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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La clarté optique est un avantage majeur pour le travail biologique et physiologique cellulaire chez le poisson zèbre. Des méthodes robustes de mesure de la croissance cellulaire chez des animaux individuels sont décrites qui permettent de mieux comprendre comment la croissance des muscles squelettiques et des tissus voisins est intégrée à la croissance du corps entier.

Résumé

Un certain nombre de méthodes peuvent être utilisées pour visualiser des cellules individuelles dans tout le corps de poissons-zèbres embryonnaires, larvaires ou juvéniles vivants. Nous montrons que les poissons vivants avec des membranes plasmiques marquées par fluorescence peuvent être scannés dans un microscope confocal à balayage laser afin de déterminer le volume de tissu musculaire et le nombre de fibres musculaires présentes. Des approches efficaces pour la mesure du nombre et de la taille des cellules chez les animaux vivants au fil du temps sont décrites et validées par rapport à des méthodes de segmentation plus ardues. Des méthodes sont décrites qui permettent le contrôle de l’activité électrique musculaire, et donc contractile. La perte de contractile des muscles squelettiques a considérablement réduit la croissance musculaire. Chez les larves, un protocole est décrit qui permet la réintroduction d’une activité contractile évoquée électriquement. Les méthodes décrites minimisent l’effet de la variabilité interindividuelle et permettront d’analyser l’effet des stimuli électriques, génétiques, médicamenteux ou environnementaux sur une variété de paramètres de croissance cellulaire et physiologique dans le contexte de l’organisme vivant. Un suivi à long terme des effets mesurés d’une intervention définie en début de vie sur les individus peut ensuite être effectué.

Introduction

La croissance tissulaire régulée, comprenant l’augmentation du nombre de cellules (hyperplasie) et / ou de la taille des cellules (hypertrophie), est un facteur crucial dans le développement, la régénération et l’adaptation écologique et évolutive. Malgré d’énormes progrès dans la compréhension génétique moléculaire de la biologie cellulaire et du développement au cours des dernières décennies, la compréhension mécaniste de la régulation de la taille des tissus et des organes en est encore à ses balbutiements. L’une des raisons de cette lacune dans les connaissances est la difficulté de quantifier la croissance tissulaire dans les organismes vivants avec la précision spatiale et temporelle nécessaire.

Divers aspects de la croissance d’organismes entiers peuvent être mesurés à plusieurs reprises au fil du temps, révélant des courbes de croissance pour chaque individu 1,2,3,4,5. Des méthodes de balayage de plus en plus sophistiquées, telles que l’absorptiométrie à rayons X (DXA), la tomodensitométrie (TDM) et l’imagerie par résonance magnétique (IRM), permettent de suivre la croissance d’organes entiers et d’autres régions du corps (par exemple, les muscles squelettiques identifiés individuellement) chez des individus isolés, humains et modèles 6,7,8,9,10 . Cependant, ces méthodes n’ont pas encore la résolution de révéler des cellules individuelles et donc les liens entre les comportements cellulaires et la croissance au niveau des tissus ont été difficiles à discerner. Pour établir de tels liens, les études traditionnelles se sont souvent appuyées sur des cohortes d’animaux individuels similaires, dont quelques-uns sont sacrifiés à des moments successifs, puis analysés en détail cytologique. De telles approches nécessitent de faire la moyenne des changements observés entre des groupes d’individus (de préférence similaires, mais néanmoins variables) et souffrent donc d’un manque de résolution temporelle et spatiale, ce qui rend difficile la recherche d’événements corrélés au niveau cellulaire suggérant une cause et un effet.

Des études sur des organismes modèles d’invertébrés, initialement chez C. elegans et D. melanogaster, ont contourné ces problèmes en développant la microscopie optique pour atteindre une résolution cellulaire et mesurer avec précision la croissance au fil du temps chez des individus individuels. De telles études ont révélé des comportements de lignée cellulaire étonnamment invariants dans la croissance de ces petits organismes modèles 11,12,13,14,15,16,17. Cependant, de nombreux animaux, y compris tous les vertébrés, ont des lignées cellulaires indéterminées et contrôlent la croissance des tissus par de mystérieux processus de rétroaction qui servent à transformer le programme de croissance codé génétiquement en un organisme fonctionnel tridimensionnel avec tous ses tissus constitutifs et organes de taille appropriée. Pour comprendre ces processus de croissance complexes, il est souhaitable d’imager des tissus ou des organes entiers au fil du temps chez des individus uniques qui peuvent être manipulés expérimentalement par des interventions génétiques, pharmacologiques ou autres au moment de leur choix et dont l’effet est analysé par la suite.

Chaque muscle squelettique des vertébrés a une taille, une forme et une fonction définies, et des interactions bien caractérisées avec les tissus adjacents, tels que les os, les tendons et les nerfs. Certains muscles sont petits, se trouvent juste sous la peau et sont donc de bons candidats pour les études d’imagerie à haute résolution. Comme la plupart des organes, chaque muscle se développe tout au long de la vie embryonnaire, postnatale et juvénile, avant d’atteindre une taille adulte stable. Le muscle, cependant, a également une capacité unique à changer de taille au cours de la vie adulte, en fonction de l’utilisation et de la nutrition18, et cette propriété a un impact majeur sur la forme physique de l’organisme, la performance sportive et la vie autonome. La perte de masse musculaire et de fonction chez les personnes âgées, la sarcopénie, est un problème de plus en plus préoccupant pour les sociétés confrontées à une population vieillissante 19,20,21.

Nous et d’autres nous sommes concentrés sur la croissance de blocs définis de tissu musculaire squelettique dans le corps segmenté des larves de poisson zèbre, en tant que système apparemment fermé contenant plusieurs centaines de cellules dans lequel la croissance, l’entretien et la réparation des tissus peuvent être observés et manipulés 22,23,24,25,26. Bien que certains travaux quantitatifs aient déjà été rapportés 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, aucune méthode détaillée et validée de mesure de la croissance musculaire dans les détails cellulaires chez les organismes vertébrés individuels au fil du temps n’est disponible. Ici, un protocole efficace sur la façon d’effectuer de telles mesures répétées est décrit, ainsi que la validation, et un exemple de son utilisation pour analyser les changements dans la croissance hypertrophique et hyperplasique en réponse à une activité électrique altérée est fourni.

Protocole

Toutes les recherches décrites ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles et sous les licences appropriées du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni conformément à la loi de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) et aux modifications ultérieures. Les embryons/larves doivent être élevés à 28,5 °C jusqu’à la fin de la gastrulation, mais peuvent ensuite être maintenus à 22-31 °C pour contrôler le taux de développement. Les poissons peuvent être scannés ou stimulés à température ambiante.

1. Anesthésier les larves de poisson zèbre

  1. Croisez les poissons adultes rapporteurs fluorescents appropriés tels que Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg référence 36 ou Tg(α-actin:mCherry-CAAX)pc22Tg référence37 et collectez des embryons comme décrit38.
  2. Au moment de votre choix, par exemple 2 jours après la fécondation (dpf), anesthésiez brièvement les embryons à l’aide d’un milieu de poisson contenant de la tricaïne (eau de poisson ou milieu E3) et dépister l’EGFP ou le mCherry au microscope à fluorescence, tel qu’un Leica MZ16F. Si l’on a beaucoup d’embryons, sélectionnez ceux qui ont le signal le plus lumineux. Remettre les embryons dans un milieu de poisson normal immédiatement après le dépistage.

2. Montage de poissons pour balayage confocale

  1. Allumez le système de balayage laser confocale et les lasers, pour laisser le système se stabiliser pendant 30-60 min.
    REMARQUE: Ici, nous avons utilisé un microscope Zeiss LSM 5 Exciter avec support en matériaux verticaux (qui améliore la distance de travail) équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau 20x / 1,0 W.
  2. Préparer l’agarose à bas point de fusion (AGM) à 1 % et conserver dans un bloc de chaleur à 37 °C pour une utilisation répétée dans un tube de 1,5 mL. Pour éviter les chocs thermiques, retirez la partie aliquote LMA du bloc thermique et laissez-la refroidir juste au-dessus du réglage avant de l’appliquer sur la larve, en testant contre la peau pour juger de la température appropriée, comme lors de l’évaluation de la température du lait maternisé.
  3. Sélectionner les poissons à monter et anesthésier transitoirement chaque poisson à tour de rôle avec Tricaine (0,6 mM dans le milieu poisson).
  4. Prenez une boîte de Petri de 60 mm de diamètre recouverte d’une couche d’agarose à 1% et placez-la sur la scène d’un microscope à dissection.
  5. Transférer la larve à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique de 1 ml sur la boîte de Petri revêtue de 60 mm et retirer autant de milieu transféré que possible. Ensuite, toujours à l’aide de la pipette Pasteur, placez 5 à 10 gouttes de LMA sur le poisson et positionnez-le rapidement horizontalement en vue latérale avec une pince (ou une aiguille en verre fin polie au feu) avant que le LMA ne se fixe. Pour une imagerie optimale, il est souhaitable de positionner la larve près de la surface supérieure du LMA.
    1. Sinon, à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique de 1 mL, prélever la larve avec le moins de milieu de poisson possible et transférer la larve dans la partie aliquote du LMA refroidi. Laissez la larve couler pendant 5 s pour être complètement entourée de LMA. Ensuite, récupérez la larve et transférez-la dans une goutte de LMA sur la boîte de Petri enrobée d’agarose. Orienter et positionner rapidement la larve comme décrit ci-dessus.
  6. Orientez la larve avec ses axes antéropostérieur et dorso-ventral à moins de 10° de l’horizontale (voir la note « Sur l’erreur et sa correction », point 4.6 ci-dessous).
    1. Si la larve n’est pas correctement montée horizontalement près de la surface de la goutte d’agarose, retirez-la et réintégrez-la. Les larves peuvent être facilement récupérées par aspiration douce à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique microfine de 1 mL, et le LMA peut être retiré doucement à l’aide de Kimwipes. La pratique rend vraiment parfait dans la procédure de montage; Passez un après-midi à intégrer des larves sans importance avant d’essayer cela dans une expérience réelle.
      REMARQUE: Lors de la conception du microscope: De nombreux laboratoires utilisent des microscopes confocaux inversés pour l’imagerie à travers un couvercle. Nous avons constaté que l’enrobage et l’enlèvement répétés de poissons conservés dans l’agarose sous une lamelle de couverture pour observation dans un microscope inversé entraînent une plus grande perte d’échantillons lors d’un balayage répété que dans la procédure décrite avec un microscope vertical. Pour cette raison, l’utilisation d’un système vertical est recommandée, si disponible. Néanmoins, une clé pour des données de haute qualité est la sélection et l’utilisation appropriées des paramètres objectifs et de balayage, un sujet trop vaste pour être discuté ici.

3. Balayage confocal

  1. Lorsque le LMA a pris, inonder le plat d’environ 10 ml de milieu de poisson contenant de la tricaïne. Si vous prévoyez capturer des piles confocales, laissez reposer le poisson monté pendant au moins 10 minutes avant de procéder au balayage, car un gonflement de l’agarose se produit.
  2. Chargez la capsule d’échantillon au stade du système confocale, localisez la larve et concentrez-vous sur le somite souhaité. Somite 17 peut être choisi en raison de sa facilité de localisation près de l’évent anal et de sa facilité d’imagerie. Vérifiez en comptant les somites antérieurs.
    REMARQUE: Le premier somite est fusionné derrière l’oreille et n’a pas de bordure antérieure, mais on peut facilement observer qu’il a des fibres musculaires striées.
  3. Configurez comme pour capturer une pile Z en définissant le haut (c’est-à-dire juste au-dessus de la peau) et le bas (c’est-à-dire juste en dessous de la notochorde, de manière à inclure le somite entier, même si le poisson est monté légèrement incliné). Les côtés gauche et droit peuvent être capturés comme vous le souhaitez. Cela garantira que toutes les analyses rapides YZ capturent la ou les régions souhaitées.
  4. Capturez une image XY comme suit. Orientez la zone de balayage par rapport au poisson, comme le permet le logiciel confocale. Placez le poisson avec l’axe antéropostérieur parallèle à l’axe X imagé et l’axe dorso-ventral parallèle à l’axe Y avec somite 17 au centre du champ, comme indiqué dans le dossier supplémentaire 1. Concentrez-vous sur un plan de niveau moyen dans le myotome supérieur dans lequel l’ensemble des moitiés de somite épaxiale et hypaxiale ainsi que les myosepta verticaux et horizontaux sont visibles et capturez une image XY haute résolution. N’oubliez pas de nommer et d’enregistrer l’image.
  5. Capturez une ou plusieurs images YZ comme suit. Dans les résultats représentatifs (ci-dessous), la précision des méthodes à 2 tranches et à 4 tranches est comparée. Dans l’approche à 2 tranches, des scans XY et YZ uniques sont utilisés. Dans l’approche à 4 coupes, trois balayages YZ sont moyennés pour donner une estimation plus précise du volume de myotome. Si le logiciel confocal l’exige, réorientez le champ de numérisation.
    1. Tracez une ligne dorsale à ventrale précise à travers le somite choisi perpendiculairement à l’axe antéropostérieur du poisson à une position antéropostérieure choisie. Effectuez un balayage de ligne Z-stack.
    2. Répétez le balayage de la ligne YZ trois fois à des positions antéropostérieures définies le long du myotome sélectionné pour capturer YZa, YZm et YZp. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 2A. Nommez et enregistrez ces images avec l’image XY associée.
      REMARQUE: Lors de la sélection des plans YZ: Le myotome est en forme de V et sa forme change au cours de la croissance. Pour obtenir l’évaluation la plus précise du volume du myotome 17 avec la méthode des 4 coupes, positionnez YZa sur l’extrémité antérieure du myotome, YZp sur les extrémités postérieures du myotome aux extrémités dorsale et ventrale, et YZm à mi-chemin entre YZa et YZp. En supposant que le somite se rétrécit uniformément, la moyenne des mesures de chaque section YZ représentera le myotome dans son ensemble. Pour la méthode à 2 coupes, le balayage YZ unique doit être positionné à l’extrémité postérieure du myoseptum horizontal, ce qui correspond à peu près au centre antéropostérieur du myotome d’intérêt (tel que YZm). Alternativement, un ensemble de trois sections YZ peut être pris à l’avant, au milieu et à l’arrière du myoseptum horizontal, mais, comme indiqué ci-dessous, une telle mesure surestime légèrement le volume du myotome (pour les somites rostrales et caudales, respectivement, en raison de la diminution du myotome). Fondamentalement, la cohérence dans le positionnement des plans de tranche YZ entre les poissons et les expériences est essentielle à la reproductibilité.

4. Analyse

  1. Comme le myotome change de taille le long du poisson de manière graduée, travaillez toujours avec le même somite dans les études comparatives.
  2. Pour mesurer et calculer le volume de myotome, utilisez le logiciel confocal (tel que les fichiers .lsm créés à l’aide du logiciel de microscope Zeiss ZEN) ou un logiciel d’analyse d’images universel open source, tel que Fiji/ImageJ.
    REMARQUE: Si vous modifiez les formats de fichiers, assurez-vous que la taille Z-step est correctement transférée, car tous les logiciels ne peuvent pas lire correctement les formats de fichiers confocaux propriétaires. Par exemple, pour importer une image de balayage de ligne ZEN aux Fidji, utilisez d’abord la commande Fichier/Exporter pour exporter en tant que .tif dans la fenêtre Image pleine résolution - format plan unique, puis importez aux Fidji. Bien que YZ scan.lsm puisse être ouvert directement aux Fidji, les images YZ résultantes sont généralement compressées dans la dimension Z en raison d’une évaluation incorrecte de la taille de l’étape Z.
  3. Analyse à l’aide de ZEN
    1. Tout d’abord, ouvrez les fichiers XY scan.lsm dans ZEN. Accédez à l’onglet Graphiques et sélectionnez l’outil Ligne. Tracez une ligne entre les deux myoseptes verticaux du somite 17 couvrant toute la longueur du myotome (parallèle à l’axe antéropostérieur du poisson). Cochez la case M pour afficher les valeurs de la mesure (Longueur = 89,71 μm, voir Fichier supplémentaire 2).
    2. Ouvrez les fichiers YZ scan.lsm. Sous l’onglet Graphiques , sélectionnez l’outil Bézier fermé . Dessinez autour du périmètre du myotome. Une fois terminé, cochez la case M, cela révélerait la valeur de la mesure (Surface = 11980,01 μm2, voir Fichier supplémentaire 3).
    3. Enregistrez manuellement les valeurs de chaque mesure dans une feuille de calcul. Faire la moyenne des mesures de l’ASC au besoin. Le volume du myotome peut être calculé comme suit : Volume = longueur du myotome x CSA, c’est-à-dire 89,71 μm x 11980,01 μm2 = 1,075 x 106 μm3.
  4. Analyse à l’aide de Fidji/ImageJ
    1. Ouvrez les fichiers XY scan.lsm dans Fiji/ImageJ. Vérifiez si les images XY directement ouvertes aux Fidji sont correctement calibrées à l’échelle, comme elles devraient l’être.
    2. Sélectionnez l’outil Ligne droite parmi les icônes. Tracez une ligne le long du somite 17 comme décrit à l’étape 4.3.1. Définissez les paramètres de mesure en accédant à Analyser, puis sélectionnez Définir les mesures..., et cochez les cases Zone et Afficher l’étiquette. Pour mesurer, appuyez simplement sur la touche de raccourci M ou allez dans le menu Analyser et sélectionnez Mesurer. Une fenêtre contextuelle qui s’affiche répertorie toutes les valeurs de mesure (c.-à-d. Longueur = 90,023 μm; voir Fichier supplémentaire 4). Les résultats peuvent être enregistrés sous forme de .csv et ouverts dans Microsoft Excel ou similaire pour une analyse ultérieure.
    3. Pour mesurer l’ASC sur les images YZ , ouvrez les images YZ dans .tif format décrit à l’étape 4.2.
    4. Calibrez les images YZ .tif car elles ne sont pas calibrées lors de l’exportation. Les paramètres pour l’étalonnage peuvent être obtenus dans ZEN en allant dans les Infos des images sélectionnées : enregistrez les valeurs de mise à l’échelle X (0,489 μm) et de mise à l’échelle Z (0,890 μm ; voir Fichier supplémentaire 5). Ensuite, lorsque les images sont ouvertes aux Fidji, allez dans Image et sélectionnez Propriétés.... Entrée 0,489 μm pour la largeur et la hauteur des pixels, et 0,890 μm pour la profondeur du voxel. Cochez la case Global pour appliquer l’étalonnage universellement si la mesure répétée des images YZ est prévue (voir le dossier supplémentaire 6).
      REMARQUE: Assurez-vous que toutes les images YZ sont capturées en utilisant les mêmes paramètres de numérisation; redémarrez Fiji/ImageJ ou modifiez les valeurs d’étalonnage si un nouveau jeu d’étalonnage est nécessaire.
    5. Pour mesurer le CSA des images YZ calibrées, sélectionnez l’outil Sélections de polygones parmi les icônes. Dessinez autour du périmètre du somite et appuyez sur M pour afficher les valeurs de la mesure (Surface = 11980,395 μm2; voir le dossier supplémentaire 7). Le volume du myotome peut être calculé comme suit : Volume = longueur du myotome x CSA, c’est-à-dire 90,023 μm x 11980,395 μm2 = 1,079 x 106 μm3.
    6. Répétez les mesures sur les autres images XY et YZ. Il est recommandé d’utiliser le même logiciel pour toutes les mesures au sein d’une série expérimentale pour plus de cohérence. L’estimation du volume de chaque logiciel est similaire mais pas identique en raison des outils de dessin distincts, c’est-à-dire ZEN = 1,074 × 10 6 μm 3 et Fidji/ImageJ = 1,079 × 106 μm3. La croissance du myotome entre deux points temporels (c.-à-d. 3 à 4 dpf) peut être calculée comme suit : (Volume 4 dpf - Volume 3 dpf)/ Volume 3 dpf × 100 %.
      REMARQUE: Sur l’erreur et sa correction. Pendant le montage, le poisson doit être orienté avec son plan sagittal (c.-à-d. les axes antéropostérieur et dorso-ventral) aussi près que possible de l’horizontale, afin d’éviter le lacet et le roulis, respectivement. En effet, la longueur du myotome L mesurée à partir du balayage XY et l’ASC mesurée à partir d’un balayage YZ seront surestimées si le poisson présente un lacet (rotation autour de l’axe dorso-ventral) en raison d’un montage antéropostérieur oblique. Ni le tangage ni le roulis pendant le montage ne doivent affecter les mesures après le balayage comme décrit à la section 3. Néanmoins, la rotation dorso-ventrale (rouleau) dégrade la qualité de l’image. La trigonométrie simple montre que jusqu’à 10° de lacet donnera une erreur de 3% dans la mesure du volume, comme mesuré L et CSA chaque augmentation proportionnelle à (cosq)-1, où q est l’angle par rapport à l’horizontale antéropostérieure (lacet). 15° et 20° de réduction donneront respectivement une surestimation de 7% et 13% du volume.
      Comme la notochorde est cylindrique, l’inclusion de la notochorde entière dans le balayage YZ peut être utilisée pour calculer l’angle et l’étendue de l’obliquité à partir de l’orientation et de l’amplitude des axes majeur et mineur et ainsi corriger le L et le CSA mesurés pour maximiser la précision. CSA corrigé = Mesuré CSA x axe mineur notochorde/axe majeur notochorde. Corrigé L = Mesuré L x axe mineur de la notochorde/axe de la notocrde dans la direction Z du microscope.
      Une autre considération permet une correction supplémentaire de L. Au fur et à mesure que le myotome grandit, il se penche dans le plan coronal (normal à l’axe dorso-ventral) de sorte que le myotome médian est légèrement antérieur au myotome latéral. Vu de la dorsale, les myoseptes verticaux des côtés gauche et droit forment un large chevron pointant vers l’avant. Si le lacet est bas, cette morphologie n’affecte pas la mesure de L. Mais si le lacet est significatif, la correction trigonométrique devient difficile et une meilleure approche consiste à mesurer directement le vrai L en estimant les coordonnées XYZ des deux points où les myosepta verticaux antérieur et postérieur rencontrent la notochorde au myoseptum horizontal. La trigonométrie simple permet de calculer True L à partir de ces coordonnées comme L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)2]. Les faiblesses de cette dernière approche sont que a) la sélection des points peut varier selon l’opérateur et b) aucun enregistrement visuel des points choisis n’est conservé. Cette considération n’a pas d’incidence sur la correction de l’ASC.

5. Méthode optionnelle: Supprimer et réintroduire l’activité électrique musculaire

  1. Créez une chambre de stimulation.
    1. Prenez une plaque de puits de 6 x 35 mm, créez deux petites ouvertures (<5 mm de diamètre, espacées de 1 cm) de chaque côté de chaque puits (voir figure 1) à l’aide d’un fer à souder étroit.
      REMARQUE: Manipulez le fer à souder chaud avec soin et travaillez dans une hotte si vous le souhaitez pour éviter d’inhaler de la vapeur.
    2. Enfiler une paire de fils d’argent ou de platine (~20 cm de long) à travers les ouvertures de chaque puits (voir la figure 1). Un matériau adhésif réutilisable (p. ex., BluTack) peut être appliqué près des ouvertures pour maintenir les fils en place et assurer une séparation de 1 cm entre les fils (voir la figure 1).
  2. À 3 dpf, diviser le poisson en trois conditions : contrôle du milieu de poisson, inactif et inactif + Stim.
    1. Pour les groupes inactifs et inactifs + Stim, anesthésier les larves 72 heures après la fécondation (HPF) avec Tricaine (0,6 mM).
      NOTA : Conformément à la référence38, les aliquotes congelées du stock de tricaïne sont décongelées et diluées (milieu de poisson de 40 μL/mL, jusqu’à une concentration finale de 0,6 mM) avant d’être ajoutées au poisson. N’ajoutez pas de tricaïne directement dans l’eau contenant des poissons, car certains poissons pourraient recevoir des doses élevées. Le stock de tricaïne doit être utilisé dans un délai d’un mois et ne jamais être recongelé.
    2. Pour le milieu de poisson Contrôlez les poissons, laissez-les non anesthésiés.
  3. À un moment ou plusieurs fois après le début de l’exposition à la tricaïne (c.-à-d. à 80 hpf), préparer le groupe Inactif+Stim à la stimulation.
    1. Préparer 60 mL d’agarose à 2 % (1,2 g de poudre d’agarose dans 60 mL de milieu poisson) et faire fondre complètement au micro-ondes, refroidir, ajouter de la tricaïne et verser 4 mL dans chaque puits de la chambre de stimulation (Figure 1).
    2. Ajoutez immédiatement des peignes à 4 puits sur mesure entre les électrodes (créés en découpant des plastiques (par exemple, du polypropylène) de dimensions souhaitées et en collant ensemble à l’aide de Superglue; voir Figure 1). Laisser reposer 10 min pour que le gel prenne. Retirez soigneusement les peignes pour créer quatre puits rectangulaires.
    3. Remplissez chaque puits avec de l’eau tricaine et placez une seule larve Inactive + Stim anesthésiée dans chaque puits à l’aide d’une micropipette, leur axe antéropostérieur étant perpendiculaire aux électrodes (voir la figure 1).
    4. Vérifiez sous le microscope fluorescent à dissection si chaque poisson est entièrement anesthésié dans chaque puits de la chambre.
  4. Connectez un stimulateur électrophysiologique réglable générant des motifs à la chambre via un contrôleur de polarité, à l’aide de pinces crocodiles connectées à chacune des électrodes d’un côté de la chambre (voir Figure 1).
    REMARQUE: Le contrôleur de polarité est utilisé pour inverser la polarité toutes les 5 s, afin d’éviter l’électrolyse et la corrosion des électrodes.
  5. Stimuler les poissons. Par exemple, 1s avec un train d’impulsions de 200, 20 V, avec une durée d’impulsion de 0,5 ms et une séparation d’impulsions de 4,5 ms, une fois toutes les 5 s donne un régime efficace de résistance à la contraction tétanique répétée.
  6. Vérifiez régulièrement au microscope pour confirmer que les poissons sont stimulés; L’exemple de stimulus électrique doit induire une contraction bilatérale visible et un léger mouvement, une fois toutes les 5 s.
  7. Pour un régime résistance/force élevée, stimuler le poisson à haute fréquence pendant un épisode de 5 min, trois fois, chaque combat étant séparé par 5 min de repos.
    REMARQUE: Pendant que les poissons d’un côté de la chambre se reposent, les pinces crocodiles peuvent être connectées à la paire d’électrodes de l’autre côté de la chambre, et ces poissons supplémentaires stimulés.
  8. Après la stimulation, retirez soigneusement les poissons de chaque puits en les rinçant doucement avec une pipette en plastique et retournez dans l’incubateur dans un milieu pour poissons frais contenant de la tricaïne.
  9. Versez l’eau de tricaïne de l’intérieur de la chambre et utilisez des pinces pour couper et enlever l’agarose de chaque puits. Rincer les puits à l’eau du robinet et laisser sécher.
    REMARQUE: Si vous utilisez des électrodes en fil d’argent, de l’oxyde d’argent peut parfois s’accumuler à la surface du fil après une expérience de stimulation. Comme l’oxyde d’argent est moins conducteur que l’argent, pour maintenir la reproductibilité, frottez soigneusement l’oxyde d’argent du fil à l’aide de Kimwipes avant de réutiliser l’installation.

Résultats

Une mesure rapide et précise du volume du somite
Une méthode de préparation des échantillons, d’acquisition de données et d’analyse volumétrique qui permet de mesurer rapidement la croissance musculaire chez les larves de poisson zèbre est décrite. La taille des muscles peut être mesurée chez les animaux vivants à l’aide de poissons marqués sur leurs membranes plasmiques avec une GFP ciblée par membrane (β-actine: HRAS-EGFP) ou mCherry (α-actine: mCherry-CAAX). L...

Discussion

Nous rapportons ici une méthode pour une estimation précise et efficace du volume musculaire des larves de poisson-zèbre vivants à des stades ou dans des variantes génétiques dans lesquels la pigmentation n’est pas un obstacle majeur à l’imagerie et lorsque l’anesthésie transitoire et / ou l’immobilisation est bien tolérée. Alors que nous avons utilisé la microscopie confocale à balayage laser, les approches décrites sont applicables à la microscopie confocale à disque rotatif ou à feuille de lumi...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Les auteurs sont profondément redevables aux efforts des membres du laboratoire Hughes, les Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin et Vladimir Snetkov pour le développement des protocoles décrits, et à Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau et Peter Currie pour le partage de plasmides ou de lignées de poissons-zèbres. SMH est un scientifique du Conseil de recherches médicales (CRM) avec la subvention de programme G1001029, MR/N021231/1 et MR/W001381/1. MA a été titulaire d’une bourse de doctorat du programme de formation doctorale MRC du King’s College de Londres. Ce travail a bénéficié de l’apport trigonométrique de David M. Robinson, érudit, mentor et ami.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesive, Blu TackBostik--
Aerosol vacuum ---
AgaroseSigma-AldrichA9539-
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heaterCole-ParmerSBH130-
BODIPY FL C5-ceramideThermo ScientificD3521To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires---
Fiji/imageJNational Institutes of Health, NIH--
Fish medium, Fish water--Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium--E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscopeLeicaLeica MZ16FFluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needleWorld Precision Instruments, Inc.1B100-6To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulatorGrass InstrumentsS88Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task WipersKimberly-Clark Professional13258179-
Laser scanning microscope (LSM) ZeissZeiss LSM 5 Exciter
Zeiss LSM 880		LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plateThermo Scientific140675-
Objective, 20×/1.0W water immersionZeiss--
Pasteur Pipette, Graduated 1 mLStarlab GroupE1414-0100-
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mLStarlab GroupE1414-1100-
Petri dish, 60 mmSigma-AldrichP5481-
Plasmid, CMV-CeruleanChristina L. Hammond (University of Bristol)pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAXHenry Roehl (University of Sheffield)-For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used);
synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller Hoefer Scientific InstrumentsPC750-
Soldering iron---
TricaineSigma-AldrichE10521Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
VolocityPerkin Elmer/Quorum Technologies Inc--
Watchmaker forceps, No. 5---
Wire, PlatinumGoodfellowPT005142/120.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, SilverAcros Organics3177300100.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFPDavid M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)-ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAXPeter D. Currrie (ARMI, Monash University)-ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP--ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
ZEN softwareZeiss--

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