Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

Riepilogo

La chiarezza ottica è un grande vantaggio per il lavoro biologico e fisiologico delle cellule nel pesce zebra. Vengono descritti metodi robusti per la misurazione della crescita cellulare nei singoli animali che consentono nuove intuizioni su come la crescita del muscolo scheletrico e dei tessuti vicini sono integrati con la crescita di tutto il corpo.

Abstract

Un certo numero di metodi può essere utilizzato per visualizzare singole cellule in tutto il corpo di zebrafish embrionale, larvale o giovanile vivo. Mostriamo che i pesci vivi con membrane plasmatiche marcate in modo fluorescente possono essere scansionati in un microscopio a scansione laser confocale per determinare il volume del tessuto muscolare e il numero di fibre muscolari presenti. Approcci efficienti per la misurazione del numero e delle dimensioni delle cellule negli animali vivi nel tempo sono descritti e convalidati rispetto a metodi di segmentazione più difficili. Vengono descritti metodi che consentono il controllo dell'attività elettrica muscolare, e quindi contrattile. La perdita dell'attività contrattile del muscolo scheletrico ha ridotto notevolmente la crescita muscolare. Nelle larve viene descritto un protocollo che consente la reintroduzione dell'attività contrattile evocata elettricamente. I metodi descritti minimizzano l'effetto della variabilità interindividuale e permetteranno di analizzare l'effetto di stimoli elettrici, genetici, farmacologici o ambientali su una varietà di parametri di crescita cellulare e fisiologica nel contesto dell'organismo vivente. Il follow-up a lungo termine degli effetti misurati di un intervento definito all'inizio della vita sugli individui può essere successivamente eseguito.

Introduzione

La crescita tissutale regolata, che comprende l'aumento del numero cellulare (iperplasia) e / o delle dimensioni delle cellule (ipertrofia), è un fattore cruciale nello sviluppo, nella rigenerazione e nell'adattamento ecologico ed evolutivo. Nonostante gli enormi progressi nella comprensione genetica molecolare della biologia cellulare e dello sviluppo negli ultimi decenni, la comprensione meccanicistica della regolazione delle dimensioni dei tessuti e degli organi è ancora agli inizi. Una delle ragioni di questa lacuna nella conoscenza è la difficoltà di quantificare la crescita dei tessuti negli organismi viventi con la necessaria precisione spaziale e temporale.

Protocollo

Tutte le ricerche descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e sotto adeguate licenze del Ministero degli Interni del Regno Unito in conformità con l'Animal (Scientific Procedures) Act 1986 e successive modifiche. Gli embrioni/larve devono essere allevati a 28,5 °C fino al completamento della gastrulazione, ma possono poi essere mantenuti a 22-31 °C per controllare il tasso di sviluppo. I pesci possono essere scansionati o stimolati a temperatura ambiente.

1. Anestetizzare le larve di zebrafish

1. Incrociare pesci adulti reporter fluorescenti adatti come Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP....

Risultati

Una misura rapida e precisa del volume di somite
Viene descritto un metodo di preparazione del campione, acquisizione dei dati e analisi volumetrica che consente la rapida misurazione della crescita muscolare nelle larve di zebrafish. La dimensione muscolare può essere misurata negli animali vivi utilizzando pesci marcati sulle loro membrane plasmatiche con una GFP mirata alla membrana (β-actina: HRAS-EGFP) o mCherry (α-actina: mCherry-CAAX). Le larve sono state anestetizzate tran.......

Discussione

Qui riportiamo un metodo per la stima accurata ed efficiente del volume muscolare delle larve vive di zebrafish in stadi o in varianti genetiche in cui la pigmentazione non è un grosso ostacolo all'imaging e quando l'anestesia transitoria e / o l'immobilizzazione sono ben tollerate. Mentre abbiamo impiegato la microscopia confocale a scansione laser, gli approcci descritti sono applicabili alla microscopia confocale a disco rotante o a foglio luminoso e a qualsiasi altro metodo che crea pile di immagini su piani focali .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive, Blu Tack	Bostik	-	-
Aerosol vacuum	-	-	-
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	-
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414	Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heater	Cole-Parmer	SBH130	-
BODIPY FL C5-ceramide	Thermo Scientific	D3521	To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires	-	-	-
Fiji/imageJ	National Institutes of Health, NIH	-	-
Fish medium, Fish water	-	-	Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium	-	-	E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscope	Leica	Leica MZ16F	Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needle	World Precision Instruments, Inc.	1B100-6	To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulator	Grass Instruments	S88	Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	13258179	-
Laser scanning microscope (LSM)	Zeiss	Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880	LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate	Thermo Scientific	140675	-
Objective, 20×/1.0W water immersion	Zeiss	-	-
Pasteur Pipette, Graduated 1 mL	Starlab Group	E1414-0100	-
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL	Starlab Group	E1414-1100	-
Petri dish, 60 mm	Sigma-Aldrich	P5481	-
Plasmid, CMV-Cerulean	Christina L. Hammond (University of Bristol)		pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAX	Henry Roehl (University of Sheffield)	-	For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller	Hoefer Scientific Instruments	PC750	-
Soldering iron	-	-	-
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521	Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
Volocity	Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc	-	-
Watchmaker forceps, No. 5	-	-	-
Wire, Platinum	Goodfellow	PT005142/12	0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, Silver	Acros Organics	317730010	0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFP	David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)	-	ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX	Peter D. Currrie (ARMI, Monash University)	-	ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP	-	-	ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
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