システムの使用をお勧めします。それにもかかわらず、高品質のデータの鍵は、対物レンズとスキャンパラメータの適切な選択と使用であり、ここで議論するには大きすぎる主題です。

3.共焦点スキャン

  1. LMAが固まったら、約10mLのトリカイン含有魚培地を皿に浸します。共焦点スタックをキャプチャする場合は、アガロースの腫れが発生するため、スキャンに進む前に、マウントされた魚を少なくとも10分間休ませてください。
  2. サンプル皿を共焦点系のステージにロードし、幼虫を見つけて、目的の体節に焦点を合わせます。Somite 17は、肛門ベント付近の局在化が容易で、イメージングが容易であるため、選択することができる。前部から体節を数えて確認してください。
    注:最初の体節は耳の後ろで融合しており、前縁はありませんが、横紋筋線維があることが容易に観察できます。
  3. 上部(つまり、皮膚のすぐ上)と下部(つまり、魚がわずかに歪んで取り付けられていても、体節全体を含むように脊索のすぐ下)を定義することにより、 Zスタックをキャプチャするように設定します。左側と右側の両方を必要に応じてキャプチャできます。これにより、すべての高速 YZ スキャンが目的の領域を確実にキャプチャします。
  4. 次のようにXY画像をキャプチャします。共焦点ソフトウェアが許す限り、魚に対してスキャン領域の向きを設定します。補足ファイル1に示すように、画像化されたX軸に平行な前後軸とY軸に平行な背腹軸を持つ魚を配置し、体節17をフィールドの中央に配置します。最上部の筋腫の中層平面に着目し、上軸および催眠体節の半分全体が垂直および水平の筋中隔とともに表示され、高解像度のXY画像をキャプチャします。画像に名前を付けて保存することを忘れないでください。
  5. 次のように 1 つ以上の YZ イメージをキャプチャします。代表的な結果(下記)では、2スライス法と4スライス法の精度が比較されています。2スライスアプローチでは、単一の XY および YZ スキャンが採用されます。4スライスアプローチでは、3つの YZ スキャンを平均して、筋腫体積をより正確に推定します。共焦点ソフトウェアで必要な場合は、スキャンフィールドの向きを変えます。
    1. 選択した前後位置で魚の前後軸に垂直に、選択した体節を横切る正確な背側から腹側の線を引きます。 Z スタック ライン スキャンを実行します。
    2. 選択した筋腫に沿った定義された前後位置でYZラインスキャンを3回繰り返して、YZa、YZm、およびYZpをキャプチャします。代表的な結果を図2Aに示す。これらの画像に名前を付けて、関連するXY画像と一緒に保存します。
      注:YZ平面の選択について:筋腫はV字型であり、その形態は成長中に変化します。4スライス法で筋腫17体積を最も正確に評価するには、YZaを筋腫の前端に、YZpを背側と腹側の筋腫の後端に、YZmをYZaとYZpの中間に配置します。 体節が均一に先細りになると仮定すると、各YZセクションからの測定値の平均は筋腫全体を表します。2スライス法の場合、単一のYZスキャンは、関心のある筋腫(YZmなど)の前後中心にほぼ対応する水平筋中隔の後端に配置する必要があります。あるいは、水平筋中隔の前部、中央部、後部に3つのYZ切片のセットを採取することもできますが、以下に示すように、そのような測定は筋腫の体積をわずかに過大または過小評価します(筋腫の漸減のため、それぞれ吻側および尾側体節の場合)。基本的に、魚と実験の間のYZスライス面の位置の一貫性は、再現性の鍵です。

4. 分析

  1. 筋腫は魚に沿って段階的にサイズが変化するため、比較研究では常に同じ体節で作業してください。
  2. 筋腫の体積を測定および計算するには、共焦点ソフトウェア(Zeiss ZEN顕微鏡ソフトウェアを使用して作成された.lsmファイルなど)またはFiji/ImageJなどのオープンソースのユニバーサル画像解析ソフトウェアを使用します。
    注意: ファイル形式を変更する場合は、すべてのソフトウェアが独自の共焦点ファイル形式を正しく読み取ることができるわけではないため、Zステップサイズが正しく転送されていることを確認してください。たとえば、ZENラインスキャン画像をフィジーにインポートするには、最初に[ファイル/エクスポート]コマンドを使用して、[フル解像度の画像]ウィンドウ(シングルプレーン形式)に.tifとしてエクスポートしてから、フィジーにインポートします。YZ scan.lsm はフィジーで直接開くことができますが、Z ステップ サイズの評価が正しくないため、結果の YZ 画像は通常 Z 次元で圧縮されます。
  3. ZENを用いた分析
    1. まず、 XY scan.lsm ファイルを ZEN で開きます。 [グラフィックス ]タブに移動し、[線]ツールを選択します。体節17の2つの垂直筋中隔の間に、筋腫の長さ全体(魚の前後軸に平行)にまたがる線を引きます。Mボックスにチェックを入れて、測定値を表示します(長さ= 89.71 μm、 補足ファイル2を参照)。
    2. YZ スキャン .lsm ファイルを開きます。[グラフィックス] タブで、[閉じたベジェ] ツールを選択します。筋腫の周囲に描きます。完了すると、Mボックスをチェックすると、測定値が表示されます(面積= 11980.01 μm2、補足ファイル3を参照)。
    3. 各測定値の値をスプレッドシートに手動で記録します。必要に応じてCSA測定値を平均します。筋腫の体積は、体積=筋腫の長さx CSA、すなわち、89.71μm x 11980.01μm2 = 1.075 x 106 μm3として計算することができる。
  4. フィジー/ImageJを用いた解析
    1. フィジー/ImageJで XY scan.lsmファイルを開きます。フィジーで直接開かれた XY 画像が、本来あるべき縮尺で正しく校正されているかどうかを確認します。
    2. アイコンから 直線 ツールを選択します。ステップ4.3.1の説明に従って、体節17の長さに沿って線を引きます。[ 分析]に移動して測定パラメータを設定し、[ 測定値の設定]を選択して、次の[ 面積 ]と [表示ラベル]チェックボックスをオンにします。測定するには、ホット キーMを押すか、[ 分析 ]メニューに移動して [測定]を選択します。結果のポップアップウィンドウにすべての測定値が一覧表示されます(つまり、長さ= 90.023 μm、 補足ファイル4を参照)。結果は.csvの形式で保存し、その後の分析のためにMicrosoft Excelなどで開くことができます。
    3. YZ画像のCSAを測定するには、手順4.2の説明に従ってYZ画像を.tif形式で開きます。
    4. YZ.tif画像は、エクスポート時にキャリブレーションされていないため、キャリブレーションします。キャリブレーションのパラメータは、選択した画像の情報に移動することでZENで取得できます:スケーリングX(0.489 μm)とスケーリングZ値(0.890 μm、補足ファイル5を参照)を記録します。次に、フィジーで画像が開いている間に、[画像]に移動し、[プロパティ]を選択します。ピクセル幅とピクセル高さに 0.489 μm、ボクセル深度に 0.890 μm を入力します。YZ画像の繰り返し測定が予想される場合は、キャリブレーションを普遍的に適用するには、[グローバル]チェックボックスをオンにします(補足ファイル6を参照)。
      注意: すべての YZ 画像が同じスキャンパラメータを使用してキャプチャされていることを確認してください。Fiji/ImageJを再起動するか、新しいキャリブレーションセットが必要な場合はキャリブレーション値を変更します。
    5. キャリブレーションされた YZ 画像のCSAを測定するには、アイコンから ポリゴン選択 ツールを選択します。体節の周囲を描き、 M を押して測定値を表示します(面積= 11980.395 μm2、 補足ファイル7を参照)。筋腫の体積は、体積=筋腫長x CSA、すなわち、90.023μm x 11980.395μm2 = 1.079 x 106 μm3として計算することができる。
    6. 他のXYおよびYZ画像で測定を繰り返します。一貫性を保つために、実験シリーズ内のすべての測定に同じソフトウェアを使用することをお勧めします。各ソフトウェアからの推定体積は類似していますが、ZEN = 1.074 × 10 6 μm 3およびFiji/ImageJ = 1.079 × 106 μm3という異なる描画ツールのために同一ではありません。2つの時点(すなわち、3〜4 dpf)間の筋腫の成長は、(ボリューム4 dpf - ボリューム3 dpf)/ボリューム3 dpf × 100%として計算できます。
      注:エラーとその修正について。マウント中、魚は矢状面(つまり、前後軸と背腹軸)をできるだけ水平に近づけて、それぞれヨーとロールを避けるために向ける必要があります。これは、 XY スキャンから測定された筋腫長Lと YZ スキャンから測定されたCSAの両方が、斜めの前後のマウントにより魚がヨー(背腹軸周りの回転)を示す場合、過大評価されるためです。取り付け中のピッチもロールも、セクション3で説明されているように、スキャン後の測定に影響を与えることはありません。それにもかかわらず、背腹回転(ロール)は画質を低下させます。単純な三角法は、測定されたLとCSAがそれぞれ(cosq)-1に比例して増加するため、最大10°のヨーが体積測定に3%の誤差を与えることを示しています(qは前後水平(ヨー)から離れた角度です)。15°と20°オフは、それぞれ7%と13%のボリュームの過大評価を与えます。
      脊索は円筒形であるため、 YZ スキャンに脊索全体を含めることで、長軸と短軸の向きと大きさから傾斜角と傾斜範囲を計算し、それによって測定されたLとCSAを補正して精度を最大化できます。補正されたCSA = 測定されたCSA x ノートコード短軸/ノートコード長軸。補正されたL =顕微鏡 Z 方向のノートコード短軸/ノートコード軸を測定。
      さらに検討すると、Lの追加修正が可能になります。筋腫が成長するにつれて、内側筋腫が外側筋腫のわずかに前方になるように、冠状平面(背腹軸に垂直)に歪む。背側から見ると、左右の垂直筋中隔は前方を指す広い山形を形成します。ヨーが低い場合、この形態はLの測定に影響しません。しかし、ヨーが有意な場合、三角補正は困難になり、より良いアプローチは、前方と後方の垂直筋中隔が水平筋中隔で脊索と出会う2点のXYZ座標を推定することによって真のLを直接測定することです。単純な三角法では、これらの座標から L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)2] として真の L を計算できます。この最後のアプローチの弱点は、a)ポイントの選択がオペレータによって異なる可能性があること、およびb)選択されたポイントの視覚的な記録が保持されないことです。この考慮事項は、CSA の修正には影響しません。

5.オプションの方法:筋肉の電気的活動を削除して再導入します

  1. 刺激室を作成します。
    1. 6 x 35 mmのウェルプレートを取り、細いはんだごてを使用して、各ウェルの両側に2つの小さな開口部(直径<5 mm、1 cm間隔)を作成します(図1を参照)。
      注意: 高温のはんだごては慎重に取り扱い、蒸気を吸い込まないように必要に応じてヒュームフードで作業してください。
    2. 銀または白金のワイヤー(長さ~20 cm)を各ウェルの開口部に通します(図1を参照)。再利用可能な接着剤(BluTackなど)を開口部の近くに塗布して、ワイヤーを所定の位置に保ち、ワイヤー間の1cmの間隔を確保できます(図1を参照)。
  2. 3 dpfで、魚を3つの条件に分割します:魚のミディアムコントロール、非アクティブ、および非アクティブ+スティム。
    1. 非アクティブおよび非アクティブ+スティムグループの場合、受精後72時間(hpf)にトリカイン(0.6 mM)で幼虫を麻酔します。.
      注:参考文献38に従って、トリカインストックの凍結アリコートを解凍し、魚に添加する前に希釈します(40 μL / mL魚培地、最終濃度0.6 mMまで)。一部の魚は高用量を受け取る可能性があるため、魚を含む水に直接トリカインを加えないでください。トリカインストックは1か月以内に使用する必要があり、再冷凍しないでください。
    2. 魚の培地コントロールフィッシュの場合は、麻酔をかけずに残します。
  3. トリカイン曝露開始後の選択された時間(すなわち、80 hpf)に、刺激のために非アクティブ+スティムグループを準備します。.
    1. 60 mLの2%アガロース(60 mLの魚培地に1.2 gのアガロース粉末)を準備し、電子レンジを使用して完全に溶かし、冷却し、トリカインを加えて、刺激チャンバーの各ウェルに4 mLを注ぎます(図1)。
    2. 電極間にカスタムメイドの4ウェルコームをすぐに追加します(目的の寸法のプラスチック(ポリプロピレンなど)を切り取り、瞬間接着剤を使用してくっつくことによって作成されます; 図1を参照)。ゲルが固まるまで10分待ちます。櫛を慎重に取り外して、4つの長方形のウェルを作成します。
    3. 各ウェルをトリカイン水で満たし、マイクロピペットを使用して、電極に垂直な前後軸で、麻酔をかけたInactive+Stim幼虫を各ウェルに1つ配置します( 図1を参照)。
    4. 解剖蛍光顕微鏡で、各魚がチャンバーの各ウェル内で完全に麻酔されているかどうかを確認します。
  4. チャンバーの片側の各電極に接続されたワニのクリップを使用して、極性コントローラー を介して 調整可能な電気生理学的パターン生成刺激装置をチャンバーに接続します( 図1を参照)。
    注意: 極性コントローラーは、電極の電気分解と腐食を防ぐために、5秒ごとに極性を反転するために使用されます。
  5. 魚を刺激します。たとえば、200、20 Vパルスの列、0.5 msのパルス持続時間、4.5 msのパルス分離で1秒、5秒ごとに効果的な繰り返し破傷風収縮抵抗レジームが得られます。
  6. 定期的に顕微鏡でチェックして、魚が刺激されていることを確認してください。電気刺激の例は、5秒に1回、目に見える両側収縮とわずかな動きを誘発するはずです。
  7. 抵抗/高力レジームの場合、魚を5分間、3回、5分間の発作で刺激し、各試合を5分間の休息で区切ります。
    注:チャンバーの片側の魚が休んでいる間、ワニのクリップをチャンバーの反対側の電極ペアに接続し、それらの追加の魚を刺激することができます。
  8. 刺激後、プラスチック製のピペットで魚を静かに洗い流して各ウェルから魚を慎重に取り出し、新鮮なトリカイン含有魚培地でインキュベーターに戻します。
  9. チャンバー内からトリカイン水を注ぎ、鉗子を使用して各ウェルからアガロースを切断して除去します。井戸を水道水ですすぎ、乾燥させます。
    注意: 銀線電極を使用する場合、刺激実験後に酸化銀が線の表面に蓄積することがあります。酸化銀は銀よりも導電性が低いため、再現性を維持するために、セットアップを再利用する前に、キムワイプを使用して酸化銀をワイヤーから慎重にこすり落としてください。

結果

体節体積の迅速かつ正確な測定
ゼブラフィッシュ幼虫の筋肉成長の迅速な測定を可能にするサンプル調製、データ収集、および体積分析の方法が記載されている。筋肉サイズは、膜標的GFP(β-アクチン:HRAS-EGFP) またはmCherry(α-アクチン:mCherry-CAAX )で原形質膜に標識された魚を使用して、生きた動物で測定できます。幼虫をトリカインを用いて一過性麻酔し、低融点?...

ディスカッション

本稿では,色素沈着が画像形成に大きな支障をきたさない段階や遺伝的変異において,一過性の麻酔や固定化が忍容性が高い場合に,生きたゼブラフィッシュ幼生の筋肉量を正確かつ効率的に推定する方法について報告する.これまではレーザー走査型共焦点顕微鏡を採用してきましたが、ここで説明するアプローチは、スピニングディスク共焦点顕微鏡やライトシート顕微鏡、および異なる焦点...

開示事項

著者は競合する利益を宣言しません。

謝辞

著者らは、記載されたプロトコルの開発のためのヒューズ研究室のメンバーであるSeetharamaiah Attili、Jana Koth、Fernanda Bajanca、Victoria C. Williams、Yaniv Hinits、Giorgia Bergamin、およびVladimir Snetkov博士の努力、およびプラスミドまたはゼブラフィッシュ系統を共有したHenry Roehl、Christina Hammond、David Langenau、Peter Currieに深く感謝しています。SMHは、プログラムグラントG1001029、MR / N021231 / 1、およびMR / W001381 / 1サポートを持つ医学研究評議会(MRC)の科学者です。MAは、キングスカレッジロンドンでMRC博士課程の博士課程の学生資格を取得しました。この研究は、学者、メンター、そして友人であるデビッドM.ロビンソンの三角関数の入力から恩恵を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesive, Blu TackBostik--
Aerosol vacuum ---
AgaroseSigma-AldrichA9539-
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heaterCole-ParmerSBH130-
BODIPY FL C5-ceramideThermo ScientificD3521To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires---
Fiji/imageJNational Institutes of Health, NIH--
Fish medium, Fish water--Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium--E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscopeLeicaLeica MZ16FFluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needleWorld Precision Instruments, Inc.1B100-6To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulatorGrass InstrumentsS88Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task WipersKimberly-Clark Professional13258179-
Laser scanning microscope (LSM) ZeissZeiss LSM 5 Exciter
Zeiss LSM 880		LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plateThermo Scientific140675-
Objective, 20×/1.0W water immersionZeiss--
Pasteur Pipette, Graduated 1 mLStarlab GroupE1414-0100-
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mLStarlab GroupE1414-1100-
Petri dish, 60 mmSigma-AldrichP5481-
Plasmid, CMV-CeruleanChristina L. Hammond (University of Bristol)pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAXHenry Roehl (University of Sheffield)-For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used);
synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller Hoefer Scientific InstrumentsPC750-
Soldering iron---
TricaineSigma-AldrichE10521Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
VolocityPerkin Elmer/Quorum Technologies Inc--
Watchmaker forceps, No. 5---
Wire, PlatinumGoodfellowPT005142/120.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, SilverAcros Organics3177300100.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFPDavid M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)-ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAXPeter D. Currrie (ARMI, Monash University)-ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP--ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
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参考文献

  1. Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
  2. Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
  3. Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
  4. Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
  5. Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
  6. Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
  7. Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
  8. Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
  9. Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
  10. Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
  11. Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
  12. Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
  13. Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  14. Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
  15. Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
  16. Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
  17. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  18. Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
  19. Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
  20. Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
  21. Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
  22. Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
  23. Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
  24. Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
  25. Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
  26. Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
  27. Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
  28. Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
  29. Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
  30. Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
  31. Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
  32. Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
  33. Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
  34. Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
  35. Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
  36. Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
  37. Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
  38. Westerfield, M. . The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  39. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  40. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
  41. Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
  42. Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
  43. Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
  44. Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
  45. Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
  46. Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
  47. Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
  48. Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).

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