Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind

Zusammenfassung

Optische Klarheit ist ein großer Vorteil für die zellbiologische und physiologische Arbeit im Zebrafisch. Es werden robuste Methoden zur Messung des Zellwachstums in einzelnen Tieren beschrieben, die neue Einblicke in die Integration des Wachstums von Skelettmuskeln und benachbarten Geweben in das Wachstum des gesamten Körpers ermöglichen.

Zusammenfassung

Eine Reihe von Methoden kann verwendet werden, um einzelne Zellen im ganzen Körper von lebenden embryonalen, larven oder juvenilen Zebrafischen sichtbar zu machen. Wir zeigen, dass lebende Fische mit fluoreszenzmarkierten Plasmamembranen in einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop gescannt werden können, um das Volumen des Muskelgewebes und die Anzahl der vorhandenen Muskelfasern zu bestimmen. Effiziente Ansätze zur Messung der Zellanzahl und -größe in lebenden Tieren im Zeitverlauf werden beschrieben und anhand aufwändigerer Segmentierungsmethoden validiert. Es werden Methoden beschrieben, die die Steuerung der elektrischen und damit kontraktilen Muskelaktivität erlauben. Der Verlust der kontraktilen Aktivität der Skelettmuskulatur reduzierte das Muskelwachstum stark. Bei Larven wird ein Protokoll beschrieben, das die Wiedereinführung einer strukturierten, elektrisch evozierten kontraktilen Aktivität ermöglicht. Die beschriebenen Methoden minimieren den Effekt interindividueller Variabilität und erlauben es, die Wirkung von elektrischen, genetischen, medikamentösen oder Umweltreizen auf eine Vielzahl von zellulären und physiologischen Wachstumsparametern im Kontext des lebenden Organismus zu analysieren. Anschließend kann eine Langzeitnachbeobachtung der gemessenen Effekte einer definierten Frühlebensintervention auf Individuen durchgeführt werden.

Einleitung

Das regulierte Gewebewachstum, bestehend aus einer Zunahme der Zellzahl (Hyperplasie) und/oder Zellgröße (Hypertrophie), ist ein entscheidender Faktor für Entwicklung, Regeneration sowie ökologische und evolutionäre Anpassung. Trotz enormer Fortschritte im molekulargenetischen Verständnis sowohl der Zell- als auch der Entwicklungsbiologie in den letzten Jahrzehnten steckt das mechanistische Verständnis der Regulation von Gewebe und Organgröße noch in den Kinderschuhen. Ein Grund für diese Wissenslücke ist die Schwierigkeit, das Gewebewachstum in lebenden Organismen mit der notwendigen räumlichen und zeitlichen Genauigkeit zu quantifizieren.

Verschiedene Aspekte des Wachstums ganzer Organismen können im Laufe der Zeit wiederholt gemessen werden, wobei Wachstumskurven für jedes Individuum 1,2,3,4,5 sichtbar werden. Immer ausgefeiltere Scanmethoden wie die duale Röntgenabsorptiometrie (DXA), die Computertomographie (CT) und die Magnetresonanztomographie (MRT) ermöglichen die Verfolgung des Wachstums ganzer Organe und anderer Körperregionen (z. B. einzelne identifizierte Skelettmuskeln) bei einzelnen Individuen, sowohl beim Menschen als auch in Modellorganismen 6,7,8,9,10 . Diese Methoden haben jedoch noch nicht die Auflösung, einzelne Zellen aufzudecken, und daher waren die Zusammenhänge zwischen zellulärem Verhalten und Wachstum auf Gewebeebene schwer zu erkennen. Um solche Verbindungen herzustellen, haben sich traditionelle Studien oft auf Kohorten ähnlicher Einzeltiere gestützt, von denen einige zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten geopfert und dann zytologisch detailliert analysiert werden. Solche Ansätze erfordern die Mittelung der beobachteten Veränderungen über Gruppen von (vorzugsweise ähnlichen, aber dennoch variablen) Individuen hinweg und leiden daher unter einem Mangel an zeitlicher und räumlicher Auflösung, was es schwierig macht, korrelierte Ereignisse auf zellulärer Ebene zu finden, die auf Ursache und Wirkung hindeuten.

Studien an wirbellosen Modellorganismen, zunächst in C. elegans und D. melanogaster, haben diese Probleme umgangen, indem sie optische Mikroskopie entwickelt haben, um eine zelluläre Auflösung zu erreichen und das Wachstum im Laufe der Zeit bei einzelnen Individuen genau zu messen. Solche Studien haben auffallend invariantes Zelllinienverhalten im Wachstum dieser kleinen Modellorganismen 11,12,13,14,15,16,17 gezeigt. Viele Tiere, einschließlich aller Wirbeltiere, haben jedoch unbestimmte Zelllinien und kontrollieren das Gewebewachstum durch mysteriöse Rückkopplungsprozesse, die dazu dienen, das genetisch kodierte Wachstumsprogramm in einen funktionsfähigen dreidimensionalen Organismus mit all seinen Geweben und Organen zu verwandeln, die in der Größe entsprechend aufeinander abgestimmt sind. Um diese komplexen Wachstumsprozesse zu verstehen, ist es wünschenswert, ganze Gewebe oder Organe im Laufe der Zeit bei einzelnen Individuen abzubilden, die durch genetische, pharmakologische oder andere Interventionen zu einem Zeitpunkt der Wahl experimentell manipuliert und die Wirkung anschließend analysiert werden können.

Jeder Skelettmuskel von Wirbeltieren hat eine definierte Größe, Form und Funktion und gut charakterisierte Wechselwirkungen mit benachbarten Geweben wie Knochen, Sehnen und Nerven. Einige Muskeln sind klein, liegen knapp unter der Haut und sind daher gute Kandidaten für hochauflösende bildgebende Studien. Ähnlich wie bei den meisten Organen wächst jeder Muskel während des embryonalen, postnatalen und jugendlichen Lebens, bevor er eine stabile Erwachsenengröße erreicht. Muskeln haben jedoch auch eine einzigartige Fähigkeit, die Größe während des Erwachsenenlebens zu ändern, abhängig von Gebrauch und Ernährung¹⁸, und diese Eigenschaft hat einen großen Einfluss auf die Fitness des Organismus, die sportliche Leistung und das unabhängige Leben. Der Verlust von Muskelmasse und -funktion im Alter, Sarkopenie, ist ein Thema, das für Gesellschaften mit einer alternden Bevölkerung zunehmend Anlass zur Sorge gibt 19,20,21.

Wir und andere haben uns auf das Wachstum definierter Blöcke von Skelettmuskelgewebe im sich segmental wiederholenden Körper von Zebrafischlarven konzentriert, als ein scheinbar geschlossenes System mit mehreren hundert Zellen, in dem Gewebewachstum, -erhaltung und -reparatur beobachtet und manipuliert werden können 22,23,24,25,26. Während einige quantitative Arbeiten zuvor berichtet wurden 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35^, ist keine detaillierte und validierte Methode zur Messung des Muskelwachstums in zellulären Details in einzelnen Wirbeltierorganismen im Laufe der Zeit verfügbar. Hier wird ein effizientes Protokoll für die Durchführung solcher wiederholten Messungen beschrieben, zusammen mit der Validierung, und ein Beispiel für seine Verwendung zur Analyse von Veränderungen sowohl des hypertrophen als auch des hyperplastischen Wachstums als Reaktion auf veränderte elektrische Aktivität wird bereitgestellt.

Protokoll

Alle beschriebenen Forschungsarbeiten wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien und unter geeigneten Lizenzen des britischen Innenministeriums in Übereinstimmung mit dem Animal (Scientific Procedures) Act 1986 und nachfolgenden Änderungen durchgeführt. Embryonen/Larven sollten bis zum Abschluss der Gastrulation bei 28,5 °C aufgezogen werden, können dann aber bei 22-31 °C gehalten werden, um die Entwicklungsgeschwindigkeit zu kontrollieren. Fische können bei Raumtemperatur gescannt oder stimuliert werden.

1. Zebrafischlarven anästhesieren

1. Kreuzen Sie geeignete fluoreszierende Reporterfische wie Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)^vu119Tg Referenz³⁶ oder Tg(α-Aktin:mCherry-CAAX)^pc22Tg Referenz 37 und sammeln Sie Embryonen wie beschrieben³⁸.
2. Zum Zeitpunkt der Wahl, z. B. 2 Tage nach der Befruchtung (dpf), betäuben Sie die Embryonen kurz mit Tricain-haltigem Fischmedium (entweder Fischwasser oder E3-Medium) und suchen Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop wie einem Leica MZ16F nach EGFP oder mCherry. Wenn man viele Embryonen hat, wählen Sie diejenigen mit dem hellsten Signal aus. Bringen Sie die Embryonen unmittelbar nach dem Screening in ein normales Fischmedium zurück.

2. Montage von Fischen für konfokales Scannen

1. Schalten Sie das konfokale Laserscanning-System und die Laser ein, damit sich das System für 30-60 Minuten stabilisieren kann.
   HINWEIS: Hier haben wir ein Zeiss LSM 5 Exciter-Mikroskop mit aufrechtem Materialständer (der den Arbeitsabstand erhöht) verwendet, das mit einem 20x/1,0 W Wassertauchobjektiv ausgestattet ist.
2. Bereiten Sie 1% niedrigschmelzende Agarose (LMA) vor und bewahren Sie sie in einem 37 °C heißen Hitzeblock zur wiederholten Anwendung in einem 1,5-ml-Röhrchen auf. Um einen Hitzeschock zu vermeiden, entfernen Sie das LMA-Aliquot aus dem Wärmeblock und lassen Sie es bis knapp über die Einstellung abkühlen, bevor Sie es auf die Larve auftragen, und testen Sie gegen die Haut, um die geeignete Temperatur zu beurteilen, wie bei der Beurteilung der Temperatur von Babynahrungsmilch.
3. Wählen Sie Fische aus, die montiert werden sollen, und betäuben Sie jeden Fisch nacheinander vorübergehend mit Tricain (0,6 mM in Fischmedium).
4. Nehmen Sie eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm, die mit einer Schicht von 1% Agarose beschichtet wurde, und legen Sie sie auf die Bühne eines Seziermikroskops.
5. Die Larve mit einer 1 ml Kunststoff-Pasteur-Pipette auf die 60 mm beschichtete Petrischale geben und so viel übertragenes Medium wie möglich entfernen. Geben Sie dann immer noch mit der Pasteur-Pipette 5 bis 10 Tropfen LMA auf den Fisch und positionieren Sie sich schnell horizontal in Seitenansicht mit einer Pinzette (oder einer feuerpolierten feinen Glasnadel), bevor die LMA aushärtet. Für eine optimale Bildgebung ist es wünschenswert, die Larve nahe der Oberseite der LMA zu positionieren.
   1. Alternativ können Sie mit einer 1-ml-Pasteur-Pipette aus Kunststoff die Larve mit so wenig Fischmedium wie möglich sammeln und die Larve in das Aliquot des gekühlten LMA überführen. Lassen Sie die Larve für 5 s sinken, um vollständig von LMA umgeben zu werden. Dann holen Sie die Larve und geben Sie sie in einem Tropfen LMA auf die mit Agarose überzogene Petrischale. Orientieren und positionieren Sie die Larve schnell wie oben beschrieben.
6. Die Larve ist sowohl mit ihrer anteroposterioren als auch mit ihrer dorsoventralen Achse innerhalb von 10° von der Horizontalen auszurichten (siehe Anmerkung "Über Fehler und ihre Korrektur" unter Nummer 4.6).
   1. Wenn die Larve nicht korrekt horizontal in der Nähe der Oberfläche des Agarosentropfens montiert ist, entfernen und wieder einbetten. Larven können leicht durch sanftes Absaugen mit einer mikrofeinen 1-ml-Kunststoff-Pasteur-Pipette entnommen werden, und LMA kann vorsichtig mit Kimwipes entfernt werden. Übung macht wirklich den Meister im Montagevorgang; Verbringen Sie einen Nachmittag damit, einige unwichtige Larven einzubetten, bevor Sie dies an einem echten Experiment versuchen.
      HINWEIS: Zum Mikroskopdesign: Viele Labore verwenden invertierte konfokale Mikroskope für die Bildgebung durch ein Deckglas. Wir haben festgestellt, dass das wiederholte Einbetten und Entfernen von Fischen, die in Agarose gehalten werden, unter einem Deckglas zur Beobachtung in einem inversen Mikroskop zu einem größeren Probenverlust bei wiederholtem Scannen führt als bei dem beschriebenen Verfahren mit einem aufrechten Mikroskop. Aus diesem Grund empfiehlt sich die Verwendung eines aufrechten Systems, sofern vorhanden. Ein Schlüssel zu qualitativ hochwertigen Daten ist jedoch die richtige Auswahl und Verwendung von Ziel- und Scanparametern, ein Thema, das zu groß ist, um hier diskutiert zu werden.

3. Konfokales Scannen

1. Wenn LMA ausgehärtet ist, spülen Sie die Schale mit etwa 10 ml Tricain-haltigem Fischmedium. Wenn Sie konfokale Stapel erfassen möchten, lassen Sie die montierten Fische mindestens 10 Minuten ruhen, bevor Sie mit dem Scannen fortfahren, da eine gewisse Agarose-Schwellung auftritt.
2. Laden Sie die Probenschale auf die Stufe des konfokalen Systems, lokalisieren Sie die Larve und konzentrieren Sie sich auf das gewünschte Somit. Somite 17 kann aufgrund seiner einfachen Lokalisation in der Nähe des Analschlotes und der einfachen Bildgebung gewählt werden. Überprüfen Sie, indem Sie Somiten von vorne zählen.
   HINWEIS: Der erste Somit ist hinter dem Ohr verschmolzen und hat keinen vorderen Rand, kann aber leicht beobachtet werden, dass er quergestreifte Muskelfasern hat.
3. Richten Sie sich so ein, als ob Sie einen Z-Stapel erfassen würden, indem Sie oben (dh direkt über der Haut) und unten (dh direkt unter dem Notochord) definieren, um den gesamten Somiten einzubeziehen, auch wenn der Fisch leicht schief montiert ist). Sowohl die linke als auch die rechte Seite können beliebig erfasst werden. Dadurch wird sichergestellt, dass alle schnellen YZ-Scans die gewünschten Regionen erfassen.
4. Nehmen Sie wie folgt ein XY-Bild auf. Richten Sie den Scanbereich in Bezug auf die Fische aus, wie es die konfokale Software zulässt. Positionieren Sie den Fisch mit der anteroposterioren Achse parallel zur abgebildeten X-Achse und der dorsoventralen Achse parallel zur Y-Achse mit Somit 17 in der Mitte des Feldes, wie in Zusatzdatei 1 gezeigt. Konzentrieren Sie sich auf eine mittlere Ebene im obersten Myotom, in der die gesamten epaxialen und hypaxialen Somithälften zusammen mit den vertikalen und horizontalen Myosepten sichtbar sind und ein hochauflösendes XY-Bild aufnehmen. Denken Sie daran, das Bild zu benennen und zu speichern.
5. Nehmen Sie ein oder mehrere YZ-Bilder wie folgt auf. In den repräsentativen Ergebnissen (unten) wird die Genauigkeit von 2-Slice- und 4-Slice-Methoden verglichen. Beim 2-Slice-Ansatz werden einzelne XY - und YZ-Scans verwendet. Beim 4-Schichten-Ansatz werden drei YZ-Scans gemittelt, um eine genauere Schätzung des Myotomvolumens zu erhalten. Wenn von der konfokalen Software gefordert, richten Sie das Scanfeld neu aus.
   1. Zeichnen Sie eine präzise dorsale bis ventrale Linie über den gewählten Somiten senkrecht zur anteroposterioren Achse des Fisches in einer ausgewählten anteroposterioren Position. Führen Sie einen Z-Stack-Zeilenscan durch.
   2. Wiederholen Sie den YZ-Linienscan dreimal an definierten anteroposterioren Positionen entlang des ausgewählten Myotoms, um YZa, YZm und YZp zu erfassen. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2A dargestellt. Benennen und speichern Sie diese Bilder zusammen mit dem zugehörigen XY-Bild.
      HINWEIS: Bei Auswahl der YZ-Ebenen: Das Myotom ist V-förmig und seine Form ändert sich während des Wachstums. Um die genaueste Beurteilung des Myotom-17-Volumens mit der 4-Schicht-Methode zu erhalten, positionieren Sie YZa auf der vorderen Spitze des Myotoms, YZp auf den hinteren Spitzen des Myotoms an dorsalen und ventralen Extremen und YZm auf halbem Weg zwischen YZa und YZp. Unter der Annahme, dass sich der Somit gleichmäßig verjüngt, repräsentiert der Mittelwert der Messungen aus jedem YZ-Abschnitt das Myotom als Ganzes. Bei der 2-Schicht-Methode sollte der einzelne YZ-Scan am hinteren Ende des horizontalen Myoseptums positioniert werden, was in etwa dem anteroposterioren Zentrum des interessierenden Myotoms (z. B. YZm) entspricht. Alternativ kann ein Satz von drei YZ-Abschnitten am vorderen, mittleren und hinteren Teil des horizontalen Myoseptums durchgeführt werden, aber, wie unten gezeigt, wird eine solche Messung das Myotomvolumen leicht über- oder unterschätzen (für rostrale bzw. kaudale Somiten aufgrund der Verjüngung des Myotoms). Grundsätzlich ist die Konsistenz in der Positionierung von YZ-Schichtebenen zwischen Fischen und Experimenten der Schlüssel zur Reproduzierbarkeit.

4. Würdigung

1. Da das Myotom die Größe entlang des Fisches in einer abgestuften Weise ändert, arbeiten Sie in vergleichenden Studien immer mit dem gleichen Somit.
2. Um das Myotomvolumen zu messen und zu berechnen, verwenden Sie die konfokale Software (z. B. die .lsm-Dateien, die mit der Zeiss ZEN-Mikroskopsoftware erstellt wurden) oder die Open-Source-Software für die universelle Bildanalyse wie Fiji/ImageJ.
   HINWEIS: Wenn Sie Dateiformate ändern, stellen Sie sicher, dass die Z-Schritt-Größe korrekt übertragen wird, da nicht jede Software proprietäre konfokale Dateiformate korrekt lesen kann. Um beispielsweise ein ZEN-Zeilenscanbild in Fidschi zu importieren, verwenden Sie zuerst den Befehl Datei/Exportieren, um als .tif im Fenster Bild mit voller Auflösung - Einzelebenenformat zu exportieren, und importieren Sie es dann in Fidschi. Obwohl YZ scan.lsm direkt in Fidschi geöffnet werden kann, werden die resultierenden YZ-Bilder aufgrund falscher Auswertung der Z-Schrittweite in der Regel in der Z-Dimension komprimiert.
3. Analyse mit ZEN
   1. Öffnen Sie zunächst die XY-Dateien scan.lsm in ZEN. Wechseln Sie zur Registerkarte Grafiken und wählen Sie das Linienwerkzeug aus. Zeichne eine Linie zwischen den beiden vertikalen Myosepten von Somit 17, die sich über die gesamte Myotomlänge erstrecken (parallel zur anteroposterioren Achse des Fisches). Aktivieren Sie das Kontrollkästchen M, um die Werte der Messung anzuzeigen (Länge = 89,71 μm, siehe Zusatzdatei 2).
   2. Öffnen Sie die YZ scan.lsm-Dateien. Wählen Sie auf der Registerkarte Grafiken das Werkzeug Geschlossener Bézier aus. Zeichne um den Umfang des Myotoms. Wenn Sie fertig sind, aktivieren Sie das Kästchen M, dies würde den Wert der Messung anzeigen (Fläche = 11980,01 μm², siehe Zusatzdatei 3).
   3. Notieren Sie die Werte jeder Messung manuell in einer Tabelle. Mittelwert der CSA-Messungen nach Bedarf. Das Volumen des Myotoms kann als Volumen = Myotomlänge x CSA berechnet werden, d. h. 89,71 μm x 11980,01 μm² = 1,075 x 10⁶ μm³.
4. Analyse mit Fiji/ImageJ
   1. Öffnen Sie die XY-Dateien scan.lsm in Fiji/ImageJ. Überprüfen Sie, ob XY-Bilder , die direkt in Fidschi geöffnet werden, korrekt skaliert sind, wie sie sein sollten.
   2. Wählen Sie das Werkzeug "Gerade Linie" aus den Symbolen aus. Zeichnen Sie eine Linie entlang der Länge von Somit 17, wie in Schritt 4.3.1 beschrieben. Legen Sie die Messparameter fest, indem Sie zu Analysieren gehen, dann Messungen einstellen... auswählen und die folgenden Kontrollkästchen Bereichs- und Anzeigebeschriftung aktivieren. Um zu messen, drücken Sie einfach die Tastenkombination M oder gehen Sie zum Menü Analysieren und wählen Sie Messen. Ein Popup-Fenster listet alle Messwerte auf (d.h. Länge = 90,023 μm; siehe Zusatzdatei 4). Die Ergebnisse können in Form von .csv gespeichert und in Microsoft Excel o.ä. zur späteren Analyse geöffnet werden.
   3. Um CSA auf den YZ-Bildern zu messen, öffnen Sie YZ-Bilder in .tif Format, wie in Schritt 4.2 beschrieben.
   4. Kalibrieren Sie die YZ -.tif-Bilder, da sie beim Export unkalibriert sind. Parameter für die Kalibrierung können in ZEN abgerufen werden, indem Sie auf die Info der ausgewählten Bilder gehen: Notieren Sie die Werte Scaling X (0,489 μm) und Scaling Z (0,890 μm; siehe Zusatzdatei 5). Als nächstes, während die Bilder in Fidschi geöffnet sind, gehen Sie zu Bild und wählen Sie Eigenschaften.... Geben Sie 0,489 μm für die Pixelbreite und Pixelhöhe und 0,890 μm für die Voxeltiefe ein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Global , um die Kalibrierung universell anzuwenden, wenn eine wiederholte Messung von YZ-Bildern erwartet wird (siehe Zusatzdatei 6).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle YZ-Bilder mit den gleichen Scanparametern aufgenommen werden. Starten Sie Fiji/ImageJ neu oder ändern Sie die Kalibrierungswerte, wenn ein neuer Kalibrierungssatz erforderlich ist.
   5. Um die CSA der kalibrierten YZ-Bilder zu messen, wählen Sie das Werkzeug Polygonauswahl aus den Symbolen aus. Zeichnen Sie um den Umfang des Somiten herum und drücken Sie M , um die Werte der Messung anzuzeigen (Fläche = 11980,395 μm²; siehe Zusatzdatei 7). Das Volumen des Myotoms kann als Volumen = Myotomlänge x CSA berechnet werden, d. h. 90,023 μm x 11980,395 μm² = 1,079 x 10⁶ μm³.
   6. Wiederholen Sie die Messungen auf den anderen XY- und YZ-Bildern. Es wird empfohlen, die gleiche Software für alle Messungen innerhalb einer Versuchsreihe zu verwenden, um die Konsistenz zu gewährleisten. Die Volumenschätzung jeder Software ist ähnlich, aber aufgrund der unterschiedlichen Zeichenwerkzeuge nicht identisch, d. H. ZEN = 1,074 × 10 6 μm 3 und Fidschi / ImageJ = 1,079 × 10⁶ μm³. Das Wachstum des Myotoms zwischen zwei Zeitpunkten (d.h. 3 bis 4 dpf) kann wie folgt berechnet werden: (Volume 4 dpf - Volume 3 _dpf)/ Volume _{3 dpf} × 100%.
      HINWEIS: Bei Fehler und dessen Korrektur. Während der Montage sollte der Fisch mit seiner sagittalen Ebene (d.h. der anteroposterioren und dorsoventralen Achse) so nah wie möglich an der Horizontalen ausgerichtet werden, um ein Gieren bzw. Rollen zu vermeiden. Dies liegt daran, dass sowohl die aus dem XY-Scan gemessene Myotomlänge L als auch die aus einem YZ-Scan gemessene CSA überschätzt werden, wenn der Fisch aufgrund einer schrägen anteroposterioren Montage eine Gage (Rotation um die dorsoventrale Achse) zeigt. Weder Nicken noch Rollen während der Montage sollten die Messungen nach dem Scannen beeinflussen, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Dennoch verschlechtert die dorsoventrale Rotation (Roll) die Bildqualität. Die einfache Trigonometrie zeigt, dass bis zu 10° Gierfehler bei der Volumenmessung 3% ergeben, wobei L und CSA jeweils proportional zu (cosq)^-1 zunehmen, wobei q der Winkel von anteroposterior horizontal (Gieren) ist. 15° und 20° Off ergeben 7% bzw. 13% Überschätzungen des Volumens.
      Da das Notochord zylindrisch ist, kann die Einbeziehung des gesamten Notochord in den YZ-Scan verwendet werden, um den Winkel und das Ausmaß der Neigung aus der Orientierung und Größe der Haupt- und Nebenachse zu berechnen und dadurch die gemessene L und CSA zu korrigieren, um die Genauigkeit zu maximieren. Korrigierte CSA = Gemessene CSA x Notochord-Nebenachse/Notochord-Hauptachse. Korrigiert L = Gemessen L x Notochord-Nebenachse/Notochord-Achse in Mikroskop-Z-Richtung .
      Eine weitere Überlegung erlaubt eine zusätzliche Korrektur von L. Wenn das Myotom wächst, neigt es sich in der koronalen Ebene (normal zur dorsoventralen Achse), so dass das mediale Myotom leicht vor dem lateralen Myotom liegt. Von dorsal betrachtet bilden die vertikalen Myosepten auf der linken und rechten Seite einen breiten Chevron, der nach vorne zeigt. Wenn die Gähne niedrig ist, hat diese Morphologie keinen Einfluss auf die Messung von L. Wenn die Gähne jedoch signifikant ist, wird die trigonometrische Korrektur zu einer Herausforderung, und ein besserer Ansatz besteht darin, True L direkt zu messen, indem die XYZ-Koordinaten der beiden Punkte geschätzt werden, an denen die vorderen und hinteren vertikalen Myosepten auf den Notochord am horizontalen Myoseptum treffen. Die einfache Trigonometrie erlaubt die Berechnung von True L aus diesen Koordinaten als L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)²]. Die Schwächen dieses letzten Ansatzes bestehen darin, dass a) die Auswahl der Punkte je nach Bediener variieren kann und b) keine visuelle Aufzeichnung der ausgewählten Punkte beibehalten wird. Diese Überlegung hat keinen Einfluss auf die CSA-Korrektur.

5. Optionale Methode: Muskelelektrische Aktivität entfernen und wieder einführen

1. Erstellen Sie eine Stimulationskammer.
   1. Nehmen Sie eine 6 x 35 mm große Vertiefungsplatte, und erzeugen Sie zwei kleine Öffnungen (<5 mm Durchmesser, 1 cm Abstand) auf jeder Seite jeder Vertiefung (siehe Abbildung 1) mit einem schmalen Lötkolben.
      HINWEIS: Behandeln Sie den heißen Lötkolben vorsichtig und arbeiten Sie bei Bedarf in einem Abzug, um das Einatmen von Dampf zu vermeiden.
   2. Fädeln Sie ein Paar Silber- oder Platindrähte (~20 cm lang) durch die Öffnungen jedes Vertiefungs (siehe Abbildung 1). Wiederverwendbares Klebematerial (z. B. BluTack) kann in der Nähe der Öffnungen aufgetragen werden, um die Drähte an Ort und Stelle zu halten und einen Abstand von 1 cm zwischen den Drähten zu gewährleisten (siehe Abbildung 1).
2. Bei 3 dpf den Fisch in drei Bedingungen aufteilen: Fisch medium Control, Inactive und Inactive + Stim.
   1. Für inaktive und inaktive+Stim-Gruppen die Larven 72 Stunden nach der Befruchtung (hpf) mit Tricain (0,6 mM) anästhesieren.
      ANMERKUNG: Gemäß Referenz³⁸ werden gefrorene Aliquots des Tricainbestands aufgetaut und verdünnt (40 μL/ml Fischmedium auf eine Endkonzentration von 0,6 mM), bevor sie dem Fisch hinzugefügt werden. Fügen Sie Tricain nicht direkt in das fischhaltige Wasser hinzu, da einige Fische hohe Dosen erhalten könnten. Tricainbrühen sollten innerhalb eines Monats verbraucht und niemals wieder eingefroren werden.
   2. Für den Fisch Medium Kontrollfische, lassen Sie sie unbetäubt.
3. Zu ausgewählten Zeitpunkten nach Beginn der Tricain-Exposition (d. h. bei 80 hpf) bereiten Sie die Inactive+Stim-Gruppe auf die Stimulation vor.
   1. Bereiten Sie 60 ml 2% Agarose (1,2 g Agarosepulver in 60 ml Fischmedium) vor und schmelzen Sie vollständig in der Mikrowelle, kühlen Sie ab, fügen Sie Tricain hinzu und gießen Sie 4 ml in jede Vertiefung der Stimulationskammer (Abbildung 1).
   2. Fügen Sie sofort maßgeschneiderte 4-Well-Kämme zwischen die Elektroden (erstellt durch Ausschneiden von Kunststoffen (z. B. Polypropylen) mit den gewünschten Abmessungen und Zusammenkleben mit Sekundenkleber; siehe Abbildung 1). Lassen Sie 10 Minuten für das Gel aushärten. Entfernen Sie die Kämme vorsichtig, um vier rechteckige Vertiefungen zu schaffen.
   3. Füllen Sie jede Vertiefung mit Tricainwasser und legen Sie eine einzelne betäubte Inactive+Stim-Larve mit einer Mikropipette in jede Vertiefung, wobei ihre anteroposteriore Achse senkrecht zu den Elektroden steht (siehe Abbildung 1).
   4. Überprüfen Sie unter dem Fluoreszenzmikroskop, ob jeder Fisch in jedem Vertiefung der Kammer vollständig betäubt ist.
4. Verbinden Sie einen einstellbaren elektrophysiologischen mustererzeugenden Stimulator über einen Polaritätsregler mit der Kammer, indem Sie Krokodilclips verwenden, die mit jeder der Elektroden auf einer Seite der Kammer verbunden sind (siehe Abbildung 1).
   HINWEIS: Der Polaritätsregler wird verwendet, um die Polarität alle 5 s umzukehren, um Elektrolyse und Korrosion der Elektroden zu verhindern.
5. Fische stimulieren. Zum Beispiel ergibt 1s mit einem Zug von 200, 20 V-Impulsen, mit 0,5 ms Pulsdauer und 4,5 ms Pulstrennung, einmal alle 5 s ein effektives wiederholt-tetanisches Kontraktionswiderstandsregime.
6. Überprüfen Sie regelmäßig unter dem Mikroskop, ob die Fische stimuliert werden. Das Beispiel für einen elektrischen Reiz sollte einmal alle 5 s eine sichtbare bilaterale Kontraktion und leichte Bewegung induzieren.
7. Für ein Widerstands- / Hochkraftregime stimulieren Sie den Fisch mit einer hohen Frequenz für einen Kampf von 5 Minuten, dreimal, wobei jeder Kampf durch 5 Minuten Ruhe getrennt ist.
   HINWEIS: Während Fische auf einer Seite der Kammer ruhen, können die Krokodilclips mit dem Elektrodenpaar auf der anderen Seite der Kammer verbunden und diese zusätzlichen Fische stimuliert werden.
8. Entfernen Sie nach der Stimulation vorsichtig Fische aus jedem Brunnen, indem Sie sie vorsichtig mit einer Plastikpipette ausspülen, und kehren Sie in frischem Tricain-haltigem Fischmedium in den Inkubator zurück.
9. Gießen Sie das Tritainwasser aus der Kammer weg und verwenden Sie eine Pinzette, um die Agarose aus jedem Brunnen zu schneiden und zu entfernen. Die Brunnen mit Leitungswasser abspülen und trocknen lassen.
   HINWEIS: Bei Verwendung von Silberdrahtelektroden kann sich nach einem Stimulationsexperiment gelegentlich Silberoxid auf der Oberfläche des Drahtes ansammeln. Da Silberoxid weniger leitfähig ist als Silber, um die Reproduzierbarkeit zu erhalten, reiben Sie Silberoxid vorsichtig mit Kimwipes vom Draht ab, bevor Sie das Setup wiederverwenden.

Ergebnisse

Eine schnelle und präzise Messung des Somit-Volumens
Es wird eine Methode der Probenvorbereitung, Datenerfassung und volumetrischen Analyse beschrieben, die die schnelle Messung des Muskelwachstums in Zebrafischlarven ermöglicht. Die Muskelgröße kann bei lebenden Tieren gemessen werden, indem Fische verwendet werden, die auf ihren Plasmamembranen mit einem membrangezielten GFP (β-Aktin:HRAS-EGFP ) oder mCherry (α-Aktin:mCherry-CAAX ) markiert sind. Die Larven wurden vorübergeh...

Diskussion

Hier berichten wir über eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung des Muskelvolumens lebender Zebrafischlarven in Stadien oder in genetischen Varianten, bei denen die Pigmentierung kein großes Hindernis für die Bildgebung darstellt und wenn eine vorübergehende Anästhesie und/oder Immobilisierung gut toleriert wird. Während wir die konfokale Laserscanning-Mikroskopie verwendet haben, sind die beschriebenen Ansätze auf die konfokale Spinnscheiben- oder Lichtblattmikroskopie und auf jede andere Methode anwe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive, Blu Tack	Bostik	-	-
Aerosol vacuum	-	-	-
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	-
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414	Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heater	Cole-Parmer	SBH130	-
BODIPY FL C5-ceramide	Thermo Scientific	D3521	To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires	-	-	-
Fiji/imageJ	National Institutes of Health, NIH	-	-
Fish medium, Fish water	-	-	Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium	-	-	E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscope	Leica	Leica MZ16F	Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needle	World Precision Instruments, Inc.	1B100-6	To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulator	Grass Instruments	S88	Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	13258179	-
Laser scanning microscope (LSM)	Zeiss	Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880	LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate	Thermo Scientific	140675	-
Objective, 20×/1.0W water immersion	Zeiss	-	-
Pasteur Pipette, Graduated 1 mL	Starlab Group	E1414-0100	-
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL	Starlab Group	E1414-1100	-
Petri dish, 60 mm	Sigma-Aldrich	P5481	-
Plasmid, CMV-Cerulean	Christina L. Hammond (University of Bristol)		pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAX	Henry Roehl (University of Sheffield)	-	For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller	Hoefer Scientific Instruments	PC750	-
Soldering iron	-	-	-
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521	Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
Volocity	Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc	-	-
Watchmaker forceps, No. 5	-	-	-
Wire, Platinum	Goodfellow	PT005142/12	0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, Silver	Acros Organics	317730010	0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFP	David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)	-	ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX	Peter D. Currrie (ARMI, Monash University)	-	ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP	-	-	ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
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