Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü

Özet

Optik berraklık, zebra balıklarında hücre biyolojik ve fizyolojik çalışmaları için önemli bir avantajdır. Bireysel hayvanlarda hücre büyümesinin ölçülmesi için sağlam yöntemler, iskelet kasının ve komşu dokuların büyümesinin tüm vücut büyümesiyle nasıl bütünleştiğine dair yeni bilgiler sağlayan tanımlanmıştır.

Özet

Canlı embriyonik, larva veya yavru zebra balıklarının vücudundaki bireysel hücreleri görselleştirmek için bir dizi yöntem kullanılabilir. Floresan işaretli plazma zarlarına sahip canlı balıkların, kas dokusunun hacmini ve mevcut kas liflerinin sayısını belirlemek için konfokal lazer tarama mikroskobunda taranabileceğini gösteriyoruz. Canlı hayvanlarda zaman içinde hücre sayısı ve büyüklüğünün ölçülmesi için etkili yaklaşımlar tanımlanmış ve daha zorlu segmentasyon yöntemlerine karşı doğrulanmıştır. Kas elektriksel ve dolayısıyla kasılma aktivitesinin kontrolüne izin veren yöntemler açıklanmaktadır. İskelet kası kasılma aktivitesinin kaybı, kas büyümesini büyük ölçüde azaltmıştır. Larvalarda, desenli elektriksel uyarılmış kontraktil aktivitenin yeniden sokulmasına izin veren bir protokol açıklanmaktadır. Açıklanan yöntemler, bireyler arası değişkenliğin etkisini en aza indirir ve elektriksel, genetik, ilaç veya çevresel uyaranların canlı organizma bağlamında çeşitli hücresel ve fizyolojik büyüme parametreleri üzerindeki etkisinin analizine izin verecektir. Tanımlanmış bir erken yaşam müdahalesinin bireyler üzerindeki ölçülen etkilerinin uzun süreli takibi daha sonra yapılabilir.

Giriş

Hücre sayısındaki (hiperplazi) ve / veya hücre boyutundaki (hipertrofi) artışı içeren düzenlenmiş doku büyümesi, gelişim, rejenerasyon ve ekolojik ve evrimsel adaptasyonda çok önemli bir faktördür. Son yıllarda hem hücre hem de gelişim biyolojisinin moleküler genetik anlayışındaki büyük ilerlemelere rağmen, doku ve organ büyüklüğünün düzenlenmesine ilişkin mekanik anlayış hala emekleme aşamasındadır. Bilgideki bu lakunanın bir nedeni, canlı organizmalardaki doku büyümesini gerekli mekansal ve zamansal doğrulukla ölçmenin zorluğudur.

Tüm organizmaların büyümesinin çeşitli yönleri zaman içinde tekrar tekrar ölçülebilir ve her bir^birey için büyüme eğrileri ortaya çıkar 1,2,3,4,5. Çift X-ışını absorpsiyometrisi (DXA), bilgisayarlı tomografi (BT) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi giderek daha sofistike hale gelen tarama yöntemleri, hem insan hem de model organizmalarda tek bireylerde tüm organların ve diğer vücut bölgelerinin (örneğin, bireysel olarak tanımlanmış iskelet kasları) büyümesinin izlenmesine izin verir 6,7,8,9,10 . Bununla birlikte, bu yöntemler henüz bireysel hücreleri ortaya çıkarma çözünürlüğüne sahip değildir ve bu nedenle hücresel davranışlar ile doku seviyesi büyümesi arasındaki bağlantıları ayırt etmek zor olmuştur. Bu tür bağlantılar kurmak için, geleneksel çalışmalar genellikle benzer bireysel hayvanların kohortlarına güvenmiştir; bunlardan birkaçı ardışık zaman noktalarında kurban edilir ve daha sonra sitolojik ayrıntılarla analiz edilir. Bu tür yaklaşımlar, (tercihen benzer, ancak yine de değişken) birey grupları arasında gözlemlenen değişikliklerin ortalamasını almayı gerektirir ve bu nedenle zamansal ve mekansal çözünürlük eksikliğinden muzdariptir, bu da hücresel düzeyde neden-sonuç düşündüren korelasyonlu olayları bulmayı zorlaştırır.

Başlangıçta C. elegans ve D. melanogaster'de omurgasız model organizmalar üzerine yapılan çalışmalar, hücresel çözünürlük elde etmek ve tek bireylerde zaman içindeki büyümeyi doğru bir şekilde ölçmek için optik mikroskopi geliştirerek bu sorunları aşmıştır. Bu tür çalışmalar, bu küçük model organizmaların büyümesinde çarpıcı bir şekilde değişmez hücre soy davranışlarını ortaya koymuştur 11,12,13,14,15,16,17. Bununla birlikte, tüm omurgalılar da dahil olmak üzere birçok hayvan, belirsiz hücre soylarına sahiptir ve genetik olarak kodlanmış büyüme programını, tüm kurucu dokuları ve organları uygun şekilde eşleşen işlevsel üç boyutlu bir organizmaya dönüştürmeye yarayan gizemli geri bildirim süreçleriyle doku büyümesini kontrol eder. Bu karmaşık büyüme süreçlerini anlamak için, seçim zamanında genetik, farmakolojik veya diğer müdahalelerle deneysel olarak manipüle edilebilen ve daha sonra analiz edilen etki olan tek bireylerde zaman içinde tüm dokuların veya organların görüntülenmesi arzu edilir.

Her omurgalı iskelet kası tanımlanmış bir boyuta, şekle ve işleve kemik, tendon ve sinirler gibi bitişik dokularla iyi karakterize edilmiş etkileşimlere sahiptir. Bazı kaslar küçüktür, cildin hemen altında bulunur ve bu nedenle yüksek çözünürlüklü görüntüleme çalışmaları için iyi adaylardır. Çoğu organa benzer şekilde, her kas stabil bir yetişkin boyutuna ulaşmadan önce embriyonik, doğum sonrası ve genç yaşam boyunca büyür. Bununla birlikte, kas, yetişkin yaşamı boyunca, kullanıma ve beslenmeye bağlı olarak boyut değiştirme konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir¹⁸ ve bu özelliğin organizma zindeliği, spor performansı ve bağımsız yaşam üzerinde büyük bir etkisi vardır. Yaşlılıkta kas kütlesi ve fonksiyon kaybı, sarkopeni, yaşlanan bir nüfusla karşı karşıya kalan toplumlar için artan bir endişe konusudur 19,20,21.

Biz ve diğerleri, zebra balığı larvalarının segmental olarak tekrarlayan gövdesinde, doku büyümesinin, bakımının ve onarımının gözlemlenebileceği ve manipüle edilebileceği birkaç yüz hücre içeren görünüşte kapalı bir sistem olarak tanımlanmış iskelet kas dokusu bloklarının büyümesine odaklandık^{22,23,24,25,26}. Bazı nicel çalışmalar daha önce 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 olarak bildirilmiş olsa da^, zaman içinde bireysel omurgalı organizmalarda hücresel detaylarda kas büyümesini ölçmek için ayrıntılı ve doğrulanmış bir yöntem mevcut değildir. Burada, bu tür tekrarlanan ölçümlerin nasıl yapılacağına dair etkili bir protokol, doğrulama ile birlikte tanımlanmıştır ve değiştirilmiş elektriksel aktiviteye yanıt olarak hem hipertrofik hem de hiperplastik büyümedeki değişiklikleri analiz etmek için kullanımının bir örneği verilmiştir.

Protokol

Açıklanan tüm araştırmalar, kurumsal yönergelere uygun olarak ve 1986 Hayvan (Bilimsel Prosedürler) Yasası ve sonraki değişikliklere uygun olarak İngiltere İçişleri Bakanlığı'ndan uygun lisanslar altında gerçekleştirilmiştir. Embriyolar / larvalar, gastrulasyonun tamamlanmasına kadar 28.5 ° C'de yetiştirilmelidir, ancak daha sonra gelişme hızını kontrol etmek için 22-31 ° C'de tutulabilir. Balıklar oda sıcaklığında taranabilir veya uyarılabilir.

1. Zebra balığı larvalarını anestezik hale getirin

1. Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)^vu119Tg referans³⁶ veya Tg(α-aktin:mCherry-CAAX)^pc22Tg referans³⁷ gibi uygun floresan muhabir yetişkin balıkları çapraz yapın ve³⁸ tarif edildiği gibi embriyoları toplayın.
2. Döllenmeden sonraki 2 gün (dpf) gibi seçim zamanında, Trikain içeren balık ortamını (balık suyu veya E3 ortamı) kullanarak embriyoları kısaca anestezi altına alın ve Leica MZ16F gibi bir floresan mikroskobu altında EGFP veya mCherry için tarama yapın. Birinin çok sayıda embriyosu varsa, en parlak sinyale sahip olanları seçin. Embriyoları taramadan hemen sonra normal balık ortamına geri döndürün.

2. Konfokal tarama için balık montajı

1. Sistemin 30-60 dakika boyunca stabilize olmasına izin vermek için konfokal lazer tarama sistemini ve lazerleri açın.
   NOT: Burada, 20x/1,0 W suya daldırma hedefi ile donatılmış dik malzeme standına (çalışma mesafesini artıran) sahip bir Zeiss LSM 5 Exciter mikroskop kullandık.
2. % 1 düşük erime noktalı agaroz (LMA) hazırlayın ve 1,5 mL'lik bir tüpte tekrar tekrar kullanım için 37 ° C'lik bir ısı bloğunda saklayın. Isı şokunu önlemek için, LMA aliquot'u ısı bloğundan çıkarın ve larvaya uygulamadan önce ayarın hemen üstüne soğumasını sağlayın, bebek formülü sütünün sıcaklığını değerlendirirken olduğu gibi uygun sıcaklığı değerlendirmek için cildine karşı test edin.
3. Monte edilecek balıkları seçin ve her balığı sırayla Trikain ile (balık ortamında 0,6 mM) geçici olarak uyuşturun.
4. % 1'lik bir agaroz tabakası ile kaplanmış 60 mm çapında bir Petri kabı alın ve diseksiyon mikroskobunun sahnesine yerleştirin.
5. Larvaları 1 mL plastik Pasteur pipetle 60 mm kaplı Petri kabına aktarın ve mümkün olduğunca fazla transfer edilen ortamı çıkarın. Daha sonra, hala Pasteur pipeti kullanarak, balığın üzerine 5 ila 10 damla LMA yerleştirin ve LMA ayarlanmadan önce forseps (veya ateşli ince cam iğne) ile yatay olarak yanal görünümde hızla konumlandırın. Optimal görüntüleme için, larvaların LMA'nın üst yüzeyine yakın konumlandırılması arzu edilir.
   1. Alternatif olarak, 1 mL'lik plastik bir Pasteur pipet kullanarak, larvaları mümkün olduğunca az balık ortamıyla toplayın ve larvaları soğutulmuş LMA'nın alikotuna aktarın. Larvaların LMA ile tamamen çevrili olması için 5 s boyunca batmasına izin verin. Ardından, larvaları alın ve bir damla LMA içinde agaroz kaplı Petri kabına aktarın. Larvaları yukarıda açıklandığı gibi hızlı bir şekilde yönlendirin ve konumlandırın.
6. Larvayı hem anteroposterior hem de dorsoventral eksenleriyle yataydan 10 ° 'ye kadar yönlendirin (aşağıdaki 4.6. maddedeki 'Hata ve düzeltmesi üzerine' notuna bakın).
   1. Larva, agaroz damlasının yüzeyine yatay olarak doğru şekilde monte edilmezse, çıkarın ve yeniden gömün. Larvalar, mikroince 1 mL plastik Pasteur pipet kullanılarak nazik bir emme ile kolayca alınabilir ve LMA, Kimwipes kullanılarak nazikçe çıkarılabilir. Uygulama, montaj prosedüründe gerçekten mükemmelleştirir; Bunu gerçek bir deneyde denemeden önce bazı önemsiz larvaları gömerek bir öğleden sonra geçirin.
      NOT: Mikroskop tasarımında: Birçok laboratuvar, bir kapak kapağı ile görüntüleme için ters çevrilmiş konfokal mikroskoplar kullanır. Ters çevrilmiş bir mikroskopta gözlem için bir örtü altında agarozda tutulan balıkların tekrar tekrar gömülmesi ve çıkarılmasının, tekrarlanan tarama sırasında, dik bir mikroskopla tarif edilen prosedürden daha fazla örnek kaybına yol açtığını bulduk. Bu nedenle varsa dik bir sistem kullanılması önerilir. Bununla birlikte, yüksek kaliteli verilerin anahtarı, burada tartışılamayacak kadar büyük bir konu olan objektif ve tarama parametrelerinin doğru seçilmesi ve kullanılmasıdır.

3. Konfokal tarama

1. LMA ayarlandığında, çanağı yaklaşık 10 mL Trikain içeren balık ortamı ile doldurun. Konfokal yığınları yakalamayı planlıyorsanız, bazı agaroz şişmeleri meydana geldiğinden, taramaya devam etmeden önce monte edilmiş balığın en az 10 dakika dinlenmesine izin verin.
2. Numune kabını konfokal sistemin aşamasına yükleyin, larvayı bulun ve istenen somite odaklanın. Somite 17, anal havalandırma deliğine yakın lokalizasyon kolaylığı ve görüntüleme kolaylığı nedeniyle seçilebilir. Anteriordan somitleri sayarak kontrol edin.
   NOT: İlk somit kulağın arkasına kaynaştırılır ve ön sınırı yoktur, ancak çizgili kas liflerine sahip olduğu kolayca gözlemlenebilir.
3. Üst (yani cildin hemen üstünde) ve alt (yani, notokordun hemen altında, balık hafifçe çarpık monte edilmiş olsa bile, tüm somiti içerecek şekilde) tanımlayarak bir Z-yığınını yakalamak için ayarlanmış gibi ayarlayın. Hem sol hem de sağ taraflar istenildiği gibi yakalanabilir. Bu, tüm hızlı YZ taramalarının istenen bölgeleri yakalamasını sağlayacaktır.
4. Aşağıdaki gibi bir XY görüntüsü yakalayın. Konfokal yazılımın izin verdiği şekilde tarama alanını balıklara göre yönlendirin. Balıkları, görüntülenen X eksenine paralel anteroposterior eksen ve Ek Dosya 1'de gösterildiği gibi alanın merkezinde somit 17 ile dorsoventral eksen Y eksenine paralel olarak konumlandırın. En üstteki miyotomda, tüm epaxial ve hypaxial somit yarımlarının dikey ve yatay miyosepta ile birlikte görülebildiği ve yüksek çözünürlüklü bir XY görüntüsü yakaladığı orta seviyeli bir düzleme odaklanın. Görüntüyü adlandırmayı ve kaydetmeyi unutmayın.
5. Aşağıdaki gibi bir veya daha fazla YZ görüntüsü yakalayın. Temsili Sonuçlarda (aşağıda) 2 dilimli ve 4 dilimli yöntemlerin doğruluğu karşılaştırılmıştır. 2 dilimli yaklaşımda tek XY ve YZ taramaları kullanılır. 4 dilimli yaklaşımda, miyotom hacminin daha doğru bir tahminini vermek için üç YZ taramasının ortalaması alınır. Konfokal yazılım tarafından isteniyorsa, tarama alanını yeniden yönlendirin.
   1. Seçilen bir anteroposterior pozisyonda balığın anteroposterior eksenine dik olarak seçilen somit boyunca ventral çizgiye kesin bir dorsal çizin. Z-yığını çizgi taraması gerçekleştirin.
   2. YZa, YZm ve YZp'yi yakalamak için seçilen miyotom boyunca tanımlanmış anteroposterior pozisyonlarda YZ hattı taramasını üç kez tekrarlayın. Temsili sonuçlar Şekil 2A'da gösterilmiştir. Bu görüntüleri adlandırın ve ilgili XY görüntüsüyle birlikte kaydedin.
      NOT: YZ düzlemlerinin seçiminde: Miyotom V şeklindedir ve formu büyüme sırasında değişir. 4 kesitli yöntemle miyotom 17 hacminin en doğru değerlendirmesini elde etmek için, YZa'yı miyotomun ön ucuna, YZp'yi dorsal ve ventral ekstremitelerde miyotomun arka uçlarına ve YZm'yi YZa ile YZp arasında yarıya kadar konumlandırın . Somitin düzgün bir şekilde inceldiğini varsayarsak, her YZ bölümünden alınan ölçümlerin ortalaması miyotomu bir bütün olarak temsil edecektir. 2 dilimli yöntem için, tek YZ taraması, yatay miyoseptumun arka ucuna yerleştirilmelidir, bu da kabaca ilgilenilen miyotomun anteroposterior merkezine (YZm gibi) karşılık gelir. Alternatif olarak, yatay miyoseptumun ön, orta ve arka kısımlarında üç YZ kesitinden oluşan bir set alınabilir, ancak aşağıda gösterildiği gibi, bu ölçüm miyotom hacmini biraz fazla veya az tahmin edecektir (miyotom sivrilmesine bağlı olarak sırasıyla rostral ve kaudal somitler için). Temel olarak, YZ dilim düzlemlerinin balıklar ve deneyler arasında konumlandırılmasındaki tutarlılık, tekrarlanabilirliğin anahtarıdır.

4. Analiz

1. Miyotom balık boyunca derecelendirilmiş bir şekilde boyut değiştirdiğinden, karşılaştırmalı çalışmalarda daima aynı somit ile çalışın.
2. Miyotom hacmini ölçmek ve hesaplamak için, konfokal yazılımı (Zeiss ZEN mikroskop yazılımı kullanılarak oluşturulan .lsm dosyaları gibi) veya Fiji/ImageJ gibi açık kaynaklı evrensel görüntü analiz yazılımını kullanın.
   NOT: Dosya biçimlerini değiştiriyorsanız, Z-adım boyutunun doğru aktarıldığından emin olun, çünkü tüm yazılımlar özel konfokal dosya biçimlerini doğru okuyamaz. Örneğin, bir ZEN satır tarama görüntüsünü Fiji'ye içe aktarmak için, önce Dosya/Dışa Aktar komutunu kullanarak Tam çözünürlüklü görüntü penceresinde .tif olarak dışa aktarın - tek düzlem biçimi, ardından Fiji'ye içe aktarın. YZ scan.lsm doğrudan Fiji'de açılabilse de, elde edilen YZ görüntüleri, Z adım boyutunun yanlış değerlendirilmesi nedeniyle genellikle Z boyutunda sıkıştırılır.
3. ZEN kullanarak analiz
   1. İlk olarak, XY scan.lsm dosyalarını ZEN'de açın. Grafikler sekmesine gidin ve Çizgi aracını seçin. Tüm miyotom uzunluğunu kapsayan iki dikey somit 17 miyoseptası arasında bir çizgi çizin (balığın anteroposterior eksenine paralel). Ölçümün değerlerini görmek için M kutusunu işaretleyin (Uzunluk = 89,71 μm, Ek Dosya 2'ye bakın).
   2. YZ scan.lsm dosyalarını açın. Grafikler sekmesi altında, Kapalı Bezier aracını seçin. Miyotomun çevresini çizin. Tamamlandığında, M kutusunu işaretleyin, bu ölçümün değerini gösterir (Alan = 11980.01 μm², Ek Dosya 3'e bakınız).
   3. Her ölçümün değerlerini manuel olarak bir e-tabloya kaydedin. CSA ölçümlerinin ortalamasını gerektiği gibi alın. Miyotomun hacmi Hacim = Miyotom uzunluğu x CSA, yani 89.71 μm x 11980.01 μm² = 1.075 x 10⁶ μm³ olarak hesaplanabilir.
4. Fiji/ImageJ kullanarak analiz
   1. XY scan.lsm dosyalarını Fiji/ImageJ içinde açın. Doğrudan Fiji'de açılan XY görüntülerinin, olması gerektiği gibi doğru ölçekte kalibre edilip edilmediğini kontrol edin.
   2. Simgelerden Düz Çizgi aracını seçin. Adım 4.3.1'de açıklandığı gibi somit 17'nin uzunluğu boyunca bir çizgi çizin. Analiz Et'e giderek ölçüm parametrelerini ayarlayın, ardından Ölçümleri Ayarla...'yı seçin ve aşağıdaki Alan ve Etiketi Görüntüle kutularını işaretleyin. Ölçmek için, M kısayol tuşuna basmanız veya Analiz menüsüne gidip Ölç'ü seçmeniz yeterlidir. Ortaya çıkan bir açılır pencere tüm ölçüm değerlerini listeler (yani, Uzunluk = 90,023 μm; Ek Dosya 4'e bakın). Sonuçlar .csv şeklinde kaydedilebilir ve sonraki analizler için Microsoft Excel veya benzerlerinde açılabilir.
   3. YZ görüntülerinde CSA'yı ölçmek için, adım 4.2'de açıklandığı gibi YZ görüntülerini .tif biçiminde açın.
   4. YZ .tif görüntülerini, dışa aktarıldıklarında kalibre edilmedikleri için kalibre edin. Kalibrasyon parametreleri, seçilen görüntülerin Bilgisi'ne giderek ZEN'de elde edilebilir: Scaling X (0.489 μm) ve Scaling Z değerlerini (0.890 μm; bakınız Ek Dosya 5) kaydedin. Ardından, görüntüler Fiji'de açıkken, Görüntü'ye gidin ve Özellikler...'i seçin. Piksel genişliği ve piksel yüksekliği için 0,489 μm ve Voksel derinliği için 0,890 μm girin. YZ görüntülerinin tekrarlanan ölçümü bekleniyorsa kalibrasyonu evrensel olarak uygulamak için Global kutusunu işaretleyin (Ek Dosya 6'ya bakın).
      NOT: Tüm YZ görüntülerinin aynı tarama parametreleri kullanılarak yakalandığından emin olun; Fiji/ImageJ'yi yeniden başlatın veya yeni bir kalibrasyon seti gerekiyorsa kalibrasyon değerlerini değiştirin.
   5. Kalibre edilmiş YZ görüntülerinin CSA'sını ölçmek için, simgelerden Poligon Seçimleri aracını seçin. Somitin çevresini çizin ve ölçümün değerlerini ortaya çıkarmak için M düğmesine basın ( Alan = 11980.395 μm²; bakınız Ek Dosya 7). Miyotomun hacmi Hacim = Miyotom uzunluğu x CSA, yani 90.023 μm x 11980.395 μm² = 1.079 x 10⁶ μm³ olarak hesaplanabilir.
   6. Ölçümleri diğer XY ve YZ görüntülerinde tekrarlayın. Tutarlılık için deneysel bir seri içindeki tüm ölçümler için aynı yazılımın kullanılması önerilir. Her yazılımdan elde edilen hacim tahmini benzerdir, ancak farklı çizim araçları nedeniyle aynı değildir, örneğin, ZEN = 1.074 × 10 6 μm 3 ve Fiji / ImageJ = 1.079 × 10⁶ μm³. Miyotomun iki zaman noktası (yani, 3 ila 4 dpf) arasındaki büyümesi şu şekilde hesaplanabilir: (Hacim 4 dpf - Cilt 3 _dpf)/ Cilt _{3 dpf} ×% 100.
      NOT: Hata ve düzeltilmesi üzerine. Montaj sırasında, balıklar sırasıyla sapma ve yuvarlanmayı önlemek için sagital düzlemi (yani anteroposterior ve dorsoventral eksenler) ile yataya mümkün olduğunca yakın yönlendirilmelidir. Bunun nedeni, hem XY taramasından ölçülen miyotom uzunluğu L'nin hem de bir YZ taramasından ölçülen CSA'nın, balıkların eğik anteroposterior montajı nedeniyle sapma (dorsoventral eksen etrafında rotasyon) göstermesi durumunda aşırı tahmin edilmesidir. Montaj sırasında ne eğim ne de rulo, bölüm 3'te açıklandığı gibi taramadan sonraki ölçümleri etkilememelidir. Bununla birlikte, dorsoventral rotasyon (rulo) görüntü kalitesini düşürür. Basit trigonometri, 10 ° 'ye kadar sapmanın hacim ölçümünde% 3 hata vereceğini, ölçülen L ve CSA'nın her birinin (cosq) ^-1 ile orantılı olarak arttığını gösterir; burada q, anteroposterior yataydan (yaw) uzak açıdır. 15 ° ve 20 ° kapalı, sırasıyla% 7 ve% 13 fazla hacim tahminleri verecektir.
      Notochord silindirik olduğundan, tüm notokordun YZ taramasına dahil edilmesi, majör ve minör eksenlerin oryantasyonu ve büyüklüğünden eğikliğin açısını ve derecesini hesaplamak ve böylece doğruluğu en üst düzeye çıkarmak için ölçülen L ve CSA'yı düzeltmek için kullanılabilir. Düzeltilmiş CSA = Ölçülen CSA x Notochord minör eksen/Notochord majör ekseni. Düzeltilmiş L = Mikroskop Z yönünde ölçülen L x Notochord minör eksen/Notochord ekseni.
      Başka bir husus, L'nin ek olarak düzeltilmesine izin verir. Miyotom büyüdükçe, koronal düzlemde (dorsoventral eksene normal) çarpıktır, böylece medial miyotom lateral miyotomun biraz önündedir. Dorsaldan bakıldığında, sol ve sağ taraflardaki dikey miyosepta, ön tarafı işaret eden geniş bir chevron oluşturur. Eğer sapma düşükse, bu morfoloji L ölçümünü etkilemez. Ancak sapma önemliyse, trigonometrik düzeltme zorlaşır ve daha iyi bir yaklaşım, ön ve arka dikey miyoseptanın yatay miyoseptumdaki notokordla buluştuğu iki noktanın XYZ koordinatlarını tahmin ederek Gerçek L'yi doğrudan ölçmektir. Basit trigonometri, bu koordinatlardan Gerçek L'nin L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)² + (Z 2 - Z ₁)₂] olarak hesaplanmasına izin verir. Bu son yaklaşımın zayıf yönleri, a) noktaların seçiminin operatöre göre değişebilmesi ve b) seçilen noktaların görsel kaydının tutulmamasıdır. Bu husus CSA düzeltmesini etkilemez.

5. İsteğe bağlı yöntem: Kas elektriksel aktivitesini çıkarın ve yeniden tanıtın

1. Bir stimülasyon odası oluşturun.
   1. 6 x 35 mm'lik bir kuyu plakası alın, dar bir havya kullanarak her bir kuyucuğun her iki tarafında iki küçük açıklık (<5 mm çapında, 1 cm arayla) oluşturun (bkz. Şekil 1).
      NOT: Sıcak havyayı dikkatli bir şekilde kullanın ve buharın solunmasını önlemek için isterseniz bir duman davlumbazında çalışın.
   2. Her bir kuyucuğun açıklıklarından bir çift gümüş veya platin tel (~ 20 cm uzunluğunda) geçirin (bkz. Şekil 1). Yeniden kullanılabilir yapışkan malzeme (örneğin, BluTack), telleri yerinde tutmak ve teller arasında 1 cm'lik bir ayrım sağlamak için açıklıkların yakınına uygulanabilir (bkz. Şekil 1).
2. 3 dpf'de balıkları üç koşula ayırın: balık ortamı Kontrol, Aktif Değil ve Aktif Değil + Stim.
   1. İnaktif ve İnaktif + Stim grupları için, larvaları döllenmeden 72 saat sonra (hpf) Trikain (0.6 mM) ile uyuşturun.
      NOT: Referans^38'i takiben, trikain stoğunun dondurulmuş alikotları çözülür ve balığa eklenmeden önce seyreltilir (40 μL / mL balık ortamı, 0,6 mM'lik son konsantrasyona). Bazı balıklar yüksek dozlarda alabileceğinden, balık içeren suya doğrudan trikain eklemeyin. Trikain stoğu bir ay içinde kullanılmalı ve asla tekrar dondurulmamalıdır.
   2. Balık ortamı için Kontrol balığı, anestezi olmadan bırakın.
3. Trikain maruziyetinin başlamasından sonra seçilen zamanlarda (yani, 80 hpf'de), Inactive + Stim grubunu stimülasyon için hazırlayın.
   1. 60 mL% 2 agaroz (60 mL balık ortamında 1.2 g agaroz tozu) hazırlayın ve mikrodalga kullanarak tamamen eritin, soğutun, trikain ekleyin ve stimülasyon odasının her bir oluğuna 4 mL dökün (Şekil 1).
   2. Hemen elektrotların arasına özel yapım 4 delikli taraklar ekleyin (istenen boyutlardaki plastiklerin (örneğin, polipropilen) kesilmesi ve Superglue kullanılarak birbirine yapıştırılmasıyla oluşturulur; bkz. Şekil 1). Jelin ayarlanması için 10 dakika bekleyin. Dört dikdörtgen kuyucuk oluşturmak için tarakları dikkatlice çıkarın.
   3. Her bir kuyuyu trikain suyuyla doldurun ve bir mikropipet kullanarak her bir kuyucuğa, anteroposterior eksenleri elektrotlara dik olacak şekilde tek bir anestezik Inactive + Stim larvası yerleştirin (bkz. Şekil 1).
   4. Diseksiyon floresan mikroskobu altında, her bir balığın odanın her bir kuyucuğunda tamamen anestezi uygulanıp uygulanmadığını kontrol edin.
4. Ayarlanabilir bir elektrofizyolojik desen üreten uyarıcıyı, odanın bir tarafındaki elektrotların her birine bağlı timsah klipslerini kullanarak bir Polarite Kontrolörü aracılığıyla odaya bağlayın (bkz. Şekil 1).
   NOT: Polarite kontrolörü, elektrolizi ve elektrotların korozyonunu önlemek için polariteyi her 5 sn'de bir tersine çevirmek için kullanılır.
5. Balıkları teşvik edin. Örneğin, 200, 20 V darbeli bir trene sahip 1'ler, 0.5 ms darbe süresi ve 4.5 ms darbe ayrımı ile, her 5 s'de bir etkili bir tekrarlanan-tetanik kasılma direnci rejimi verir.
6. Balıkların uyarıldığını doğrulamak için mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin; örnek elektriksel uyaran, her 5 saniyede bir, gözle görülür bir bilateral kasılmaya ve hafif bir harekete neden olmalıdır.
7. Bir direnç / yüksek kuvvet rejimi için, balıkları 5 dakikalık bir süre boyunca, üç kez, her bir nöbet 5 dakikalık dinlenme ile ayrılarak yüksek bir frekansta uyarın.
   NOT: Odanın bir tarafındaki balıklar dinlenirken, timsah klipsleri odanın diğer tarafındaki elektrot çiftine bağlanabilir ve bu ek balıklar uyarılabilir.
8. Uyarımdan sonra, balıkları plastik bir pipetle hafifçe yıkayarak her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın ve taze trikain içeren balık ortamında inkübatöre geri dönün.
9. Üçlü suyu odanın içinden dökün ve agarozu her bir kuyucuktan kesmek ve çıkarmak için forseps kullanın. Kuyuları musluk suyuyla durulayın ve kurumaya bırakın.
   NOT: Gümüş tel elektrotlar kullanılıyorsa, bazen bir stimülasyon deneyinden sonra telin yüzeyinde gümüş oksit birikebilir. Gümüş oksit gümüşten daha az iletken olduğundan, tekrarlanabilirliği korumak için, kurulumu yeniden kullanmadan önce Kimwipes kullanarak gümüş oksidi telden dikkatlice ovalayın.

Sonuçlar

Somit hacminin hızlı ve hassas bir ölçümü
Zebra balığı larvalarında kas büyümesinin hızlı bir şekilde ölçülmesini sağlayan bir numune hazırlama, veri toplama ve hacimsel analiz yöntemi açıklanmaktadır. Kas büyüklüğü, plazma zarlarında membran hedefli GFP (β-aktin:HRAS-EGFP ) veya mCherry (α-aktin:mCherry-CAAX ) ile etiketlenmiş balıklar kullanılarak canlı hayvanlarda ölçülebilir. Larvalar trikain kullanılarak geçici olarak uyuşturuldu, düş?...

Tartışmalar

Burada, pigmentasyonun görüntülemeye büyük bir engel teşkil etmediği ve geçici anestezi ve/veya immobilizasyonun iyi tolere edildiği aşamalarda veya genetik varyantlarda canlı zebra balığı larvalarının kas hacminin doğru ve etkili bir şekilde tahmin edilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Lazer taramalı konfokal mikroskopiyi kullanmış olsak da, açıklanan yaklaşımlar dönen disk konfokal veya ışık tabakası mikroskobu ve farklı odak düzlemlerinde görüntü yığınları oluşturan diğer yönt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive, Blu Tack	Bostik	-	-
Aerosol vacuum	-	-	-
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	-
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414	Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heater	Cole-Parmer	SBH130	-
BODIPY FL C5-ceramide	Thermo Scientific	D3521	To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires	-	-	-
Fiji/imageJ	National Institutes of Health, NIH	-	-
Fish medium, Fish water	-	-	Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium	-	-	E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscope	Leica	Leica MZ16F	Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needle	World Precision Instruments, Inc.	1B100-6	To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulator	Grass Instruments	S88	Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	13258179	-
Laser scanning microscope (LSM)	Zeiss	Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880	LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate	Thermo Scientific	140675	-
Objective, 20×/1.0W water immersion	Zeiss	-	-
Pasteur Pipette, Graduated 1 mL	Starlab Group	E1414-0100	-
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL	Starlab Group	E1414-1100	-
Petri dish, 60 mm	Sigma-Aldrich	P5481	-
Plasmid, CMV-Cerulean	Christina L. Hammond (University of Bristol)		pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAX	Henry Roehl (University of Sheffield)	-	For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller	Hoefer Scientific Instruments	PC750	-
Soldering iron	-	-	-
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521	Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
Volocity	Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc	-	-
Watchmaker forceps, No. 5	-	-	-
Wire, Platinum	Goodfellow	PT005142/12	0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, Silver	Acros Organics	317730010	0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFP	David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)	-	ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX	Peter D. Currrie (ARMI, Monash University)	-	ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP	-	-	ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
ZEN software	Zeiss	-	-