Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

Riepilogo

La chiarezza ottica è un grande vantaggio per il lavoro biologico e fisiologico delle cellule nel pesce zebra. Vengono descritti metodi robusti per la misurazione della crescita cellulare nei singoli animali che consentono nuove intuizioni su come la crescita del muscolo scheletrico e dei tessuti vicini sono integrati con la crescita di tutto il corpo.

Abstract

Un certo numero di metodi può essere utilizzato per visualizzare singole cellule in tutto il corpo di zebrafish embrionale, larvale o giovanile vivo. Mostriamo che i pesci vivi con membrane plasmatiche marcate in modo fluorescente possono essere scansionati in un microscopio a scansione laser confocale per determinare il volume del tessuto muscolare e il numero di fibre muscolari presenti. Approcci efficienti per la misurazione del numero e delle dimensioni delle cellule negli animali vivi nel tempo sono descritti e convalidati rispetto a metodi di segmentazione più difficili. Vengono descritti metodi che consentono il controllo dell'attività elettrica muscolare, e quindi contrattile. La perdita dell'attività contrattile del muscolo scheletrico ha ridotto notevolmente la crescita muscolare. Nelle larve viene descritto un protocollo che consente la reintroduzione dell'attività contrattile evocata elettricamente. I metodi descritti minimizzano l'effetto della variabilità interindividuale e permetteranno di analizzare l'effetto di stimoli elettrici, genetici, farmacologici o ambientali su una varietà di parametri di crescita cellulare e fisiologica nel contesto dell'organismo vivente. Il follow-up a lungo termine degli effetti misurati di un intervento definito all'inizio della vita sugli individui può essere successivamente eseguito.

Introduzione

La crescita tissutale regolata, che comprende l'aumento del numero cellulare (iperplasia) e / o delle dimensioni delle cellule (ipertrofia), è un fattore cruciale nello sviluppo, nella rigenerazione e nell'adattamento ecologico ed evolutivo. Nonostante gli enormi progressi nella comprensione genetica molecolare della biologia cellulare e dello sviluppo negli ultimi decenni, la comprensione meccanicistica della regolazione delle dimensioni dei tessuti e degli organi è ancora agli inizi. Una delle ragioni di questa lacuna nella conoscenza è la difficoltà di quantificare la crescita dei tessuti negli organismi viventi con la necessaria precisione spaziale e temporale.

Vari aspetti della crescita di organismi interi possono essere misurati ripetutamente nel tempo, rivelando curve di crescita per ogni individuo 1,2,3,4,5. Metodi di scansione sempre più sofisticati, come la doppia assorbimetria a raggi X (DXA), la tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica (MRI), consentono di tracciare la crescita di interi organi e altre regioni del corpo (ad esempio, singoli muscoli scheletrici identificati) in singoli individui, sia umani che in organismi modello 6,7,8,9,10 . Tuttavia, questi metodi non hanno ancora la risoluzione di rivelare le singole cellule e quindi i legami tra i comportamenti cellulari e la crescita a livello tissutale sono stati difficili da discernere. Per stabilire tali collegamenti, gli studi tradizionali si sono spesso basati su coorti di singoli animali simili, alcuni dei quali vengono sacrificati in punti temporali successivi e quindi analizzati in dettaglio citologico. Tali approcci richiedono la media dei cambiamenti osservati tra gruppi di individui (preferibilmente simili, ma comunque variabili) e quindi soffrono di una mancanza di risoluzione temporale e spaziale, rendendo difficile trovare eventi correlati a livello cellulare indicativi di causa ed effetto.

Studi su organismi modello invertebrati, inizialmente in C. elegans e D. melanogaster, hanno aggirato questi problemi sviluppando la microscopia ottica per ottenere la risoluzione cellulare e misurare con precisione la crescita nel tempo in singoli individui. Tali studi hanno rivelato comportamenti di lignaggio cellulare sorprendentemente invarianti nella crescita di questi piccoli organismi modello 11,12,13,14,15,16,17. Tuttavia, molti animali, compresi tutti i vertebrati, hanno linee cellulari indeterminate e controllano la crescita dei tessuti attraverso misteriosi processi di feedback che servono a trasformare il programma di crescita geneticamente codificato in un organismo tridimensionale funzionale con tutti i suoi tessuti e organi costitutivi adeguatamente abbinati in termini di dimensioni. Per comprendere questi complessi processi di crescita, è auspicabile immaginare interi tessuti o organi nel tempo in singoli individui che possono essere manipolati sperimentalmente da interventi genetici, farmacologici o di altro tipo in un momento di scelta e l'effetto successivamente analizzato.

Ogni muscolo scheletrico vertebrato ha una dimensione, una forma e una funzione definite e interazioni ben caratterizzate con i tessuti adiacenti, come ossa, tendini e nervi. Alcuni muscoli sono piccoli, si trovano appena sotto la pelle e sono quindi buoni candidati per studi di imaging ad alta risoluzione. Simile alla maggior parte degli organi, ogni muscolo cresce durante la vita embrionale, postnatale e giovanile, prima di raggiungere una dimensione adulta stabile. Il muscolo, tuttavia, ha anche una capacità unica di cambiare dimensione durante la vita adulta, a seconda dell'uso e della nutrizione¹⁸, e questa proprietà ha un impatto importante sulla forma fisica dell'organismo, sulle prestazioni sportive e sulla vita indipendente. La perdita di massa muscolare e di funzione in età avanzata, la sarcopenia, è un problema di crescente preoccupazione per le società che affrontano l'invecchiamento della popolazione 19,20,21.

Noi e altri ci siamo concentrati sulla crescita di blocchi definiti di tessuto muscolare scheletrico nel corpo segmentalmente ripetuto delle larve di zebrafish, come un sistema apparentemente chiuso contenente diverse centinaia di cellule in cui la crescita, il mantenimento e la riparazione dei tessuti possono essere osservati e manipolati 22,23,24,25,26. Mentre alcuni lavori quantitativi sono stati precedentemente riportati 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35^, non è disponibile alcun metodo dettagliato e convalidato per misurare la crescita muscolare in dettaglio cellulare nei singoli organismi vertebrati nel tempo. Qui viene descritto un protocollo efficiente su come eseguire tali misurazioni ripetute, insieme alla convalida, e viene fornito un esempio del suo uso per analizzare i cambiamenti nella crescita ipertrofica e iperplastica in risposta all'attività elettrica alterata.

Protocollo

Tutte le ricerche descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e sotto adeguate licenze del Ministero degli Interni del Regno Unito in conformità con l'Animal (Scientific Procedures) Act 1986 e successive modifiche. Gli embrioni/larve devono essere allevati a 28,5 °C fino al completamento della gastrulazione, ma possono poi essere mantenuti a 22-31 °C per controllare il tasso di sviluppo. I pesci possono essere scansionati o stimolati a temperatura ambiente.

1. Anestetizzare le larve di zebrafish

1. Incrociare pesci adulti reporter fluorescenti adatti come Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)^vu119Tg riferimento 36 o Tg(α-actina:mCherry-CAAX)^pc22Tg riferimento³⁷ e raccogliere embrioni come descritto³⁸.
2. Al momento della scelta, ad esempio 2 giorni dopo la fecondazione (dpf), anestetizzare brevemente gli embrioni utilizzando terreno di pesce contenente tricaina (acqua di pesce o mezzo E3) e schermare EGFP o mCherry al microscopio a fluorescenza, come un Leica MZ16F. Se uno ha molti embrioni, seleziona quelli con il segnale più luminoso. Riportare gli embrioni al normale terreno di coltura immediatamente dopo lo screening.

2. Montaggio del pesce per la scansione confocale

1. Accendere il sistema di scansione laser confocale e i laser, per consentire al sistema di stabilizzarsi per 30-60 minuti.
   NOTA: Qui, abbiamo utilizzato un microscopio Zeiss LSM 5 Exciter con supporto verticale (che migliora la distanza di lavoro) dotato di un obiettivo di immersione in acqua 20x/1,0 W.
2. Preparare l'agarosio a basso punto di fusione (LMA) all'1% e conservare in un blocco termico a 37 °C per un uso ripetuto in una provetta da 1,5 ml. Per evitare lo shock termico, rimuovere l'aliquota LMA dal blocco termico e lasciarla raffreddare appena sopra l'impostazione prima di applicare sulla larva, testando contro la propria pelle per giudicare la temperatura appropriata, come quando si valuta la temperatura del latte artificiale.
3. Selezionare il pesce da montare e anestetizzare transitoriamente ogni pesce a turno con Tricaina (0,6 mM in mezzo di pesce).
4. Prendi una capsula di Petri di 60 mm di diametro che è stata rivestita con uno strato di agarosio all'1% e mettila sul palco di un microscopio da dissezione.
5. Trasferire la larva con una pipetta Pasteur di plastica da 1 mL sulla piastra di Petri rivestita da 60 mm e rimuovere il più possibile il mezzo trasferito. Quindi, sempre utilizzando la pipetta Pasteur, posizionare da 5 a 10 gocce di LMA sul pesce e posizionare rapidamente orizzontalmente in vista laterale con una pinza (o un ago di vetro fine lucidato a fuoco) prima che l'LMA si stabilizzi. Per un'imaging ottimale, è preferibile posizionare la larva vicino alla superficie superiore dell'LMA.
   1. In alternativa, utilizzando una pipetta Pasteur in plastica da 1 ml, raccogliere la larva con il minor mezzo di pesce possibile e trasferire la larva nell'aliquota di LMA raffreddato. Lasciare che la larva affondi per 5 secondi per diventare completamente circondata da LMA. Quindi, recuperare la larva e trasferirla in una goccia di LMA sulla capsula di Petri ricoperta di agarosio. Orientare e posizionare rapidamente la larva come descritto sopra.
6. Orientare la larva con entrambi gli assi anteroposteriore e dorsoventrale entro 10° dall'orizzontale (cfr. la nota «Sull'errore e la sua correzione», al punto 4.6).
   1. Se la larva non è montata correttamente orizzontalmente vicino alla superficie della goccia di agarosio, rimuovere e reincorporare. Le larve possono essere facilmente recuperate mediante aspirazione delicata utilizzando una pipetta Pasteur in plastica microfine da 1 mL e LMA può essere rimosso delicatamente utilizzando Kimwipes. La pratica rende davvero perfetti nella procedura di montaggio; Trascorri un pomeriggio incorporando alcune larve poco importanti prima di provare questo in un vero esperimento.
      NOTA: Sulla progettazione del microscopio: molti laboratori utilizzano microscopi confocali invertiti per l'imaging attraverso un vetrino. Abbiamo scoperto che l'incorporazione ripetuta e la rimozione di pesci tenuti in agarosio sotto un coprislip per l'osservazione in un microscopio invertito porta a una maggiore perdita di campioni durante la scansione ripetuta rispetto alla procedura descritta con un microscopio verticale. Per questo motivo, si consiglia l'uso di un sistema verticale, se disponibile. Tuttavia, una chiave per dati di alta qualità è la corretta selezione e l'uso di parametri oggettivi e di scansione, un argomento troppo grande per essere discusso qui.

3. Scansione confocale

1. Quando LMA ha impostato, inondare il piatto con circa 10 ml di terreno di pesce contenente tricaina. Se si prevede di catturare pile confocali, lasciare riposare il pesce montato per almeno 10 minuti prima di procedere alla scansione, poiché si verifica un certo gonfiore dell'agarosio.
2. Caricare il piatto campione sullo stadio del sistema confocale, individuare la larva e concentrarsi sulla somite desiderata. Somite 17 può essere scelto per la sua facilità di localizzazione vicino allo sfiato anale e la facilità di imaging. Controllare contando i somiti anteriorri.
   NOTA: Il primo somite è fuso dietro l'orecchio e non ha bordo anteriore, ma può essere facilmente osservato per avere fibre muscolari striate.
3. Impostare come per catturare una Z-stack definendo la parte superiore (cioè appena sopra la pelle) e quella inferiore (cioè appena sotto la notocorda, in modo da includere l'intero somite, anche se il pesce è montato leggermente inclinato). Entrambi i lati sinistro e destro possono essere catturati come desiderato. Ciò garantirà che tutte le scansioni YZ rapide catturino le regioni desiderate.
4. Acquisire un'immagine XY come segue. Orientare l'area di scansione rispetto al pesce, come consente il software confocale. Posizionare il pesce con l'asse anteroposteriore parallelo all'asse X dell'immagine e l'asse dorsoventrale parallelo all'asse Y con somite 17 al centro del campo come mostrato nel file supplementare 1. Mettere a fuoco un piano di medio livello nel miotomo superiore in cui sono visibili tutte le metà della somite epaxiale e ipassiale insieme ai miosepti verticali e orizzontali e catturare un'immagine XY ad alta risoluzione. Ricordati di assegnare un nome e salvare l'immagine.
5. Acquisire una o più immagini YZ come segue. Nei risultati rappresentativi (sotto) viene confrontata l'accuratezza dei metodi a 2 e 4 sezioni. Nell'approccio a 2 sezioni, vengono impiegate singole scansioni XY e YZ . Nell'approccio a 4 fette, vengono mediate tre scansioni YZ per fornire una stima più accurata del volume del miotomo. Se richiesto dal software confocale, riorientare il campo di scansione.
   1. Disegna una linea da dorsale a ventrale precisa attraverso la somite scelta perpendicolarmente all'asse anteroposteriore del pesce in una posizione anteroposteriore selezionata. Eseguire una scansione della linea Z-stack.
   2. Ripetere la scansione della linea YZ tre volte in posizioni anteroposteriori definite lungo il miotomo selezionato per catturare YZa, YZm e YZp. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2A. Assegna un nome e salva queste immagini insieme all'immagine XY correlata.
      NOTA: Sulla selezione dei piani YZ: il miotomo è a forma di V e la sua forma cambia durante la crescita. Per ottenere la valutazione più accurata del volume del miotomo 17 con il metodo a 4 fette, posizionare YZa sulla punta anteriore del miotomo, YZp sulle punte posteriori del miotomo agli estremi dorsali e ventrali e YZm a metà strada tra YZa e YZp. Supponendo che il somite si assottigli uniformemente, la media delle misurazioni di ciascuna sezione YZ rappresenterà il miotomo nel suo insieme. Per il metodo a 2 fette, la singola scansione YZ deve essere posizionata all'estremità posteriore del miosetto orizzontale, che corrisponde approssimativamente al centro anteroposteriore del miotomo di interesse (come YZm). In alternativa, una serie di tre sezioni YZ può essere presa anteriormente, al centro e nella parte posteriore del miosetto orizzontale ma, come mostrato di seguito, tale misurazione sovrastima o sottostima leggermente il volume del miotomo (per i somiti rostrali e caudali, rispettivamente, a causa della riduzione del miotomo). Fondamentalmente, la coerenza nel posizionamento dei piani di fette YZ tra pesci ed esperimenti è la chiave per la riproducibilità.

4. Analisi

1. Poiché il miotomo cambia dimensione lungo il pesce in modo graduale, lavora sempre con lo stesso somite negli studi comparativi.
2. Per misurare e calcolare il volume del miotomo, utilizzare il software confocale (come i file .lsm creati utilizzando il software per microscopi Zeiss ZEN) o il software di analisi universale delle immagini open source, come Fiji/ImageJ.
   NOTA: se si modificano i formati di file, assicurarsi che la dimensione Z-step sia trasferita correttamente, poiché non tutti i software sono in grado di leggere correttamente i formati di file confocali proprietari. Ad esempio, per importare un'immagine di scansione lineare ZEN nelle Figi, utilizzare innanzitutto il comando File/Esporta per esportare .tif nella finestra Immagine ad alta risoluzione - formato piano singolo, quindi importarla nelle Figi. Sebbene YZ scan.lsm possa essere aperto direttamente nelle Figi, le immagini YZ risultanti sono generalmente compresse nella dimensione Z a causa di una valutazione errata della dimensione del passo Z.
3. Analisi con ZEN
   1. Innanzitutto, apri i file XY scan.lsm in ZEN. Vai alla scheda Grafica e seleziona lo strumento Linea. Tracciare una linea tra i due miosetti verticali di somite 17 che copre l'intera lunghezza del miotomo (parallela all'asse anteroposteriore del pesce). Selezionare la casella M per visualizzare i valori della misurazione (Lunghezza = 89,71 μm, vedere File supplementare 2).
   2. Aprire i file YZ scan.lsm. Nella scheda Grafica , selezionate lo strumento Bezier chiuso . Disegna attorno al perimetro del miotomo. Una volta completato, selezionare la casella M, questo rivelerà il valore della misurazione (Area = 11980.01 μm², vedi File supplementare 3).
   3. Registrare manualmente i valori di ogni misurazione in un foglio di calcolo. Calcolare la media delle misurazioni CSA come richiesto. Il volume del miotomo può essere calcolato come Volume = Lunghezza del miotomo x CSA, cioè 89,71 μm x 11980,01 μm² = 1,075 x 10⁶ μm³.
4. Analisi con Fiji/ImageJ
   1. Aprire i file XY scan.lsm in Fiji/ImageJ. Controlla se le immagini XY aperte direttamente nelle Figi sono calibrate correttamente in scala, come dovrebbero essere.
   2. Selezionate lo strumento linea retta dalle icone. Tracciare una linea lungo la lunghezza della somite 17 come descritto al punto 4.3.1. Impostare i parametri di misurazione andando su Analizza, quindi selezionare Imposta misure..., e selezionare le seguenti caselle Area e Visualizza etichetta. Per misurare, è sufficiente premere il tasto di scelta rapida M, oppure andare al menu Analizza e selezionare Misura. Una finestra pop-up risultante elenca tutti i valori di misurazione (ad esempio, Lunghezza = 90,023 μm; vedere File supplementare 4). I risultati possono essere salvati sotto forma di .csv e aperti in Microsoft Excel o simili per analisi successive.
   3. Per misurare CSA sulle immagini YZ, aprire le immagini YZ in .tif formato come descritto nel passaggio 4.2.
   4. Calibrare le immagini .tif YZ poiché non sono calibrate quando vengono esportate. I parametri per la calibrazione possono essere ottenuti in ZEN andando alle Info delle immagini selezionate: registrare i valori di Scaling X (0.489 μm) e Scaling Z (0.890 μm; vedi Supplemental File 5). Successivamente, mentre le immagini sono aperte nelle Fiji, vai su Immagine e seleziona Proprietà .... Immettere 0,489 μm per la larghezza e l'altezza dei pixel e 0,890 μm per la profondità del voxel. Selezionare la casella Globale per applicare la calibrazione universalmente se è prevista una misurazione ripetuta delle immagini YZ (vedere File supplementare 6).
      NOTA: assicurarsi che tutte le immagini YZ vengano acquisite utilizzando gli stessi parametri di scansione; riavviare Fiji/ImageJ o modificare i valori di calibrazione se è necessario un nuovo set di calibrazione.
   5. Per misurare il CSA delle immagini YZ calibrate, selezionate lo strumento Selezioni poligonali dalle icone. Disegnare attorno al perimetro del somite, e premere M per rivelare i valori della misurazione (Area = 11980,395 μm²; vedere File supplementare 7). Il volume del miotomo può essere calcolato come Volume = Lunghezza del miotomo x CSA, cioè 90,023 μm x 11980,395 μm² = 1,079 x 10⁶ μm³.
   6. Ripetere le misurazioni sulle altre immagini XY e YZ. Si consiglia di utilizzare lo stesso software per tutte le misurazioni all'interno di una serie sperimentale per coerenza. La stima del volume di ciascun software è simile ma non identica a causa degli strumenti di disegno distinti, cioè ZEN = 1,074 × 10 6 μm 3 e Fiji / ImageJ = 1,079 × 10⁶ μm³. La crescita del miotomo tra due punti temporali (cioè da 3 a 4 dpf) può essere calcolata come: (Volume 4 dpf - Volume 3 _dpf)/ Volume _{3 dpf} × 100%.
      NOTA: Sull'errore e la sua correzione. Durante il montaggio, il pesce deve essere orientato con il suo piano sagittale (cioè gli assi anteroposteriore e dorsoventrale) il più vicino possibile all'orizzontale, per evitare rispettivamente l'imbardata e il rotolamento. Questo perché sia la lunghezza del miotomo L misurata dalla scansione XY che il CSA misurato da una scansione YZ saranno sovrastimati se il pesce mostra imbardata (rotazione attorno all'asse dorsoventrale) a causa del montaggio anteroposteriore obliquo. Né il beccheggio né il rollio durante il montaggio devono influire sulle misurazioni dopo la scansione, come descritto nella sezione 3. Tuttavia, la rotazione dorsoventrale (rollio) degrada la qualità dell'immagine. La trigonometria semplice mostra che fino a 10° di imbardata daranno un errore del 3% nella misurazione del volume, poiché misurati L e CSA aumentano ciascuno in proporzione a (cosq)^-1, dove q è l'angolo di distanza dall'orizzontale anteroposteriore (imbardata). 15° e 20° di sconto daranno rispettivamente il 7% e il 13% di sovrastima del volume.
      Poiché la notocorda è cilindrica, l'inclusione dell'intera notocorda nella scansione YZ può essere utilizzata per calcolare l'angolo e l'estensione dell'obliquità dall'orientamento e dalla grandezza degli assi maggiore e minore e quindi correggere L e CSA misurati per massimizzare la precisione. CSA corretto = CSA misurato x asse minore Notocorda/asse maggiore Notocorda. L corretto = Misurato L x asse minore della notocorda/asse della notocorda nella direzione Z del microscopio.
      Un'ulteriore considerazione consente un'ulteriore correzione di L. Man mano che il miotomo cresce, si inclina nel piano coronale (normale all'asse dorsoventrale) in modo tale che il miotomo mediale sia leggermente anteriore al miotomo laterale. Visti dalla dorsale, i miosepti verticali sui lati sinistro e destro formano un ampio chevron rivolto anteriormente. Se l'imbardata è bassa, questa morfologia non influisce sulla misurazione di L. Ma se l'imbardata è significativa, la correzione trigonometrica diventa difficile e un approccio migliore è misurare direttamente True L stimando le coordinate XYZ dei due punti in cui il miosepta verticale anteriore e posteriore incontrano la notocorda al miosetto orizzontale. La trigonometria semplice permette di calcolare True L da queste coordinate come L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)²]. I punti deboli di quest'ultimo approccio sono che a) la selezione dei punti può variare con l'operatore e b) non viene conservata alcuna registrazione visiva dei punti scelti. Questa considerazione non influisce sulla correzione CSA.

5. Metodo opzionale: rimuovere e reintrodurre l'attività elettrica muscolare

1. Creare una camera di stimolazione.
   1. Prendi una piastra del pozzo di 6 x 35 mm, crea due piccole aperture (<5 mm di diametro, distanti 1 cm) su ciascun lato di ciascun pozzetto (vedi Figura 1) usando un saldatore stretto.
      NOTA: Maneggiare il saldatore caldo con cura e lavorare in una cappa aspirante se lo si desidera per evitare l'inalazione di vapore.
   2. Infilare una coppia di fili d'argento o di platino (lunghi ~ 20 cm) attraverso le aperture di ciascun pozzetto (vedi Figura 1). Il materiale adesivo riutilizzabile (ad esempio, BluTack) può essere applicato vicino alle aperture per mantenere i fili in posizione e garantire una separazione di 1 cm tra i fili (vedere Figura 1).
2. A 3 dpf, dividere il pesce in tre condizioni: pesce medio Controllo, Inattivo e Inattivo + Stim.
   1. Per i gruppi Inattivi e Inattivi+Stim, anestetizzare le larve a 72 ore dopo la fecondazione (hpf) con Tricaina (0,6 mM).
      NOTA: Seguendo il riferimento³⁸, aliquote congelate di brodo di tricaina vengono scongelate e diluite (40 μL/mL di terreno di pesce, fino ad una concentrazione finale di 0,6 mM) prima di essere aggiunte al pesce. Non aggiungere tricaina direttamente nell'acqua contenente pesce, poiché alcuni pesci potrebbero ricevere dosi elevate. Le scorte di tricaina devono essere utilizzate entro un mese e non essere mai ricongelate.
   2. Per il pesce medio Controllo pesce, lasciarli non anestetizzati.
3. In determinati momenti dopo l'inizio dell'esposizione alla tricaina (cioè a 80 hpf), preparare il gruppo Inactive+Stim per la stimolazione.
   1. Preparare 60 ml di agarosio al 2% (1,2 g di polvere di agarosio in 60 ml di terreno di pesce) e sciogliere completamente con il microonde, raffreddare, aggiungere tricaina e versare 4 ml in ciascun pozzetto della camera di stimolazione (Figura 1).
   2. Aggiungere immediatamente pettini a 4 pozzetti su misura tra gli elettrodi (creati tagliando la plastica (ad esempio, polipropilene) delle dimensioni desiderate e incollandoli insieme usando Superglue; vedere Figura 1). Lasciare 10 minuti per impostare il gel. Rimuovere accuratamente i pettini per creare quattro pozzetti rettangolari.
   3. Riempire ogni pozzetto con acqua tricaina e posizionare una singola larva Inactive+Stim anestetizzata in ciascun pozzetto usando una micropipetta, con il loro asse anteroposteriore perpendicolare agli elettrodi (vedi Figura 1).
   4. Controllare sotto il microscopio fluorescente da dissezione se ogni pesce è completamente anestetizzato all'interno di ciascun pozzetto della camera.
4. Collegare uno stimolatore elettrofisiologico regolabile alla camera tramite un controller di polarità, utilizzando clip a coccodrillo collegate a ciascuno degli elettrodi su un lato della camera (vedere Figura 1).
   NOTA: Il regolatore di polarità viene utilizzato per invertire la polarità ogni 5 s, in modo da prevenire l'elettrolisi e la corrosione degli elettrodi.
5. Stimolare il pesce. Ad esempio, 1s con un treno di impulsi di 200, 20 V, con durata dell'impulso di 0,5 ms e separazione dell'impulso di 4,5 ms, una volta ogni 5 s fornisce un efficace regime di resistenza alla contrazione tetanica ripetuta.
6. Controllare regolarmente al microscopio per confermare che i pesci vengono stimolati; Lo stimolo elettrico di esempio dovrebbe indurre una contrazione bilaterale visibile e un leggero movimento, una volta ogni 5 s.
7. Per un regime di resistenza/forza elevata, stimolare il pesce ad alta frequenza per un attacco di 5 minuti, tre volte, con ogni incontro separato da 5 minuti di riposo.
   NOTA: Mentre i pesci su un lato della camera sono a riposo, le clip di coccodrillo possono essere collegate alla coppia di elettrodi sull'altro lato della camera e quei pesci aggiuntivi stimolati.
8. Dopo la stimolazione, rimuovere con cura i pesci da ciascun pozzetto sciacquandoli delicatamente con una pipetta di plastica e restituirli all'incubatrice in mezzo di pesce fresco contenente tricaina.
9. Versare via l'acqua tricaina dall'interno della camera e usare una pinza per tagliare e rimuovere l'agarosio da ciascun pozzetto. Risciacquare i pozzetti con acqua di rubinetto e lasciare asciugare.
   NOTA: Se si utilizzano elettrodi a filo d'argento, occasionalmente l'ossido d'argento può accumularsi sulla superficie del filo dopo un esperimento di stimolazione. Poiché l'ossido d'argento è meno conduttivo dell'argento, per mantenere la riproducibilità, strofinare accuratamente l'ossido d'argento dal filo usando Kimwipes prima di riutilizzare la configurazione.

Risultati

Una misura rapida e precisa del volume di somite
Viene descritto un metodo di preparazione del campione, acquisizione dei dati e analisi volumetrica che consente la rapida misurazione della crescita muscolare nelle larve di zebrafish. La dimensione muscolare può essere misurata negli animali vivi utilizzando pesci marcati sulle loro membrane plasmatiche con una GFP mirata alla membrana (β-actina: HRAS-EGFP) o mCherry (α-actina: mCherry-CAAX). Le larve sono state anestetizzate tran...

Discussione

Qui riportiamo un metodo per la stima accurata ed efficiente del volume muscolare delle larve vive di zebrafish in stadi o in varianti genetiche in cui la pigmentazione non è un grosso ostacolo all'imaging e quando l'anestesia transitoria e / o l'immobilizzazione sono ben tollerate. Mentre abbiamo impiegato la microscopia confocale a scansione laser, gli approcci descritti sono applicabili alla microscopia confocale a disco rotante o a foglio luminoso e a qualsiasi altro metodo che crea pile di immagini su piani focali ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive, Blu Tack	Bostik	-	-
Aerosol vacuum	-	-	-
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	-
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414	Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heater	Cole-Parmer	SBH130	-
BODIPY FL C5-ceramide	Thermo Scientific	D3521	To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires	-	-	-
Fiji/imageJ	National Institutes of Health, NIH	-	-
Fish medium, Fish water	-	-	Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium	-	-	E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscope	Leica	Leica MZ16F	Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needle	World Precision Instruments, Inc.	1B100-6	To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulator	Grass Instruments	S88	Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	13258179	-
Laser scanning microscope (LSM)	Zeiss	Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880	LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate	Thermo Scientific	140675	-
Objective, 20×/1.0W water immersion	Zeiss	-	-
Pasteur Pipette, Graduated 1 mL	Starlab Group	E1414-0100	-
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL	Starlab Group	E1414-1100	-
Petri dish, 60 mm	Sigma-Aldrich	P5481	-
Plasmid, CMV-Cerulean	Christina L. Hammond (University of Bristol)		pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAX	Henry Roehl (University of Sheffield)	-	For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller	Hoefer Scientific Instruments	PC750	-
Soldering iron	-	-	-
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521	Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
Volocity	Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc	-	-
Watchmaker forceps, No. 5	-	-	-
Wire, Platinum	Goodfellow	PT005142/12	0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, Silver	Acros Organics	317730010	0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFP	David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)	-	ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX	Peter D. Currrie (ARMI, Monash University)	-	ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP	-	-	ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
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