JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בהירות אופטית היא יתרון משמעותי לעבודה הביולוגית והפיזיולוגית של התא בדגי זברה. מתוארות שיטות חזקות למדידת צמיחת תאים בבעלי חיים בודדים המאפשרות תובנות חדשות על האופן שבו צמיחת שרירי השלד והרקמות השכנות משולבת עם צמיחת כל הגוף.

Abstract

ניתן להשתמש במספר שיטות כדי לדמיין תאים בודדים בכל הגוף של דגי זברה עובריים, זחליים או צעירים. אנו מראים כי דגים חיים עם קרומי פלזמה המסומנים בפלואורסצנטיות יכולים להיסרק במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי על מנת לקבוע את נפח רקמת השריר ואת מספר סיבי השריר הקיימים. גישות יעילות למדידת מספר וגודל התאים בבעלי חיים חיים לאורך זמן מתוארות ומאומתות מול שיטות סגמנטציה מפרכות יותר. מתוארות שיטות המאפשרות שליטה על פעילות חשמלית השרירים, ובכך התכווצות. אובדן פעילות התכווצות שרירי השלד הפחית מאוד את צמיחת השרירים. בזחלים, מתואר פרוטוקול המאפשר הכנסה מחדש של פעילות התכווצות חשמלית מעוררת. השיטות המתוארות ממזערות את השפעת השונות הבין-אישית ויאפשרו ניתוח של השפעת גירויים חשמליים, גנטיים, תרופתיים או סביבתיים על מגוון פרמטרים של גדילה תאית ופיזיולוגית בהקשר של האורגניזם החי. לאחר מכן ניתן לבצע מעקב ארוך טווח אחר ההשפעות הנמדדות של התערבות מוגדרת בתחילת החיים על אנשים.

Introduction

צמיחת רקמות מוסדרת, הכוללת גידול במספר התאים (היפרפלזיה) ו/או בגודל התא (היפרטרופיה), היא גורם מכריע בהתפתחות, התחדשות והסתגלות אקולוגית ואבולוציונית. למרות ההתקדמות העצומה בהבנה הגנטית המולקולרית של ביולוגיה תאית והתפתחותית בעשורים האחרונים, ההבנה המכניסטית של ויסות גודל הרקמות והאיברים עדיין בחיתוליה. אחת הסיבות ללקונה זו בידע היא הקושי לכמת צמיחת רקמות באורגניזמים חיים בדיוק המרחבי והזמני הדרוש.

היבטים שונים של גדילה של אורגניזמים שלמים ניתנים למדידה חוזרת ונשנית לאורך זמן, וחושפים עקומות גדילה עבור כלאדם 1,2,3,4,5. שיטות סריקה מתוחכמות יותר ויותר, כגון אבסורפטיומטריה של קרני רנטגן כפולות (DXA), טומוגרפיה ממוחשבת (CT) והדמיית תהודה מגנטית (MRI), מאפשרות מעקב אחר צמיחה של איברים שלמים ואזורי גוף אחרים (לדוגמה, שרירי שלד שזוהו על ידי יחידים) אצל אנשים בודדים, הן בבני אדם והן באורגניזמים מודל 6,7,8,9,10 . עם זאת, לשיטות אלה עדיין אין את הרזולוציה לחשוף תאים בודדים ולכן קשה היה להבחין בקשרים בין התנהגויות תאיות לצמיחה ברמת הרקמה. כדי ליצור קשרים כאלה, מחקרים מסורתיים הסתמכו לעתים קרובות על קבוצות של בעלי חיים בודדים דומים, שכמה מהם מוקרבים בנקודות זמן עוקבות ולאחר מכן מנותחים בפירוט ציטולוגי. גישות כאלה דורשות ממוצע של השינויים הנצפים בין קבוצות של פרטים (רצוי דומים, אך בכל זאת משתנים) ולכן סובלות מהיעדר רזולוציה טמפורלית ומרחבית, מה שמקשה על מציאת אירועים מתואמים ברמה התאית המרמזים על סיבה ותוצאה.

מחקרים על אורגניזמים מודל חסרי חוליות, בתחילה ב- C. elegans ו- D. melanogaster, עקפו את הבעיות הללו על ידי פיתוח מיקרוסקופיה אופטית כדי להשיג רזולוציה תאית ולמדוד במדויק צמיחה לאורך זמן אצל פרטים בודדים. מחקרים כאלה חשפו התנהגויות של שושלת תאים אינווריאנטית להפליא בגדילתם של אורגניזמי מודל קטנים אלה 11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, לבעלי חיים רבים, כולל כל בעלי החוליות, יש שושלות תאים לא מוגדרות, והם שולטים בצמיחת רקמות על ידי תהליכי משוב מסתוריים המשמשים להפיכת תוכנית הגדילה המקודדת גנטית לאורגניזם תלת-ממדי פונקציונלי שכל הרקמות והאיברים המרכיבים אותו תואמים את גודלו. כדי להבין את תהליכי הצמיחה המורכבים האלה, רצוי לדמיין רקמות שלמות או איברים לאורך זמן אצל אנשים בודדים שניתן לתמרן אותם בניסוי על ידי התערבויות גנטיות, פרמקולוגיות או אחרות בזמן בחירה וההשפעה נותחה לאחר מכן.

לכל שרירי שלד בעלי חוליות יש גודל, צורה ותפקוד מוגדרים, ואינטראקציות מאופיינות היטב עם רקמות סמוכות, כגון עצם, גיד ועצבים. חלק מהשרירים קטנים, שוכבים ממש מתחת לעור ולכן הם מועמדים טובים למחקרי הדמיה ברזולוציה גבוהה. בדומה לרוב האיברים, כל שריר גדל במהלך החיים העובריים, לאחר הלידה והנעורים, לפני שהוא מגיע לגודל בוגר יציב. לשריר, לעומת זאת, יש גם יכולת ייחודית לשנות גודל במהלך החיים הבוגרים, תלוי בשימוש ובתזונה18, ולתכונה זו יש השפעה רבה על הכושר האורגניזמי, הביצועים הספורטיביים והחיים העצמאיים. אובדן מסת שריר ותפקוד בגיל מבוגר, סרקופניה, הוא נושא של דאגה גוברת עבור חברות המתמודדות עם אוכלוסייה מזדקנת 19,20,21.

אנחנו ואחרים התמקדנו בצמיחה של בלוקים מוגדרים של רקמת שריר השלד בגוף החוזר על עצמו באופן סגמנטלי של זחלי דגי זברה, כמערכת סגורה לכאורה המכילה כמה מאות תאים שבהם ניתן לצפות בצמיחה, תחזוקה ותיקון של רקמות ולתפעל אותן 22,23,24,25,26. בעוד שעבודה כמותית מסוימת דווחה בעבר 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, אין שיטה מפורטת ומאומתת למדידת צמיחת שרירים בפרטים תאיים באורגניזמים בעלי חוליות בודדים לאורך זמן. כאן מתואר פרוטוקול יעיל כיצד לבצע מדידות חוזרות כאלה, יחד עם אימות, ודוגמה לשימוש בו לניתוח שינויים בצמיחה היפרטרופית והיפרפלסטית בתגובה לפעילות חשמלית שהשתנתה.

Protocol

כל המחקרים המתוארים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות ותחת רישיונות מתאימים ממשרד הפנים הבריטי בהתאם לחוק בעלי החיים (נהלים מדעיים) 1986 והשינויים שבאו בעקבותיו. יש לגדל עוברים/זחלים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד להשלמת הקיבה, אך לאחר מכן ניתן לשמור אותם בטמפרטורה של 22-31 מעלות צלזיוס כדי לשלוט בקצב ההתפתחות. ניתן לסרוק או לעורר דגים בטמפרטורת החדר.

1. הרדמת זחלי דגי זברה

  1. לחצות כתב פלואורסצנטי מתאים דגים בוגרים כגון Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg הפניה 36 או Tg(α-actin:mCherry-CAAX)pc22Tg הפניה37 ולאסוף עוברים כמתואר38.
  2. בעת הבחירה, כגון יומיים לאחר ההפריה (dpf), מרדימים עוברים לזמן קצר באמצעות מדיום דגים המכיל טריקאין (מי דגים או מדיום E3), ומסננים EGFP או mCherry תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כגון Leica MZ16F. אם לאחד מהם יש עוברים רבים, בחר את אלה עם האות הבהיר ביותר. החזרת עוברים למדיום דגים רגיל מיד לאחר ההקרנה.

2. הרכבת דגים לסריקה קונפוקלית

  1. הפעל את מערכת סריקת הלייזר הקונפוקלית והלייזרים, כדי לאפשר למערכת להתייצב למשך 30-60 דקות.
    הערה: כאן, השתמשנו במיקרוסקופ Zeiss LSM 5 Exciter עם מעמד חומרים זקוף (המשפר את מרחק העבודה) המצויד במטרה לטבול במים של 20x/1.0 W.
  2. הכינו 1% אגרוז נמס נמוך (LMA) ושמרו בבלוק חום של 37 מעלות צלזיוס לשימוש חוזר בצינור של 1.5 מ"ל. כדי למנוע זעזוע חום, הסירו את ה-LMA aliquot מגוש החום ותנו לו להתקרר בדיוק מעל לפני שאתם מורחים על הזחל, תוך בדיקה נגד העור כדי לשפוט את הטמפרטורה המתאימה, כמו בעת הערכת הטמפרטורה של חלב פורמולה לתינוקות.
  3. בחר דגים להרכבה והרדמה ארעית של כל דג בתורו עם טריקאין (0.6 מ"מ במדיום דגים).
  4. לוקחים צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ שמצופה בשכבה של 1% אגרוז ומניחים על הבמה של מיקרוסקופ גזירה.
  5. מעבירים את הזחל עם פיפטה פסטר מפלסטיק 1 מ"ל על צלחת פטרי מצופה 60 מ"מ ומסירים כמה שיותר מדיום מועבר. לאחר מכן, עדיין באמצעות פיפטה פסטר, הניחו 5 עד 10 טיפות של LMA על הדג והתמקמו במהירות אופקית במבט רוחבי עם מלקחיים (או מחט זכוכית עדינה מלוטשת באש) לפני שה-LMA מתייצב. להדמיה אופטימלית, רצוי למקם את הזחל קרוב לפני השטח העליונים של ה-LMA.
    1. לחלופין, באמצעות פיפטה פסטר פלסטית של 1 מ"ל, לאסוף את הזחל עם כמה שפחות מדיום דגים, ולהעביר את הזחל לתוך aliquot של LMA מקורר. אפשרו לזחל לשקוע במשך 5 שניות כדי להיות מוקף לחלוטין ב-LMA. לאחר מכן, שלפו את הזחל והעבירו אותו בטיפה של LMA על צלחת הפטרי המצופה באגרוז. התמצאות מהירה ומיקום הזחל כמתואר לעיל.
  6. כוון את הזחל עם שני הצירים האנטרופוסטריים והדורסובנטרליים שלו בטווח של 10° מהאופקי (ראה הערה 'על טעות ותיקונה', בנקודה 4.6 להלן).
    1. אם הזחל אינו מותקן כראוי אופקית ליד פני השטח של טיפת agarose, להסיר ולהטביע מחדש. ניתן לשלוף זחלים בקלות על ידי שאיבה עדינה באמצעות פיפטה פלסטיק פסטר בגודל 1 מ"ל, וניתן להסיר את LMA בעדינות באמצעות Kimwipes. תרגול באמת עושה מושלם בהליך ההרכבה; לבלות אחר הצהריים הטמעת כמה זחלים לא חשובים לפני שתנסה את זה על ניסוי אמיתי.
      הערה: על תכנון מיקרוסקופ: מעבדות רבות משתמשות במיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים להדמיה דרך כיסוי. מצאנו כי הטבעה והסרה חוזרות ונשנות של דגים המוחזקים באגרוז תחת כיסוי לתצפית במיקרוסקופ הפוך מובילה לאובדן גדול יותר של דגימות במהלך סריקה חוזרת ונשנית מאשר בהליך המתואר במיקרוסקופ זקוף. מסיבה זו, מומלץ להשתמש במערכת זקופה, אם קיימת. עם זאת, המפתח לנתונים איכותיים הוא בחירה נכונה ושימוש בפרמטרים אובייקטיביים וסריקה, נושא גדול מדי לדיון כאן.

3. סריקה קונפוקלית

  1. כאשר LMA התייצבה, הציפו את המנה בכ-10 מ"ל של דגים המכילים טריקאין. אם אתם מתכננים ללכוד ערימות קונפוקליות, תנו לדגים הרכובים לנוח לפחות 10 דקות לפני שתמשיכו לסריקה, מכיוון שמתרחשת נפיחות אגרוז.
  2. טוענים את צלחת הדגימה לשלב של המערכת הקונפוקלית, מאתרים את הזחל ומתמקדים בסומיט הרצוי. ניתן לבחור בסומיט 17 בגלל קלות הלוקליזציה שלו ליד פתח האוורור האנאלי וקלות ההדמיה. בדוק על ידי ספירת סומיטים מקדימה.
    הערה: הסומיט הראשון מתמזג מאחורי האוזן ואין לו גבול קדמי, אך ניתן לראות אותו בקלות כבעל סיבי שריר מפושטים.
  3. הגדר כאילו כדי ללכוד ערימת Z על ידי הגדרת החלק העליון (כלומר, ממש מעל העור) והתחתון (כלומר, ממש מתחת לנוטוקורד, כך שיכלול את כל הסומיט, גם אם הדג מותקן מעט מוטה). ניתן ללכוד גם צד שמאל וגם צד ימין לפי הצורך. זה יבטיח שכל סריקות YZ המהירות לוכדות את האזורים הרצויים.
  4. צלם תמונת XY באופן הבא. כוון את אזור הסריקה ביחס לדגים, כפי שמאפשרת התוכנה הקונפוקלית. מקם את הדג עם ציר האנטרופוסטריור במקביל לציר X המצולם והציר הגבי במקביל לציר Y עם סומיט 17 במרכז השדה כפי שמוצג בקובץ משלים 1. התמקדו במישור ברמה בינונית במיוטום העליון שבו כל חצאי הסומיט האפאקסיאליים וההיפאקסיאליים יחד עם המיוספטה האנכית והאופקית נראים לעין ולוכדים תמונת XY ברזולוציה גבוהה. זכור לתת שם ולשמור את התמונה.
  5. צלם תמונה אחת או יותר של YZ באופן הבא. בתוצאות המייצגות (להלן) משווים את הדיוק של שיטות של 2 פרוסות ו- 4 פרוסות. בגישת 2 פרוסות, נעשה שימוש בסריקות XY ו- YZ בודדות. בגישת 4 פרוסות, שלוש סריקות YZ ממוצעות כדי לתת הערכה מדויקת יותר של נפח מיוטום. אם נדרש על ידי התוכנה confocal, לכוון מחדש את שדה הסריקה.
    1. ציירו קו גב לגחון מדויק על פני הסומיט הנבחר בניצב לציר האנטרופוסטריור של הדג במיקום אנטרופוסטרי נבחר. בצע סריקת קו Z-stack.
    2. חזור על סריקת קו YZ שלוש פעמים במיקומים אנטרופוסטריוריים מוגדרים לאורך המיוטום שנבחר כדי ללכוד את YZa, YZm ו- YZp. תוצאות מייצגות מוצגות באיור 2A. תן שם לתמונות אלה ושמור אותן יחד עם תמונת ה- XY הקשורה.
      הערה: בבחירת מישורי YZ: המיוטום הוא בצורת V וצורתו משתנה במהלך הצמיחה. כדי לקבל את ההערכה המדויקת ביותר של נפח מיוטום 17 בשיטת 4 פרוסות, מקם את YZa בקצה הקדמי של המיוטום, YZp על הקצוות האחוריים של המיוטום בקצוות הגביים והגחוניים, ו- YZm באמצע הדרך בין YZa ל- YZp. בהנחה שהסומיט מתחדד באופן אחיד, ממוצע המדידות מכל מקטע YZ ייצג את המיוטום בכללותו. עבור שיטת 2 פרוסות, סריקת YZ יחידה צריכה להיות ממוקמת בקצה האחורי של המיוספטום האופקי, אשר מתאים בערך למרכז האנטרופוסטריור של מיוטום העניין (כגון YZm). לחלופין, ניתן לקחת קבוצה של שלושה מקטעי YZ בחלק הקדמי, האמצעי והאחורי של המיוספטום האופקי, אך כפי שמוצג להלן, מדידה כזו תהיה מעט מעל או תת-הערכה של נפח מיוטום (עבור סומיטים רוסטרליים וקאודליים, בהתאמה, עקב התחדדות מיוטום). ביסודו של דבר, עקביות במיקום מישורי פרוסת YZ בין דגים לניסויים היא המפתח לשכפול.

4. ניתוח

  1. מכיוון שהמיוטום משנה את גודלו לאורך הדג באופן מדורג, עבדו תמיד עם אותו סומיט במחקרים השוואתיים.
  2. כדי למדוד ולחשב את נפח המיוטום, השתמש בתוכנת הקונפוקל (כגון קבצי .lsm שנוצרו באמצעות תוכנת המיקרוסקופ Zeiss ZEN) או בתוכנת ניתוח תמונות אוניברסלית בקוד פתוח, כגון Fiji/ImageJ.
    הערה: בעת שינוי תבניות קובץ, ודא שגודל שלב Z מועבר כהלכה, מכיוון שלא כל התוכנות יכולות לקרוא תבניות קובץ קונפוקליות קנייניות כראוי. לדוגמה, כדי לייבא תמונת סריקת שורות ZEN לפיג'י, השתמש תחילה בפקודה File/Export כדי לייצא כ- .tif בחלון תמונה ברזולוציה מלאה - תבנית מישור בודד, ולאחר מכן יבא לפיג'י. למרות שניתן לפתוח את YZ scan.lsm ישירות בפיג'י, תמונות ה-YZ המתקבלות נדחסות בדרך כלל בממד Z עקב הערכה שגויה של גודל הצעד Z.
  3. ניתוח באמצעות ZEN
    1. ראשית, פתח את קבצי XY scan.lsm בזן. עברו לכרטיסייה ' גרפיקה' ובחרו בכלי קו. ציירו קו בין שני המיוספטה האנכיים של סומיט 17 המשתרעים על כל אורך המיוטום (במקביל לציר האנטרופוסטריור של הדג). סמן את התיבה M כדי לחשוף את ערכי המדידה (אורך = 89.71 מיקרומטר, ראה קובץ משלים 2).
    2. פתח את הקבצים YZ scan.lsm. תחת הכרטיסיה גרפיקה , בחר בכלי בזייה סגורה . ציירו סביב היקף המיוטום. לאחר השלמתו, סמן את התיבה M, פעולה זו תחשוף את ערך המדידה (שטח = 11980.01 מיקרומטר2, ראה קובץ משלים 3).
    3. הקלט את הערכים של כל מדידה באופן ידני בגיליון אלקטרוני. ממוצע מדידות CSA כנדרש. ניתן לחשב את נפח המיוטום כנפח = אורך מיוטום x CSA, כלומר, 89.71 מיקרומטר x 11980.01 מיקרומטר2 = 1.075 x 106 מיקרומטר3.
  4. ניתוח באמצעות פיג'י/אימג'יי
    1. פתח את הקבצים XY scan.lsm בפיג'י/ImageJ. בדוק אם תמונות XY שנפתחו ישירות בפיג'י מכוילות כראוי בקנה מידה, כפי שהן צריכות להיות.
    2. בחרו בכלי קו ישר מהסמלים. ציירו קו לאורך סומיט 17 כמתואר בשלב 4.3.1. הגדר פרמטרי מדידה על-ידי מעבר אל נתח, ולאחר מכן בחר קבע מדידות..., וסמן את התיבות הבאות אזור ותווית תצוגה. כדי למדוד, פשוט לחץ על המקש החם M, או עבור לתפריט ניתוח ובחר מדוד. חלון מוקפץ שנוצר מפרט את כל ערכי המדידה (כלומר, אורך = 90.023 מיקרומטר; ראה קובץ משלים 4). ניתן לשמור את התוצאות בצורה של .csv ולפתוח ב- Microsoft Excel או דומה לניתוח הבא.
    3. כדי למדוד CSA בתמונות YS, פתח את תמונות YZ בתבנית .tif כמתואר בשלב 4.2.
    4. כייל את התמונות .tif YZ מכיוון שהן אינן מכויילות בעת ייצואן. ניתן לקבל פרמטרים לכיול ב- ZEN על ידי מעבר אל המידע של התמונות שנבחרו: הקלט את ערכי קנה המידה X (0.489 מיקרומטר) ו- Scaling Z (0.890 מיקרומטר; ראה קובץ משלים 5). לאחר מכן, כאשר התמונות פתוחות בפיג'י, עבור אל תמונה ובחר מאפיינים.... קלט 0.489 מיקרומטר עבור רוחב הפיקסלים וגובה הפיקסלים, ו- 0.890 μm עבור עומק Voxel. סמן את התיבה כללי כדי להחיל את הכיול באופן אוניברסלי אם צפויה מדידה חוזרת של תמונות YZ (ראה קובץ משלים 6).
      הערה: ודא שכל תמונות YZ נלכדו באמצעות אותם פרמטרי סריקה; הפעל מחדש את Fiji/ImageJ או שנה את ערכי הכיול אם נדרשת ערכת כיול חדשה.
    5. למדידת CSA של תמונות YZ מכוילות, בחרו בכלי בחירות מצולע מהסמלים. ציירו סביב היקף הסומיט, ולחצו על M כדי לחשוף את ערכי המדידה (שטח = 11980.395 מיקרומטר2; ראו קובץ משלים 7). ניתן לחשב את נפח המיוטום כנפח = אורך מיוטום x CSA, כלומר, 90.023 מיקרומטר x 11980.395 מיקרומטר2 = 1.079 x 106 מיקרומטר3.
    6. חזור על המדידות בתמונות XY ו- YZ האחרות. מומלץ להשתמש באותה תוכנה לכל המדידות בסדרת ניסויים לצורך עקביות. אומדן הנפח מכל תוכנה דומה אך לא זהה בשל כלי השרטוט השונים, כלומר, ZEN = 1.074 × 10 6 מיקרומטר 3 ופיג'י / ImageJ = 1.079 × 106 מיקרומטר3. ניתן לחשב את גדילת המיוטום בין שתי נקודות זמן (כלומר, 3 עד 4 dpf) כ: (נפח 4 dpf - נפח 3 dpf)/ נפח 3 dpf × 100%.
      הערה: על טעות ותיקונה. במהלך ההרכבה, הדג צריך להיות מכוון עם המישור sagittal שלה (כלומר, anteroposterior ו dorsoventral צירים) קרוב ככל האפשר אופקי, כדי למנוע פיהוק וגלגול, בהתאמה. הסיבה לכך היא שגם אורך המיוטום L שנמדד מסריקת XY וגם ה-CSA שנמדד מסריקת YZ יוערכו יתר על המידה אם הדג יראה פיהוק (סיבוב סביב הציר הדורסו-ונטרלי) עקב הרכבה אנטרופוסטרית אלכסונית. לא המגרש ולא הגלגול במהלך ההרכבה אמורים להשפיע על המדידות לאחר הסריקה כמתואר בסעיף 3. עם זאת, סיבוב הגב (גליל) פוגע באיכות התמונה. טריגונומטריה פשוטה מראה כי עד 10° של פיהוק ייתן שגיאה של 3% במדידת הנפח, כפי שנמדדו L ו- CSA כל אחד בפרופורציה ל- (cosq)-1, כאשר q היא הזווית הרחק מאנטרופוסטריור אופקי (פיהוק). 15° ו-20° הנחה יתנו הערכות יתר של 7% ו-13% של נפח, בהתאמה.
      מכיוון שהנוטוכורד הוא גלילי, ניתן להשתמש בהכללת כל הנוטוקורד בסריקת YZ כדי לחשב את הזווית וההיקף של השכחה מהכיוון והגודל של הצירים הראשיים והמינוריים ובכך לתקן את L ו- CSA הנמדדים כדי למקסם את הדיוק. CSA מתוקן = נמדד CSA x ציר נוטוכורד מינורי/ציר נוטוכורד מז'ור. L מתוקן = נמדד L x ציר נוטוכורד מינורי/ציר נוטוכורד בכיוון מיקרוסקופ Z .
      שיקול נוסף מאפשר תיקון נוסף של L. ככל שהמיוטום גדל, הוא מוטה במישור הקורונלי (נורמלי לציר הדורסו-בונטרלי) כך שהמיוטום המדיאלי מעט קדמי למיוטום הלטרלי. במבט מהגב האחורי, המיוספטה האנכית בצד שמאל ובצד ימין יוצרת שברון רחב המצביע קדמית. אם הפיהוק נמוך, מורפולוגיה זו אינה משפיעה על מדידת L. אבל אם הפיהוק הוא משמעותי, תיקון טריגונומטרי הופך למאתגר וגישה טובה יותר היא למדוד את True L ישירות על ידי הערכת קואורדינטות XYZ של שתי הנקודות שבהן המיוספטה האנכית הקדמית והאחורית פוגשת את הנוטוקורד במיוספטום האופקי. טריגונומטריה פשוטה מאפשרת חישוב של L אמיתי מקואורדינטות אלה כ- L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)2]. חולשותיה של גישה אחרונה זו הן ש- א) בחירת הנקודות יכולה להשתנות עם האופרטור ו- ב) לא נשמר תיעוד חזותי של הנקודות שנבחרו. שיקול זה אינו משפיע על תיקון CSA.

5. שיטה אופציונלית: הסרה והצגה מחדש של הפעילות החשמלית של השרירים

  1. צרו תא גירוי.
    1. קח לוח באר בגודל 6 x 35 מ"מ, צור שני פתחים קטנים (<5 מ"מ קוטר, 1 ס"מ זה מזה) בכל צד של כל באר (ראו איור 1) באמצעות ברזל הלחמה צר.
      הערה: טפל בזהירות במגהץ ההלחמה החם ועבוד על מכסה אדים אם תרצה בכך כדי למנוע שאיפת אדים.
    2. השחיל זוג חוטי כסף או פלטינה (באורך של ~20 ס"מ) דרך הפתחים של כל באר (ראו איור 1). ניתן ליישם חומר דבק רב-פעמי (לדוגמה, BluTack) ליד הפתחים כדי לשמור על החוטים במקומם, ולהבטיח הפרדה של 1 ס"מ בין החוטים (ראו איור 1).
  2. ב-3 dpf, חלקו את הדגים לשלושה תנאים: מדיום דגים בקרה, לא פעיל, ולא פעיל+סטים.
    1. עבור קבוצות לא פעילות ולא פעילות+סטיים, מרדימים זחלים 72 שעות לאחר ההפריה (hpf) עם טריקאין (0.6 מ"מ).
      הערה: לאחר הפניה38, אליקוטים קפואים של מלאי טריאין מופשרים ומדוללים (40 μL/mL דגים בינוניים, לריכוז סופי של 0.6 mM) לפני שהם מוסיפים לדגים. אין להוסיף טריקאין ישר למים המכילים דגים, שכן חלק מהדגים עלולים לקבל מינונים גבוהים. יש להשתמש במלאי טריקאין תוך חודש ולעולם לא להקפיא אותו מחדש.
    2. עבור הדגים הבינוניים שליטה בדגים, השאירו אותם ללא הרדמה.
  3. במועדים נבחרים לאחר תחילת החשיפה לטריקיין (כלומר, ב-80 כ"ס), הכינו את קבוצת ה-Inactive+Stim לגירוי.
    1. הכינו 60 מ"ל של 2% אגרוז (1.2 גרם אבקת אגרוז ב-60 מ"ל של מדיום דגים), והמיסו את הקרח במלואו באמצעות מיקרוגל, מצננים, מוסיפים טריקאין ויוצקים 4 מ"ל לכל באר של תא הגירוי (איור 1).
    2. הוסיפו מיד מסרקים בעלי 4 בארות בהתאמה אישית בין האלקטרודות (שנוצרו על-ידי חיתוך פלסטיק (למשל, פוליפרופילן) במידות הרצויות והיצמדות זו לזו באמצעות Superglue; ראו איור 1). אפשר 10 דקות עד שהג'ל יתייצב. הסר מסרקים בזהירות כדי ליצור ארבע בארות מלבניות.
    3. מלאו כל באר במי טריקיין והניחו זחל אחד מורדם לא פעיל+סטיים בכל באר באמצעות מיקרו-פיפטה, כאשר הציר האנטרופוסטרי שלהם ניצב לאלקטרודות ( ראו איור 1).
    4. בדקו מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי המנתח אם כל דג מורדם במלואו בתוך כל באר של החדר.
  4. חברו מגרה אלקטרופיזיולוגי מתכוונן ליצירת תבניות לתא באמצעות בקר קוטביות, באמצעות קליפסים של תנינים המחוברים לכל אחת מהאלקטרודות בצד אחד של התא (ראו איור 1).
    הערה: בקר הקוטביות משמש להיפוך הקוטביות כל 5 שניות, כדי למנוע אלקטרוליזה וקורוזיה של האלקטרודות.
  5. לעורר דגים. לדוגמה, 1s עם רכבת של 200, 20 פולסים V, עם משך פולס 0.5 ms ו 4.5 ms הפרדת פולסים, פעם אחת כל 5 s נותן משטר יעיל התנגדות התכווצות טטנית חוזרת.
  6. בדוק באופן קבוע מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר שהדגים מגרים; הגירוי החשמלי לדוגמה אמור לגרום להתכווצות דו-צדדית נראית לעין ולתנועה קלה, אחת ל-5 שניות.
  7. למשטר התנגדות/כוח גבוה, עוררו את הדגים בתדירות גבוהה למשך 5 דקות, שלוש פעמים, כאשר כל התקף מופרד על ידי 5 דקות של מנוחה.
    הערה: בזמן שדגים בצד אחד של התא נחים, ניתן לחבר את קליפס התנין לזוג האלקטרודות בצד השני של התא, והדגים הנוספים האלה מגורה.
  8. לאחר הגירוי, הסירו בזהירות דגים מכל באר על ידי שטיפתם בעדינות עם פיפטה מפלסטיק וחזרו לאינקובטור במדיום דגים טרי המכיל טריקאין.
  9. יש לשפוך את מי הטריקיין מתוך התא ולהשתמש במלקחיים כדי לחתוך ולהסיר את האגרוז מכל באר. שוטפים את הבארות במי ברז ומניחים להן להתייבש.
    הערה: אם משתמשים באלקטרודות של חוטי כסף, מדי פעם תחמוצת כסף עשויה להצטבר על פני השטח של החוט לאחר ניסוי גירוי. מכיוון שתחמוצת כסף פחות מוליכה מכסף, כדי לשמור על יכולת השחזור, שפשפו בזהירות את תחמוצת הכסף מהחוט באמצעות Kimwipes לפני השימוש מחדש בהתקנה.

תוצאות

מדידה מהירה ומדויקת של נפח הסומיט
מתוארת שיטה להכנת דגימה, איסוף נתונים וניתוח נפחי המאפשר מדידה מהירה של צמיחת שרירים בזחלי דגי זברה. ניתן למדוד את גודל השרירים בבעלי חיים באמצעות דגים המסומנים על קרומי הפלזמה שלהם באמצעות GFP ממוקד ממברנה (β-אקטין:HRAS-EGFP) או mCherry (α-אקטין:mCh...

Discussion

כאן אנו מדווחים על שיטה להערכה מדויקת ויעילה של נפח השריר של זחלי דגי זברה חיים בשלבים או בגרסאות גנטיות שבהן פיגמנטציה אינה מהווה מכשול גדול להדמיה וכאשר הרדמה חולפת ו/או אימוביליזציה נסבלת היטב. בעוד שהשתמשנו במיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, הגישות המתוארות ישימות למיקרוסקופיה קו?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים חבים חוב עמוק למאמציהם של חברי המעבדה של יוז, ד"ר סיטראמיה אטילי, יאנה קות', פרננדה בג'נקה, ויקטוריה ויליאמס, יניב היניטס, ג'ורג'יה ברגמין וולדימיר סנטקוב לפיתוח הפרוטוקולים המתוארים, ולהנרי רוהל, כריסטינה האמונד, דייוויד לנגנאו ופיטר קארי על שיתוף פלסמידים או קווי דגי זברה. SMH הוא מדען של המועצה למחקר רפואי (MRC) עם מענק תוכנית G1001029, MR/N021231/1 ו-MR/W001381/1. תואר שני החזיק בתוכנית הכשרה לדוקטורט MRC מקינגס קולג 'בלונדון. עבודה זו נהנתה מהקלט הטריגונומטרי של דייוויד מ. רובינסון, חוקר, מנטור וחבר.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesive, Blu TackBostik--
Aerosol vacuum ---
AgaroseSigma-AldrichA9539-
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heaterCole-ParmerSBH130-
BODIPY FL C5-ceramideThermo ScientificD3521To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires---
Fiji/imageJNational Institutes of Health, NIH--
Fish medium, Fish water--Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium--E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscopeLeicaLeica MZ16FFluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needleWorld Precision Instruments, Inc.1B100-6To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulatorGrass InstrumentsS88Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task WipersKimberly-Clark Professional13258179-
Laser scanning microscope (LSM) ZeissZeiss LSM 5 Exciter
Zeiss LSM 880		LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plateThermo Scientific140675-
Objective, 20×/1.0W water immersionZeiss--
Pasteur Pipette, Graduated 1 mLStarlab GroupE1414-0100-
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mLStarlab GroupE1414-1100-
Petri dish, 60 mmSigma-AldrichP5481-
Plasmid, CMV-CeruleanChristina L. Hammond (University of Bristol)pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAXHenry Roehl (University of Sheffield)-For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used);
synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller Hoefer Scientific InstrumentsPC750-
Soldering iron---
TricaineSigma-AldrichE10521Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
VolocityPerkin Elmer/Quorum Technologies Inc--
Watchmaker forceps, No. 5---
Wire, PlatinumGoodfellowPT005142/120.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, SilverAcros Organics3177300100.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFPDavid M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)-ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAXPeter D. Currrie (ARMI, Monash University)-ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP--ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
ZEN softwareZeiss--

References

  1. Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
  2. Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
  3. Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
  4. Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
  5. Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
  6. Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
  7. Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
  8. Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
  9. Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
  10. Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
  11. Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
  12. Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
  13. Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  14. Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
  15. Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
  16. Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
  17. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  18. Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
  19. Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
  20. Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
  21. Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
  22. Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
  23. Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
  24. Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
  25. Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
  26. Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
  27. Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
  28. Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
  29. Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
  30. Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
  31. Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
  32. Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
  33. Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
  34. Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
  35. Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
  36. Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
  37. Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
  38. Westerfield, M. . The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  39. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  40. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
  41. Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
  42. Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
  43. Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
  44. Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
  45. Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
  46. Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
  47. Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
  48. Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved