造血サイトカインによる腫瘍ワクチン接種を用いた実験的黒色腫免疫療法モデル

要約

このプロトコルは、Flt3L発現B16-F10黒色腫を伴う細胞ベースの腫瘍ワクチン接種を使用した癌免疫療法モデルを提示します。このプロトコルは、培養腫瘍細胞の調製、腫瘍移植、細胞照射、腫瘍増殖の測定、腫瘍内免疫細胞の分離、フローサイトメトリー分析などの手順を示しています。

要約

Fms様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt3L)は、樹状細胞(DC)の生存および分化を促進する造血サイトカインである。自然免疫を活性化し、抗腫瘍反応を高めるために腫瘍ワクチンに使用されています。このプロトコルは、Flt3L発現B16-F10メラノーマ細胞からなる細胞ベースの腫瘍ワクチンを使用した治療モデルと、腫瘍微小環境(TME)における免疫細胞の表現型および機能分析を示しています。培養腫瘍細胞の調製、腫瘍移植、細胞照射、腫瘍サイズ測定、腫瘍内免疫細胞単離、およびフローサイトメトリー分析の手順について説明します。このプロトコルの全体的な目標は、前臨床固形腫瘍免疫療法モデルと、腫瘍細胞と浸潤免疫細胞との関係を研究するための研究プラットフォームを提供することです。ここで説明する免疫療法プロトコルは、黒色腫の癌治療効果を改善するために、免疫チェックポイント遮断(抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1抗体)または化学療法などの他の治療法と組み合わせることができます。

概要

がん免疫療法は、毒性の低い副作用とより耐久性のある反応に基づいて、有望な治療戦略として認識されています。腫瘍溶解性ウイルス療法、癌ワクチン、サイトカイン療法、モノクローナル抗体、養子細胞移植(CAR-T細胞またはCAR-NK)、免疫チェックポイント遮断など、いくつかのタイプの免疫療法が開発されています¹。

がんワクチンの場合、全細胞ベースのワクチン、タンパク質またはペプチドワクチン、RNAまたはDNAワクチンなど、さまざまな形態の治療用ワクチンがあります。ワクチン接種は、抗原提示細胞(APC)が腫瘍特異的抗原を含む腫瘍抗原を処理し、それらを免疫原性の形でT細胞に提示する能力に依存しています。樹状細胞(DC)は最も強力なAPCであることが知られており、抗腫瘍免疫に重要な役割を果たすと考えられています^2,3。これらの細胞は腫瘍抗原を取り込んで処理した後、ドレナージュリンパ節(dLN)に移動して、T細胞受容体(TCR)と共刺激分子の関与を介して腫瘍特異的Tエフェクター(Teff)細胞をプライミングおよび活性化します。これにより、腫瘍特異的な細胞傷害性T細胞(CTL)が分化および増殖し、腫瘍に浸潤して腫瘍細胞を死滅させます⁴。したがって、DCの活性化と成熟は、腫瘍抗原に対する免疫を刺激するための魅力的な戦略を表しています。

Flt3Lは、MHCクラスII、CD11c、DEC205、およびCD86タンパク質を発現する機能的に成熟したDCの成熟と拡大を促進することが知られています⁵。静脈内ではなく腫瘍内、 Flt3L 遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクター(Adv-Flt3L)の投与は、オルトピー腫瘍に対する免疫治療活性を促進することが示されている⁶。Flt3Lは、DCによる腫瘍抗原のクロスプレゼンテーションを増強し、抗腫瘍応答を増加させる方法として、レトロウイルス形質導入Flt3Lを安定的に発現する照射B16-F10細胞からなる腫瘍細胞ベースのワクチンにも使用されています。ここで説明するB16-Flt3L腫瘍ワクチン接種のプロトコルは、ジェームズ・アリソン博士のグループ⁷によって発表された研究に基づいています。この論文では、CTLA-4遮断と組み合わせたB16-Flt3Lワクチンが相乗的に確立された黒色腫の拒絶反応を誘発し、生存期間が延びることを報告しました。

このプロトコルの目標は、黒色腫の前臨床免疫療法モデルを提供することです。ここでは、腫瘍ワクチンの調製方法や移植方法、固形腫瘍由来の腫瘍内免疫細胞の組成や機能を解析する方法の詳細な手順について説明する。

プロトコル

研究で使用されたすべてのマウスは、温度と湿度が制御された特定の病原体のない条件下で、ラホーヤ免疫学研究所(LJI)のビバリウムに維持および収容されました。動物実験は、LJI動物管理委員会によって承認されたガイドラインとプロトコルに従って、8〜14週齢の雌C57BL / 6マウスで実施されました。

1. 移植用培養腫瘍細胞の調製

1. B16-F10メラノーマ細胞を、10%熱不活化FBS、2 mMグルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、1 mM MEM非必須アミノ酸、およびペニシリンとストレプトマイシンの各100 U/mLを含むIscoveの改変ダルベッコ培地(IMDM)で培養します。細胞株を5%_CO2下で37°Cに維持する。
2. 175Tフラスコに1.5-2 x 10⁶ B16-F10細胞を播種し、2日間培養する。細胞が75%〜80%コンフルエントになったら細胞を収穫します。
3. 培養液を取り出し、フラスコをPBSで1回洗浄します。PBSを吸引し、5 mLの0.25%トリプシン-EDTAを加えた後、培養フラスコの縁を強くたたきます。
4. 15 mLの培養液を加えてトリプシン-EDTAを中和し、フラスコの内容物を50 mLの遠沈管に注ぎます。皿の表面を10 mLのPBSで洗浄し、同じ50 mLのチューブに注ぎます。
5. 細胞を200 x gで5分間遠心分離します。上清を捨て、チューブの底を指で軽くたたくことで細胞ペレットを壊します。
6. 冷たい10 mLのPBSを加え、細胞懸濁液を穏やかにピペッティングします。次に、血球計算盤を使用して手動で細胞をカウントします。注射前に細胞を氷上に保管してください。

2.腫瘍移植

1. ヒュームフード内で毎分1.0 Lのガス流量で5%イソフルランでマウスをガス麻酔します。マウスが完全に麻酔されたら、流量を2%イソフルランの維持用量に変更します。.このプロトコルでは、麻酔は、施設の動物の世話と使用のガイドラインに従って獣医によって行われました。
2. マウスの左脇腹の毛を剃り、アルコールワイプを使用して注射部位を滅菌します。皮内(i.d.)30 G針を使用して、左脇腹の50 μLの冷たいPBSに5 x 10⁵ 細胞でB16-F10腫瘍細胞を移植します。
   注:移植されたB16-F10腫瘍細胞の用量は、腫瘍の発生を成功させるために0.5〜5 x 10⁵ 細胞の範囲で調整する必要がある場合があります。
3. 移植後、電子デジタルノギスを使用して週に3回腫瘍の長さと幅を測定します。次の式を使用して腫瘍体積(mm³)を計算します。
   腫瘍体積(^mm3)=幅² ×長さ×0.5
   腫瘍が≥2mmのサイズに達したら、マウスを腫瘍ワクチンで治療する。
   注:腫瘍は通常、5 x 10⁵腫瘍細胞の移植後3日目に測定できます。より速いB16-F10腫瘍増殖速度は、雄のC57BL/6、Rag1-/-、またはRag2-/-γc-^/-マウスで観察された。同様の観察が他の研究にも記載されています⁸。マウスの性別を一定に保つことをお勧めします。ただし、NIHは、生物医学研究における重要な生物学的変数として性別に重点を置いていることに注意してください。

3. Flt3L発現B16-F10(B16-Flt3L)細胞のワクチン調製と注射

1. B16-Flt3L細胞を、8%熱不活化FBS、2 mMグルタミン、およびペニシリンとストレプトマイシンのそれぞれ100 U / mLを含むDMEMで、5%_CO2下で37°Cに維持します。
2. 175Tフラスコに1 x 10⁶ B16-Flt3L細胞を播種し、2日間培養する。ステップ1.3〜1.6に記載されているように、細胞が75%〜80%コンフルエントになったら細胞を回収し、1 mLの冷たいPBSに懸濁します。
3. 160 kV、25 mAのパラメータ設定でX線照射器を使用して、150 Gy線量のガンマ線を細胞に照射します。注射前にトリパンブルー染色により細胞生存率をカウントして確認する。
4. 前述のようにマウスをガス麻酔し、アルコールワイプを使用して注射部位を滅菌します。最初の細胞移植後3、6、および9日目に、原発腫瘍の部位から~1 cm離れた、元の腫瘍移植と同じ脇腹に、50 μLの冷たいPBSで1 x 10⁶ 照射されたB16-Flt3L細胞をマウスに皮内注射します。
5. 原発腫瘍と区別するために、ワクチン注射部位を色付きのペンでマークします。
   注:0.5 x 10⁵ B16-F10細胞を最初に移植する場合は、8、11、および14日目にワクチン治療を行うことをお勧めします。

4. 腫瘍内免疫細胞単離

1. 実験終了時(腫瘍移植後15日目;図1)。
2. 各マウスから皮膚を含む腫瘍を外科的に除去し、1 mL 10%FBS/RPMI-1640培地を含む24ウェルプレートに入れます。体重を量る前にペーパータオルを使用して腫瘍を乾かします。
3. 腫瘍を細かく切ります。2 mLの消化バッファー(RPMI-1640培地中の100 μg/mL TLリベラーゼおよび200 μg/mL DNase I)を加え、37°Cで25分間インキュベートします。
4. 10 mLの10%FBS/RPMI-1640培地を加えて消化を停止します。25 mLの血清学的ピペットを使用して細胞を移し、1 mLシリンジのプランジャーを使用して40 μmの細胞ストレーナーで組織を粉砕します。
5. 細胞を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ペレットをPBS中の40%密度勾配特異的培地の5mLに再懸濁し、1倍濃度に希釈する)。
6. PBSを含む80%密度勾配特異的培地5 mLの上に細胞懸濁液をゆっくりと加えます。室温(RT)で23分間、低ブレーキ設定で325 x g で細胞を遠心分離します。
7. 遠心分離後、40%と80%の密度勾配特異的培地の間の界面にある白血球層を注意深く収集し、40 μmの細胞ストレーナーに通します。細胞を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
8. ペレットを2 mLの赤血球(RBC)溶解バッファー中でRTで5分間インキュベートします。インキュベーション後、10 mLの10%FBS/RPMI-1640培地を加えて、RBC溶解バッファーをクエンチします。
9. 細胞を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 細胞を0.5 mLの10%FBS/RPMI-1640培地に再懸濁し、さらなる分析のために使用前に細胞の総数をカウントします。
   注:フローサイトメトリー分析による免疫細胞サブセットのゲーティング戦略のためのコントロールとして脾臓またはdLNを収集します。上記の細胞単離方法に従いますが、次の変更を加えます:1 mLシリンジのプランジャーを使用して、70 μmメッシュフィルターで組織を粉砕します。10%FBS/RPMI-1640培地で組織を洗浄し、単一細胞懸濁液を取得します。説明されているようにRBCを溶解します。

5. フローサイトメトリー解析

注:白血球層から採取された細胞には、免疫細胞と腫瘍細胞が含まれています。2枚の独立した染色パネルをお勧めします。

1. 表面染色
   1. 細胞を96ウェルのV字型底板に移します。細胞をPBSで洗浄し、細胞生存率色素(50-100 μL/ウェル)でRTで15分間染色します。
   2. 細胞を500 x gで4°Cで5分間遠心分離します。 表面マーカーをFACSバッファー(1%FBSおよび0.05%NaN₃ PBS中)の混合抗体(材料の表に記載されています)で氷上で30分間染色します(50-100 μL /ウェル)。
   3. 細胞を500 x g で5分間遠心分離し、FACSバッファーで2回洗浄します。
   4. 細胞固定バッファー(50-100 μL/ウェル)で細胞を氷上で35分間固定します。細胞を500 x g で5分間遠心分離し、FACSバッファーで2回洗浄します。
   5. サンプルを4°CのFACSバッファー(150-200 μL /チューブ)に保存し、光から保護します。フローサイトメーターでサンプルを取得します。DCおよびT細胞集団については、図 2B および 図3Aに示すゲーティング戦略に従ってください。
      注:骨髄性DCの染色には、表面抗体のインキュベーション(ステップ5.1.2)の前に、FCブロッカー(ラット抗マウスCD16 / CD32)を氷上で15分間インキュベートすることをお勧めします。
2. 生体外再刺激時のサイトカイン分析
   1. 細胞を完全培地(10%FBS、10 mM HEPES、pH 7.2-7.6、0.1 mM非必須アミノ酸、1 mMピルビン酸ナトリウム、各100 U/mLペニシリンおよびストレプトマイシン、50 μM 2-メルカプトエタノール、および2 mM L-グルタミンを添加したRPMI-1640)にプレートし、50 ng/mLのPMAと1 μMのイオノマイシンをタンパク質輸送阻害剤の存在下で5%_CO2下で37°Cで4時間刺激します。
   2. 上記のステップ5.1で説明したように、表面マーカーの表面染色を実行します。
   3. 透過処理液(50-100 μL/ウェル)を加え、RTで5分間インキュベートして細胞内染色を行います。サイトカインまたは核タンパク質に特異的な抗体を含む細胞を透過処理溶液(50-100 μL/ウェル)中で、氷上で60分間、または4°Cで一晩インキュベートします。
   4. 細胞を500 x g で5分間遠心分離し、FACSバッファーで2回洗浄します。サンプルは4°Cで保管し、光から保護してください。フローサイトメーターでサンプルを取得します。
      注:最適な染色を行うには、必要に応じて抗体希釈を調整する必要がある場合があります。

結果

移植されたB16-F10細胞の目に見える黒い点は、通常、腫瘍移植後~3日後に皮膚表面に観察されます。マウスは、腫瘍結節が≥2mmのサイズに達してから3、6、および9日後に腫瘍ワクチンで治療されます。ワクチン接種マウス群~腫瘍移植後2週間で腫瘍増殖の有意な減少が観察されました(図1)。実験の最後に、腫瘍内免疫細胞を単離し、それらの数と細胞表面マーカー発現、?...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、アリソンのグループによる研究に基づいています。その結果、B16-Flt3LワクチンとCTLA-4遮断の組み合わせは生存率と腫瘍増殖に相乗効果を示したが、B16-Flt3Lワクチンまたは抗CTLA-4抗体治療のみを受けたマウスでは腫瘍増殖の減少は見られなかった^{ことが示された7}。最近の研究では、Treg¹¹の接触依存的な抑制活性の調節に重要な...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G needle	BD Biosciences	305106
96 well V-shape-bottom plate	SARSTEDT	83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixation buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cell fixation buffer (4.2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Electronic digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor)	BD Biosciences	554724	1:1500 dilution
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM nonessential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	density gradient specific medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Sterile cell strainer 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antibodies
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200