نموذج العلاج المناعي التجريبي للورم الميلانيني باستخدام التطعيم ضد الورم باستخدام السيتوكين المكونة للدم

Summary

يقدم البروتوكول نموذجا للعلاج المناعي للسرطان باستخدام التطعيم ضد الورم القائم على الخلايا مع سرطان الجلد B16-F10 المعبر عن Flt3L. يوضح هذا البروتوكول الإجراءات ، بما في ذلك تحضير الخلايا السرطانية المستزرعة ، وزرع الورم ، وتشعيع الخلايا ، وقياس نمو الورم ، وعزل الخلايا المناعية داخل الورم ، وتحليل قياس التدفق الخلوي.

Abstract

التيروزين كيناز 3 ليجند الشبيه ب Fms (Flt3L) هو سيتوكين مكون للدم يعزز بقاء وتمايز الخلايا المتغصنة (DCs). تم استخدامه في لقاحات الأورام لتنشيط المناعة الفطرية وتعزيز الاستجابات المضادة للأورام. يوضح هذا البروتوكول نموذجا علاجيا باستخدام لقاح الورم القائم على الخلايا الذي يتكون من خلايا الورم الميلانيني B16-F10 المعبرة عن Flt3L جنبا إلى جنب مع التحليل الظاهري والوظيفي للخلايا المناعية في البيئة المكروية للورم (TME). يتم وصف إجراءات تحضير الخلايا السرطانية المستزرعة ، وزرع الورم ، وتشعيع الخلايا ، وقياس حجم الورم ، وعزل الخلايا المناعية داخل الورم ، وتحليل قياس التدفق الخلوي. الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير نموذج العلاج المناعي للورم الصلب قبل السريري ، ومنصة بحثية لدراسة العلاقة بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية المتسللة. يمكن دمج بروتوكول العلاج المناعي الموصوف هنا مع طرق علاجية أخرى ، مثل حصار نقاط التفتيش المناعية (الأجسام المضادة ل CTLA-4 ، والأجسام المضادة ل PD-1 ، والأجسام المضادة ل PD-L1) أو العلاج الكيميائي من أجل تحسين التأثير العلاجي للسرطان لسرطان الجلد.

Introduction

تم التعرف على العلاج المناعي للسرطان كاستراتيجية علاجية واعدة بناء على آثاره الجانبية الأقل سمية والاستجابات الأكثر ديمومة. تم تطوير عدة أنواع من العلاجات المناعية ، بما في ذلك علاجات فيروس الأورام ، ولقاحات السرطان ، وعلاجات السيتوكين ، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، ونقل الخلايا بالتبني (خلايا CAR-T أو CAR-NK) ، وحصار نقطة التفتيش المناعية¹.

بالنسبة للقاحات السرطان ، هناك أشكال مختلفة من اللقاحات العلاجية ، مثل اللقاحات القائمة على الخلايا الكاملة ، ولقاحات البروتين أو الببتيد ، ولقاحات الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي. يعتمد التطعيم على قدرة الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) على معالجة مستضدات الورم ، بما في ذلك المستضدات الخاصة بالورم ، وتقديمها في شكل مناعي للخلايا التائية. من المعروف أن الخلايا المتغصنة (DCs) هي أقوى APCs ويعتقد أنها تلعب دورا مهما في المناعة المضادة للأورام ^2,3. تمتص هذه الخلايا مستضدات الورم وتعالجها ، ثم تهاجر إلى الغدد الليمفاوية المستنزفة (dLN) لتجهيز وتنشيط خلايا المستجيب التائية الخاصة بالورم (Teff) من خلال إشراك مستقبلات الخلايا التائية (TCR) والجزيئات المكلفة. ينتج عن هذا تمايز وتوسع الخلايا التائية السامة للورم (CTL) ، والتي تتسلل إلى الورم وتقتل الخلايا السرطانية⁴. وبالتالي ، فإن تنشيط ونضج DCs يمثلان استراتيجيات جذابة لتحفيز المناعة ضد مستضدات الورم.

من المعروف أن Flt3L يعزز نضوج وتوسع DCs الناضجة وظيفيا التي تعبر عن بروتينات MHC من الفئة II و CD11c و DEC205 و CD86⁵. ثبت أن الإدارة داخل الورم ، ولكن ليس عن طريق الوريد ، لناقل الفيروس الغدي الذي يتضمن جين Flt3L (Adv-Flt3L) تعزز النشاط العلاجي المناعي ضد أورام الخصية⁶. كما تم استخدام Flt3L في اللقاحات القائمة على الخلايا السرطانية التي تتكون من خلايا B16-F10 المشععة التي تعبر بثبات عن Flt3L المحول بالفيروسات القهقرية كوسيلة لتعزيز العرض المتقاطع لمستضدات الورم بواسطة DCs ، وبالتالي زيادة الاستجابات المضادة للأورام. يعتمد بروتوكول التطعيم ضد الورم B16-Flt3L الموصوف هنا على دراسة نشرتها مجموعة الدكتور جيمس أليسون⁷. في هذه الورقة ، أفادوا أن لقاح B16-Flt3L جنبا إلى جنب مع حصار CTLA-4 أدى بشكل تآزري إلى رفض سرطان الجلد الثابت ، مما أدى إلى زيادة البقاء على قيد الحياة.

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير نموذج العلاج المناعي قبل السريري لسرطان الجلد. هنا ، يتم وصف الإجراءات التفصيلية لكيفية تحضير وزرع لقاحات الورم ، وكيفية تحليل تكوين ووظيفة الخلايا المناعية داخل الورم من الورم الصلب.

Protocol

تم الحفاظ على جميع الفئران المستخدمة في الدراسة وإيوائها في حظيرة معهد لا جولا لعلم المناعة (LJI) في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض مع التحكم في درجة الحرارة والرطوبة. تم إجراء تجارب على الحيوانات مع إناث الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8-14 أسبوعا وفقا للإرشادات والبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوان LJI.

1. تحضير الخلايا السرطانية المستزرعة للزرع

1. خلايا سرطان الجلد B16-F10 في وسط دولبيكو المعدل من Iscove (IMDM) يحتوي على 10٪ FBS المعطل بالحرارة ، و 2 mM الجلوتامين ، و 1 mM من بيروفات الصوديوم ، و 1 mM MEM من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 100 وحدة / مل من كل من البنسلين والستربتومايسين. الحفاظ على خط الخلية عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO₂.
2. البذور 1.5-2 × 10⁶ خلايا B16-F10 في قارورة 175T وثقافة لمدة يومين. حصاد الخلايا عندما تكون 75٪ -80٪ متقاربة.
3. قم بإزالة وسط الثقافة واغسل القارورة مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. نضح برنامج تلفزيوني وأضف 5 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA متبوعا بالنقر بقسوة على حافة قارورة الثقافة.
4. أضف 15 مل من وسط الاستزراع لتحييد التربسين-EDTA وصب محتويات القارورة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. اغسل سطح الطبق ب 10 مل من PBS واسكبه في نفس الأنبوب سعة 50 مل.
5. أجهزة الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 200 × جم. تخلص من المادة الطافية وكسر حبيبات الخلية عن طريق النقر بالإصبع على قاع الأنبوب.
6. أضف 10 مل باردة من PBS وقم بسحب تعليق الخلية برفق ؛ بعد ذلك ، عد الخلايا يدويا باستخدام مقياس الدم. الحفاظ على الخلايا على الجليد قبل الحقن.

2. زرع الورم

1. تخدير الفئران بالغاز بنسبة 5٪ إيزوفلوران بمعدل تدفق غاز يبلغ 1.0 لتر في الدقيقة في غطاء الدخان. قم بتغيير معدل التدفق إلى جرعة الصيانة البالغة 2٪ إيزوفلوران بمجرد تخدير الفئران بالكامل. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم إجراء التخدير من قبل الطبيب البيطري باتباع إرشادات رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية.
2. حلق الشعر على الجانب الأيسر من الفئران وتعقيم موقع الحقن باستخدام مناديل الكحول. داخل الأدمة (i.d.) زرع الخلايا السرطانية B16-F10 في 5 × 10⁵ خلايا في 50 ميكرولتر من PBS الباردة في الجانب الأيسر باستخدام إبرة 30 G.
   ملاحظة: قد تحتاج إلى تعديل جرعة الخلايا السرطانية المزروعة B16-F10 في حدود 0.5-5 × 10⁵ خلايا لتطوير الورم بنجاح.
3. بعد الزرع ، قم بقياس طول الورم وعرضه ثلاث مرات في الأسبوع باستخدام الفرجار الرقمي الإلكتروني. احسب حجم الورم (مم³) باستخدام الصيغة:
   حجم الورم (مم³) = العرض² × الطول × 0.5
   علاج الفئران بلقاح الورم عندما تصل الأورام إلى حجم ≥2 ملم.
   ملاحظة: يمكن قياس الأورام عادة في اليوم 3 بعد زرع 5 × 10⁵ خلايا ورمية. لوحظ معدل نمو أسرع للورم B16-F10 في ذكور C57BL / 6 أو Rag1-/- أو Rag2-/-γc-^/-الفئران. تم وصف ملاحظة مماثلة في دراسات أخرى⁸. يوصى بالحفاظ على اتساق جنس الفئران. ومع ذلك ، لاحظ أن المعاهد الوطنية للصحة تركز على الجنس كمتغير بيولوجي مهم في البحوث الطبية الحيوية.

3. تحضير اللقاح وحقن خلايا B16-F10 (B16-Flt3L) المعبرة عن Flt3L

1. الحفاظ على خلايا B16-Flt3L في DMEM التي تحتوي على 8٪ FBS المعطل بالحرارة ، و 2 mM الجلوتامين ، و 100 وحدة / مل لكل من البنسلين والستربتومايسين عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO₂.
2. البذور 1 × 10⁶ B16-Flt3L الخلايا في قارورة 175T وثقافة لمدة 2 أيام. حصاد الخلايا عندما تكون 75٪ -80٪ متقاربة كما هو موضح في الخطوات من 1.3 إلى 1.6 وتعليقها في 1 مل من PBS البارد.
3. تشعيع الخلايا بجرعة 150 جراي من أشعة جاما باستخدام الأشعة السينية Irradiator مع إعداد معلمة 160 كيلو فولت و 25 مللي أمبير. عد وتحقق من صلاحية الخلية عن طريق تلطيخ تريبان الأزرق قبل الحقن.
4. تخدير الغاز الفئران كما هو موضح سابقا وتعقيم موقع الحقن باستخدام مناديل الكحول. حقن الفئران داخل الأدمة بخلايا B16-Flt3L المشععة 1 × 10 6 في 50 ميكرولتر من PBS البارد على نفس الجناح مثل زرع الورم الأصلي ، ~ 1 سم بعيدا عن موقع الورم الرئيسي في الأيام 3 و⁶ و 9 بعد زرع الخلية الأولي.
5. ضع علامة على مواقع حقن اللقاح بقلم ملون لتمييزه عن الورم الرئيسي.
   ملاحظة: إذا تم زرع 0.5 × 10⁵ خلايا B16-F10 في البداية ، فمن المستحسن إجراء علاج اللقاح في الأيام 8 و 11 و 14.

4. عزل الخلايا المناعية داخل الورم

1. التضحية الفئران باستخدام CO₂ وخلع عنق الرحم في غطاء الدخان في نهاية التجربة (في اليوم 15 بعد زرع الورم; الشكل 1).
2. قم بإزالة الورم جراحيا مع الجلد من كل فأر ووضعه في لوحة 24 بئر مع 1 مل 10٪ FBS / RPMI-1640 المتوسطة. جفف الأورام باستخدام منشفة ورقية قبل وزنها.
3. قطع الأورام إلى قطع صغيرة. أضف 2 مل من محلول الهضم (100 ميكروغرام / مل TL Liberase و 200 ميكروغرام / مل DNase I في وسط RPMI-1640) واحتضانه لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
4. أضف 10 مل من 10٪ FBS / RPMI-1640 متوسطة لوقف عملية الهضم. انقل الخلايا باستخدام ماصة مصلية سعة 25 مل واستخدم مكبس حقنة سعة 1 مل لطحن الأنسجة على مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
5. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من وسط محدد التدرج بكثافة 40٪ في PBS ، مخفف إلى تركيز 1x).
6. أضف معلق الخلية ببطء فوق 5 مل من وسط خاص بتدرج الكثافة بنسبة 80٪ يحتوي على PBS. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 325 × جم مع ضبط فرامل منخفض لمدة 23 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
7. بعد الطرد المركزي ، اجمع بعناية طبقة الكريات البيض عند الواجهة بين 40٪ و 80٪ وسط خاص بتدرج الكثافة ومررها عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
8. احتضان الحبيبات في 2 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) لمدة 5 دقائق في RT. بعد الحضانة ، أضف 10 مل من وسيط FBS / RPMI-1640 بنسبة 10٪ لإخماد مخزن تحلل كرات الدم الحمراء.
9. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في 0.5 مل من وسيط FBS / RPMI-1640 بنسبة 10٪ واحسب العدد الإجمالي للخلايا قبل الاستخدام لمزيد من التحليل.
   ملاحظة: اجمع الطحال أو dLN كعناصر تحكم لاستراتيجية بوابة مجموعات فرعية من الخلايا المناعية عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. اتبع طريقة عزل الخلية كما هو موضح أعلاه مع التغييرات التالية: استخدم مكبس حقنة سعة 1 مل لطحن الأنسجة على مرشح شبكي 70 ميكرومتر. اغسل المنديل بوسط FBS / RPMI-1640 بنسبة 10٪ للحصول على معلقات أحادية الخلية. Lyse RBC كما هو موضح.

5. تحليل التدفق الخلوي

ملاحظة: تحتوي الخلايا التي تم جمعها من طبقة الكريات البيض على خلايا مناعية وخلايا ورمية. يوصى باستخدام لوحين تلطيخ مستقلين.

1. تلطيخ السطح
   1. انقل الخلايا إلى لوحة سفلية على شكل حرف V 96 بئرا. اغسل الخلايا باستخدام PBS وقم بتلطيخها بصبغة صلاحية الخلية (50-100 ميكرولتر / بئر) لمدة 15 دقيقة في RT.
   2. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتلطيخ علامات السطح بأجسام مضادة مختلطة (يتم توفير التخفيف التفصيلي في جدول المواد) في مخزن FACS المؤقت (1٪ FBS و 0.05٪ NaN₃ في PBS) لمدة 30 دقيقة على الجليد (50-100 ميكرولتر / بئر).
   3. قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 500 × جم لمدة 5 دقائق واغسلها باستخدام مخزن FACS مرتين.
   4. ثبت الخلايا بمخزن مؤقت لتثبيت الخلايا (50-100 ميكرولتر / بئر) لمدة 35 دقيقة على الثلج. قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 500 × جم لمدة 5 دقائق واغسلها مرتين باستخدام مخزن FACS.
   5. قم بتخزين العينات في مخزن FACS (150-200 ميكرولتر / أنبوب) عند 4 درجات مئوية وحمايتها من الضوء. الحصول على العينات على مقياس التدفق الخلوي. بالنسبة لسكان الخلايا التائية والخلايا التائية ، اتبع استراتيجيات البوابات الواردة في الشكل 2B والشكل 3A.
      ملاحظة: لتلطيخ DCs النخاعية ، يوصى باحتضان حاصرات FC (الفئران المضادة للفأر CD16 / CD32) لمدة 15 دقيقة على الجليد قبل حضانة الأجسام المضادة السطحية (الخطوة 5.1.2).
2. تحليل السيتوكين عند إعادة التحفيز خارج الجسم الحي
   1. قم بطلاء الخلايا في وسط كامل (RPMI-1640 مكمل ب 10٪ FBS ، 10 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.2-7.6 ، 0.1 mM من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 1 mM من بيروفات الصوديوم ، 100 وحدة / مل لكل من البنسلين والستربتومايسين ، 50 ميكرومتر 2-mercaptoethanol ، و 2 mM L-glutamine) وتحفيز مع 50 نانوغرام / مل من PMA بالإضافة إلى 1 ميكرومتر أيونوميسين في وجود مثبط نقل البروتين لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO₂.
   2. قم بإجراء تلطيخ السطح لعلامات السطح كما هو موضح أعلاه في الخطوة 5.1.
   3. أضف محلول النفاذية (50-100 ميكرولتر / بئر) واحتضانه لمدة 5 دقائق في RT للتلطيخ داخل الخلايا. احتضان الخلايا بأجسام مضادة خاصة بالسيتوكينات أو البروتينات النووية في محلول نفاذية (50-100 ميكرولتر / بئر) لمدة 60 دقيقة على الجليد أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   4. قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 500 × جم لمدة 5 دقائق واغسلها باستخدام مخزن FACS مرتين. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية وحمايتها من الضوء. الحصول على العينات على مقياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: قد يلزم تعديل تخفيف الأجسام المضادة حسب الضرورة لتحقيق التلوين الأمثل.

النتائج

عادة ما يتم ملاحظة نقطة سوداء مرئية لخلايا B16-F10 المزروعة على سطح الجلد ~ 3 أيام بعد زرع الورم. يتم علاج الفئران بلقاح الورم بعد 3 و 6 و 9 أيام من وصول العقيدة الورمية إلى حجم ≥2 مم. لاحظنا انخفاضا كبيرا في نمو الورم في مجموعة الفئران الملقحة ~ 2 أسابيع بعد زرع الورم (الشكل 1). في نها...

Discussion

يعتمد البروتوكول الموصوف هنا على الدراسة التي أجرتها مجموعة أليسون. لقد أظهروا أن الجمع بين لقاح B16-Flt3L مع حصار CTLA-4 أظهر تأثيرا تآزريا على معدل البقاء على قيد الحياة ونمو الورم ، في حين لم يلاحظ أي انخفاض في نمو الورم في الفئران التي تتلقى لقاح B16-Flt3L أو علاج الأجسام المضادة ل CTLA-4 وحده

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G needle	BD Biosciences	305106
96 well V-shape-bottom plate	SARSTEDT	83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixation buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cell fixation buffer (4.2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Electronic digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor)	BD Biosciences	554724	1:1500 dilution
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM nonessential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	density gradient specific medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Sterile cell strainer 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antibodies
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200