使用造血细胞因子接种肿瘤的实验性黑色素瘤免疫治疗模型

摘要

该协议提出了一种癌症免疫治疗模型，使用表达Flt3L的B16-F10黑色素瘤进行基于细胞的肿瘤疫苗接种。该协议演示了程序，包括培养的肿瘤细胞的制备，肿瘤植入，细胞照射，肿瘤生长的测量，肿瘤内免疫细胞的分离和流式细胞术分析。

摘要

Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）是一种造血细胞因子，可促进树突状细胞（DC）的存活和分化。它已被用于肿瘤疫苗中，以激活先天免疫并增强抗肿瘤反应。该协议展示了使用基于细胞的肿瘤疫苗的治疗模型，该疫苗由表达Flt3L的B16-F10黑色素瘤细胞以及肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的表型和功能分析组成。描述了培养的肿瘤细胞制备、肿瘤植入、细胞照射、肿瘤大小测量、肿瘤内免疫细胞分离和流式细胞术分析的程序。该方案的总体目标是提供一个临床前实体瘤免疫治疗模型，以及一个研究肿瘤细胞与浸润免疫细胞之间关系的研究平台。这里描述的免疫治疗方案可以与其他治疗方式相结合，例如免疫检查点阻断（抗CTLA-4，抗PD-1，抗PD-L1抗体）或化疗，以提高黑色素瘤的癌症治疗效果。

引言

癌症免疫疗法因其毒性副作用较小和反应更持久而被认为是一种有前途的治疗策略。已经开发了几种类型的免疫疗法，包括溶瘤病毒疗法、癌症疫苗、细胞因子疗法、单克隆抗体、过继细胞转移（CAR-T 细胞或 CAR-NK）和免疫检查点阻断¹。

对于癌症疫苗，有不同形式的治疗性疫苗，例如基于全细胞的疫苗，蛋白质或肽疫苗以及RNA或DNA疫苗。疫苗接种依赖于抗原呈递细胞（APC）处理肿瘤抗原（包括肿瘤特异性抗原）并将其以免疫原性形式呈递给T细胞的能力。树突状细胞（DC）已知是最有效的APC，被认为在抗肿瘤免疫中起重要作用^2，3。这些细胞吸收并处理肿瘤抗原，然后迁移到引流淋巴结（dLN），通过T细胞受体（TCR）和共刺激分子的参与来启动和激活肿瘤特异性T效应（Teff）细胞。这导致肿瘤特异性细胞毒性T细胞（CTL）的分化和扩增，CTL浸润肿瘤并杀死肿瘤细胞⁴。因此，DC的活化和成熟代表了刺激肿瘤抗原免疫的有吸引力的策略。

已知 Flt3L 可促进表达 MHC II 类、CD11c、DEC205 和 CD86 蛋白的功能成熟 DC 的成熟和扩增⁵。肿瘤内而非静脉内给药含有 Flt3L 基因 （Adv-Flt3L） 的腺病毒载体已被证明可促进针对口位肿瘤的免疫治疗活性⁶。Flt3L还被用于基于肿瘤细胞的疫苗，该疫苗由稳定表达逆转录病毒转导的Flt3L的辐照B16-F10细胞组成，作为增强DC对肿瘤抗原交叉呈递的一种方式，从而增加抗肿瘤反应。这里描述的B16-Flt3L肿瘤疫苗接种方案基于James Allison博士的第⁷组发表的一项研究。在本文中，他们报告说，B16-Flt3L疫苗与CTLA-4阻断相结合，协同诱导对已建立的黑色素瘤的排斥反应，从而提高生存率。

该协议的目标是为黑色素瘤提供临床前免疫治疗模型。这里描述了如何制备和植入肿瘤疫苗的详细程序，以及如何分析实体瘤肿瘤内免疫细胞的组成和功能。

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研究方案

研究中使用的所有小鼠均在受控温度和湿度的特定无病原体条件下维持并饲养在拉霍亚免疫学研究所（LJI）的动物饲养室中。根据LJI动物护理委员会批准的指南和方案，对8-14周龄的雌性C57BL / 6小鼠进行动物实验。

1.培养的肿瘤细胞植入用的制备

1. 在含有 10% 热灭活 FBS、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、1 mM MEM 非必需氨基酸以及青霉素和链霉素各 100 U/mL 的 Ico 改良 Dulbecco 培养基 （IMDM） 中培养 B16-F10 黑色素瘤细胞。将细胞系保持在37°C的5%CO₂下。
2. 在175T烧瓶中接种1.5-2 x 10⁶ B16-F10细胞并培养2天。当细胞汇合75%-80%时收获细胞。
3. 取出培养基并用PBS洗涤烧瓶一次。吸出PBS并加入5mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，然后用力敲击培养瓶的边缘。
4. 加入 15 mL 培养基以中和胰蛋白酶-EDTA，并将烧瓶的内容物倒入 50 mL 离心管中。用 10 mL PBS 清洗培养皿表面，然后倒入同一个 50 mL 管中。
5. 将细胞以200 x g 离心5分钟。弃去上清液，用手指敲击管底部破碎细胞沉淀。
6. 加入冷的 10 mL PBS 并轻轻移液细胞悬液;然后，使用血细胞计数器手动计数细胞。注射前将细胞放在冰上。

2.肿瘤植入

1. 在通风橱中以每分钟1.0L的气体流速用5%异氟醚气体麻醉小鼠。一旦小鼠完全麻醉，将流速更改为2%异氟醚的维持剂量。对于该方案，麻醉由兽医按照机构动物护理和使用指南进行。
2. 剃掉小鼠左胁的毛发，并使用酒精湿巾对注射部位进行消毒。使用30G针头在左胁的50μL冷PBS中以5 x 10 5细胞皮内（i.d.）植入B16-F10^{肿瘤细胞。}
   注意:植入的B16-F10肿瘤细胞的剂量可能需要在0.5-5 x 10⁵ 细胞的范围内进行调整，以成功发展肿瘤。
3. 植入后，使用电子数字卡尺每周测量肿瘤长度和宽度三次。使用以下公式计算肿瘤体积（mm³）:
   肿瘤体积（mm³）=宽度² ×长度×0.5
   当肿瘤达到≥2毫米大小时，用肿瘤疫苗治疗小鼠。
   注意:肿瘤通常可以在植入5 x 10⁵肿瘤细胞后的第3天测量。在雄性C57BL / 6，Rag1-/-或Rag2-/-γc-/-小鼠中观察到更快的B16-F10肿瘤生长速率。 其他^研究8也描述了类似的观察结果。建议保持小鼠的性别一致。但是，请注意，NIH强调性别是生物医学研究中的重要生物变量。

3. 表达Flt3L的B16-F10（B16-Flt3L）细胞的疫苗制备和注射

1. 将B16-Flt3L细胞维持在含有8%热灭活FBS，2mM谷氨酰胺和青霉素和链霉素各100U / mL的DMEM中，在37°C和5%CO₂下。
2. 在175T烧瓶中接种1 x 10⁶ B16-Flt3L细胞并培养2天。如步骤 1.3 至 1.6 中所述，当细胞融合 75%-80% 时收获细胞，并悬浮在 1 mL 冷 PBS 中。
3. 使用具有 150 kV 和 25 mA 参数设置的 X 射线辐照器以 160 Gy 剂量的伽马射线照射细胞。注射前通过台盼蓝染色计数并检查细胞活力。
4. 如前所述对小鼠进行气体麻醉，并使用酒精湿巾对注射部位进行消毒。在初始细胞植入后的第3、6和9天，在距离原发肿瘤部位~1cm的50μL冷PBS中皮内注射1 x 10⁶ 个辐照的B16-Flt3L细胞。
5. 用彩色笔标记疫苗注射部位，以将其与原发肿瘤区分开来。
   注意:如果最初植入0.5 x 10⁵ B16-F10细胞，建议在第8天，第11天和第14天进行疫苗治疗。

4.瘤内免疫细胞分离

1. 在实验结束时（肿瘤植入后第15天;图1）。
2. 用每只小鼠的皮肤手术切除肿瘤，并将其放入具有1mL 10%FBS / RPMI-1640培养基的24孔板中。在称重之前用纸巾擦干肿瘤。
3. 将肿瘤切成小块。在RPMI-1640培养基中加入2mL消化缓冲液（100μg/ mLTL自由酶和200μg/ mL脱氧核糖核酸酶I），并在37°C下孵育25分钟。
4. 加入 10 mL 的 10% FBS/RPMI-1640 培养基以停止消化。使用25 mL血清移液管转移细胞，并使用1 mL注射器的柱塞在40 μm细胞过滤器上研磨组织。
5. 在4°C下以500× g 离心细胞5分钟。 将沉淀重悬于PBS中5mL的40%密度梯度特定培养基中，稀释至1x浓度）。
6. 将细胞悬液缓慢加入 5 mL 含有 PBS 的 80% 密度梯度特异性培养基上。在室温（RT）下以低制动设置以325 x g 离心细胞23分钟。
7. 离心后，小心地收集40%和80%密度梯度特异性培养基之间界面处的白细胞层，并将其通过40μm细胞过滤器。在4°C下以500× g 离心细胞5分钟。
8. 将沉淀在 2 mL 红细胞 （RBC） 裂解缓冲液中在室温下孵育 5 分钟。孵育后，加入 10 mL 10% FBS/RPMI-1640 培养基以淬灭红细胞裂解缓冲液。
9. 在4°C下以500× g 离心细胞5分钟。 将细胞重悬于0.5 mL的10%FBS / RPMI-1640培养基中，并在使用前计数细胞总数以进行进一步分析。
   注意:收集脾脏或dLN作为通过流式细胞术分析免疫细胞亚群门控策略的对照。按照上述细胞分离方法进行以下更改:使用 1 mL 注射器的柱塞在 70 μm 网状过滤器上研磨组织。用10%FBS / RPMI-1640培养基洗涤组织以获得单细胞悬浮液。按说明裂解红细胞。

5. 流式细胞术分析

注意:从白细胞层收集的细胞含有免疫细胞和肿瘤细胞。建议使用两个独立的染色小组。

1. 表面染色
   1. 将细胞转移到96孔V形底板中。用PBS洗涤细胞，并在室温下用细胞活力染料（50-100μL/孔）染色15分钟。
   2. 在4°C下以500×g离心细胞5分钟。 在FACS缓冲液（1%FBS和PBS中0.05%NaN₃）中用混合抗体（详细稀释度在材料表中提供）染色表面标志物30分钟（50-100μL /孔）。
   3. 将细胞以500× g 离心5分钟，并用FACS缓冲液洗涤两次。
   4. 用细胞固定缓冲液（50-100μL /孔）在冰上固定细胞35分钟。将细胞以500× g 离心5分钟，并用FACS缓冲液洗涤两次。
   5. 将样品储存在4°C的FACS缓冲液（150-200μL/管）中并避光。在流式细胞仪上采集样品。对于DC和T细胞群，遵循图2B和图3A中提供的门控策略。
      注意:对于骨髓DC的染色，建议在表面抗体孵育（步骤5.1.2）之前在冰上孵育FC阻滞剂（大鼠抗小鼠CD16 / CD32）15分钟。
2. 离体再刺激时的细胞因子分析
   1. 将细胞铺在完全培养基中（RPMI-1640补充有10%FBS，10mM HEPES，pH 7.2-7.6，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，青霉素和链霉素各100U / mL，50μM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺），并在蛋白质转运抑制剂存在下用50ng / mL的PMA加1μM离霉素刺激4小时在37°C下在5%CO₂下。
   2. 按照上述步骤5.1中所述对表面标记物进行表面染色。
   3. 加入透化溶液（50-100μL/孔），并在室温下孵育5分钟以进行细胞内染色。将细胞与细胞因子或核蛋白特异性抗体在透化溶液（50-100μL /孔）中在冰上孵育60分钟或在4°C下过夜。
   4. 将细胞以500× g 离心5分钟，并用FACS缓冲液洗涤两次。将样品储存在4°C并避光。在流式细胞仪上采集样品。
      注意:可能需要根据需要调整抗体稀释度以实现最佳染色。

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结果

植入的B16-F10细胞的可见黑点通常在肿瘤植入后~3天在皮肤表面观察到。在肿瘤结节达到≥2mm大小后3，6和9天用肿瘤疫苗治疗小鼠。我们观察到接种疫苗的小鼠组在肿瘤植入后~2周的肿瘤生长显着减少（图1）。在实验结束时，我们分离了肿瘤内免疫细胞，并分析了它们的数量和细胞表面标志物表达，以及如上所述的短暂体外刺激后的细胞因子产生。从白细胞层收集的细?...

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讨论

这里描述的协议是基于Allison小组的研究。他们证明，B16-Flt3L疫苗与CTLA-4阻断的组合对存活率和肿瘤生长显示出协同作用，而在单独接受B16-Flt3L疫苗或抗CTLA-4抗体治疗的小鼠中没有观察到肿瘤生长减少⁷。最近的研究揭示了一种新型的Treg内在CTLA4-PKCη信号通路，该通路在调节Treg¹¹的接触依赖性抑制活性中起着重要的强制性作用。单独使用B16-Flt3L疫苗治疗或具有Treg?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G needle	BD Biosciences	305106
96 well V-shape-bottom plate	SARSTEDT	83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixation buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cell fixation buffer (4.2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Electronic digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor)	BD Biosciences	554724	1:1500 dilution
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM nonessential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	density gradient specific medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Sterile cell strainer 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antibodies
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200