Modello sperimentale di immunoterapia del melanoma utilizzando la vaccinazione tumorale con una citochina ematopoietica

Riepilogo

Il protocollo presenta un modello di immunoterapia del cancro che utilizza la vaccinazione tumorale basata su cellule con melanoma B16-F10 che esprime Flt3L. Questo protocollo dimostra le procedure, compresa la preparazione di cellule tumorali in coltura, l'impianto del tumore, l'irradiazione cellulare, la misurazione della crescita tumorale, l'isolamento delle cellule immunitarie intratumorali e l'analisi della citometria a flusso.

Abstract

Il ligando tirosin-chinas-simile 3 (Flt3L) è una citochina ematopoietica che promuove la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule dendritiche (DC). È stato utilizzato nei vaccini tumorali per attivare l'immunità innata e migliorare le risposte antitumorali. Questo protocollo dimostra un modello terapeutico che utilizza un vaccino tumorale basato su cellule costituito da cellule di melanoma B16-F10 che esprimono Flt3L insieme all'analisi fenotipica e funzionale delle cellule immunitarie nel microambiente tumorale (TME). Vengono descritte le procedure per la preparazione delle cellule tumorali in coltura, l'impianto del tumore, l'irradiazione cellulare, la misurazione delle dimensioni del tumore, l'isolamento delle cellule immunitarie intratumorali e l'analisi della citometria a flusso. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un modello preclinico di immunoterapia dei tumori solidi e una piattaforma di ricerca per studiare la relazione tra cellule tumorali e cellule immunitarie infiltranti. Il protocollo di immunoterapia qui descritto può essere combinato con altre modalità terapeutiche, come il blocco del checkpoint immunitario (anticorpi anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1) o la chemioterapia al fine di migliorare l'effetto terapeutico del melanoma sul cancro.

Introduzione

L'immunoterapia del cancro è stata riconosciuta come una strategia terapeutica promettente basata sui suoi effetti collaterali meno tossici e risposte più durature. Sono stati sviluppati diversi tipi di immunoterapie, tra cui terapie con virus oncolitici, vaccini contro il cancro, terapie con citochine, anticorpi monoclonali, trasferimento cellulare adottivo (cellule CAR-T o CAR-NK) e blocco del checkpoint immunitario¹.

Per i vaccini contro il cancro, ci sono diverse forme di vaccini terapeutici, come vaccini a base di cellule intere, vaccini proteici o peptidici e vaccini a RNA o DNA. La vaccinazione si basa sulla capacità delle cellule presentanti l'antigene (APC) di elaborare gli antigeni tumorali, compresi gli antigeni tumorali specifici, e presentarli in forma immunogenica alle cellule T. Le cellule dendritiche (DC) sono note per essere le APC più potenti e si ritiene che svolgano un ruolo importante nell'immunità antitumorale ^2,3. Queste cellule assorbono ed elaborano gli antigeni tumorali e quindi migrano verso i linfonodi drenanti (dLN) per innescare e attivare le cellule effettrici T tumore-specifiche (Teff) attraverso l'impegno del recettore delle cellule T (TCR) e delle molecole costimolatorie. Ciò si traduce nella differenziazione e nell'espansione delle cellule T citotossiche tumore-specifiche (CTL), che si infiltrano nel tumore e uccidono le cellule tumorali⁴. Di conseguenza, l'attivazione e la maturazione delle DC rappresentano strategie interessanti per stimolare l'immunità contro gli antigeni tumorali.

Flt3L è noto per promuovere la maturazione e l'espansione di DC funzionalmente mature che esprimono le proteine MHC di classe II, CD11c, DEC205 e CD86⁵. La somministrazione intratumorale, ma non endovenosa, di un vettore adenovirus che incorpora il gene Flt3L (Adv-Flt3L) ha dimostrato di promuovere l'attività terapeutica immunitaria contro i tumori ortotopici⁶. Flt3L è stato utilizzato anche in vaccini basati su cellule tumorali costituiti da cellule B16-F10 irradiate che esprimono stabilmente Flt3L trasdotta in modo retroviralmente come un modo per migliorare la presentazione incrociata degli antigeni tumorali da parte delle DC e, quindi, aumentare le risposte antitumorali. Il protocollo di vaccinazione antitumorale B16-Flt3L qui descritto si basa su uno studio pubblicato dal gruppo⁷ del Dr. James Allison. In questo articolo, hanno riferito che un vaccino B16-Flt3L combinato con il blocco CTLA-4 ha indotto sinergicamente il rigetto del melanoma stabilito, con conseguente aumento della sopravvivenza.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un modello di immunoterapia preclinica per il melanoma. Qui vengono descritte procedure dettagliate su come preparare e impiantare vaccini tumorali e come analizzare la composizione e la funzione delle cellule immunitarie intratumorali dal tumore solido.

Protocollo

Tutti i topi utilizzati nello studio sono stati mantenuti e ospitati nel vivaio dell'Istituto di immunologia La Jolla (LJI) in specifiche condizioni prive di agenti patogeni con temperatura e umidità controllate. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti con topi femmina C57BL / 6 di 8-14 settimane secondo le linee guida e i protocolli approvati dal LJI Animal Care Committee.

1. Preparazione di cellule tumorali in coltura per l'impianto

1. Cellule di melanoma B16-F10 di coltura nel terreno di Dulbecco modificato (IMDM) di Iscove contenenti il 10% di FBS inattivato dal calore, 2 mM di glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 1 mM di aminoacidi non essenziali MEM e 100 U / mL ciascuno di penicillina e streptomicina. Mantenere la linea cellulare a 37 °C sotto il 5% di CO₂.
2. Seminare 1,5-2 x 10⁶ cellule B16-F10 in un matraccio da 175T e coltura per 2 giorni. Raccogli le cellule quando sono confluenti al 75% -80%.
3. Rimuovere il terreno di coltura e lavare il pallone una volta con PBS. Aspirare PBS e aggiungere 5 ml di tripsina-EDTA allo 0,25%, quindi picchiettare bruscamente sul bordo del pallone di coltura.
4. Aggiungere 15 mL di terreno di coltura per neutralizzare la tripsina-EDTA e versare il contenuto del matraccio in una provetta da centrifuga da 50 ml. Lavare la superficie del piatto con 10 ml di PBS e versare nello stesso tubo da 50 ml.
5. Centrifugare le celle per 5 minuti a 200 x g. Scartare il surnatante e rompere il pellet cellulare toccando con le dita il fondo del tubo.
6. Aggiungere 10 ml freddi di PBS e pipetare delicatamente la sospensione cellulare; Quindi, contare manualmente le cellule usando l'emocitometro. Tenere le cellule sul ghiaccio prima dell'iniezione.

2. Impianto tumorale

1. Anestetizzare i topi con isoflurano al 5% alla portata del gas di 1,0 L al minuto nella cappa aspirante. Cambiare la portata alla dose di mantenimento del 2% di isoflurano una volta che i topi sono completamente anestetizzati. Per questo protocollo, l'anestetizzazione è stata eseguita dal veterinario seguendo le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali.
2. Radere i capelli sul fianco sinistro dei topi e sterilizzare il sito di iniezione usando salviettine imbevute di alcool. Impiantare per via intradermica (i.d.) cellule tumorali B16-F10 a 5 x 10⁵ cellule in 50 μL di PBS freddo nel fianco sinistro utilizzando un ago da 30 G.
   NOTA: Potrebbe essere necessario aggiustare la dose di cellule tumorali B16-F10 impiantate nell'intervallo di 0,5-5 x 10⁵ cellule per uno sviluppo tumorale di successo.
3. Dopo l'impianto, misurare la lunghezza e la larghezza del tumore tre volte alla settimana utilizzando un calibro digitale elettronico. Calcolare il volume del tumore (mm³) usando la formula:
   Volume del tumore (mm³) = larghezza² × lunghezza × 0,5
   Trattare i topi con il vaccino tumorale quando i tumori hanno raggiunto una dimensione di ≥2 mm.
   NOTA: I tumori di solito possono essere misurati il giorno 3 dopo l'impianto di 5 x 10⁵ cellule tumorali. Un tasso di crescita tumorale B16-F10 più veloce è stato osservato nei topi maschi C57BL / 6, Rag1-/-, o Rag2-/-γc-^/-. Un'osservazione simile è stata descritta in altri studi⁸. Si raccomanda di mantenere coerente il sesso dei topi. Tuttavia, si noti che il NIH pone l'accento sul sesso come importante variabile biologica nella ricerca biomedica.

3. Preparazione del vaccino e iniezione di cellule B16-F10 (B16-Flt3L) che esprimono Flt3L

1. Mantenere le cellule B16-Flt3L in DMEM contenenti l'8% di FBS inattivato dal calore, 2 mM di glutammina e 100 U / mL ciascuno di penicillina e streptomicina a 37 ° C sotto il 5% di CO₂.
2. Seminare 1 x 10⁶ cellule B16-Flt3L in un matraccio da 175T e coltura per 2 giorni. Prelevare le cellule quando sono confluenti al 75%-80% come descritto nelle fasi da 1.3 a 1.6 e sospenderle in 1 mL di PBS freddo.
3. Irradiare le celle alla dose di 150 Gy di raggi gamma utilizzando irradiatore a raggi X con impostazione dei parametri 160 kV e 25 mA. Contare e controllare la vitalità cellulare mediante colorazione blu tripano prima dell'iniezione.
4. Anestetizzare i topi con gas come descritto in precedenza e sterilizzare il sito di iniezione usando salviettine imbevute di alcool. Iniettare per via intradermica i topi con 1 x 10 6 cellule B16-Flt3L irradiate in 50 μL di PBS freddo sullo stesso fianco dell'impianto tumorale originale, a ~ 1 cm di distanza dal sito del tumore primario nei giorni 3,⁶ e 9 dopo l'impianto iniziale della cellula.
5. Contrassegnare i siti di iniezione del vaccino con una penna colorata per distinguerlo dal tumore primario.
   NOTA: Se inizialmente vengono impiantate 0,5 x 10⁵ cellule B16-F10, si raccomanda di eseguire il trattamento vaccinale nei giorni 8, 11 e 14.

4. Isolamento delle cellule immunitarie intratumorali

1. Sacrificare topi usando CO₂ e lussazione cervicale nella cappa aspirante alla fine dell'esperimento (il giorno 15 dopo l'impianto del tumore; Figura 1).
2. Rimuovere chirurgicamente il tumore con la pelle da ciascun topo e metterlo in una piastra a 24 pozzetti con 1 mL 10% di mezzo FBS / RPMI-1640. Asciugare i tumori con un tovagliolo di carta prima di pesarlo.
3. Tagliare i tumori in piccoli pezzi. Aggiungere 2 mL di tampone digestivo (100 μg/mL TL Liberase e 200 μg/mL DNasi I in RPMI-1640 mezzo) e incubare per 25 minuti a 37 °C.
4. Aggiungere 10 ml di mezzo FBS/RPMI-1640 al 10% per interrompere la digestione. Trasferire le cellule utilizzando una pipetta sierologica da 25 ml e utilizzare lo stantuffo di una siringa da 1 mL per macinare il tessuto su un filtro cellulare da 40 μm.
5. Centrifugare le celle a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere il pellet in 5 ml di mezzo specifico con gradiente di densità del 40% in PBS, diluito a concentrazione 1x).
6. Aggiungere lentamente la sospensione cellulare sopra 5 mL di mezzo specifico per gradiente di densità all'80% contenente PBS. Centrifugare le celle a 325 x g con regolazione del freno basso per 23 minuti a temperatura ambiente (RT).
7. Dopo la centrifugazione, raccogliere con cura lo strato di leucociti all'interfaccia tra il 40% e l'80% del mezzo specifico del gradiente di densità e farlo passare attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Centrifugare le celle a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
8. Incubare il pellet in 2 ml di tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) per 5 minuti a RT. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 ml di terreno FBS/RPMI-1640 al 10% per estinguere il tampone di lisi dei globuli rossi.
9. Centrifugare le celle a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere le cellule in 0,5 ml di terreno FBS/RPMI-1640 al 10% e contare il numero totale di cellule prima dell'uso per ulteriori analisi.
   NOTA: Raccogliere la milza o il dLN come controlli per la strategia di gating dei sottogruppi di cellule immunitarie mediante analisi della citometria a flusso. Seguire il metodo di isolamento cellulare come descritto sopra con le seguenti modifiche: Utilizzare lo stantuffo di una siringa da 1 mL per macinare il tessuto su un filtro a maglie da 70 μm. Lavare il tessuto con il 10% di mezzo FBS/RPMI-1640 per ottenere sospensioni monocellulari. Lisare i globuli rossi come descritto.

5. Analisi della citometria a flusso

NOTA: Le cellule raccolte dallo strato dei leucociti contengono cellule immunitarie e cellule tumorali. Si consigliano due pannelli di colorazione indipendenti.

1. Colorazione superficiale
   1. Trasferire le celle in una piastra inferiore a forma di V a 96 pozzetti. Lavare le cellule con PBS e colorarle con colorante di vitalità cellulare (50-100 μL / pozzetto) per 15 minuti a RT.
   2. Centrifugare le celle a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Colorare i marcatori superficiali con anticorpi misti (la diluizione dettagliata è fornita nella tabella dei materiali) in tampone FACS (1% FBS e 0,05% NaN₃ in PBS) per 30 minuti su ghiaccio (50-100 μL / pozzetto).
   3. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti e lavarle due volte con tampone FACS.
   4. Fissare le cellule con tampone di fissazione cellulare (50-100 μL / pozzetto) per 35 minuti sul ghiaccio. Centrifugare le celle a 500 x g per 5 minuti e lavarle due volte con tampone FACS.
   5. Conservare i campioni in tampone FACS (150-200 μL/tubo) a 4 °C e proteggere dalla luce. Acquisire i campioni su un citometro a flusso. Per le DC e la popolazione di cellule T, seguire le strategie di gating fornite nella Figura 2B e nella Figura 3A.
      NOTA: Per la colorazione delle DC mieloidi, si raccomanda di incubare il bloccante FC (ratto anti-topo CD16/CD32) per 15 minuti sul ghiaccio prima dell'incubazione degli anticorpi di superficie (punto 5.1.2).
2. Analisi delle citochine dopo ristimolazione ex vivo
   1. Placcare le cellule in mezzo completo (RPMI-1640 integrato con 10% FBS, 10 mM HEPES, pH 7,2-7,6, 0,1 mM di amminoacido non essenziale, 1 mM di piruvato di sodio, 100 U / mL di penicillina e streptomicina, 50 μM 2-mercaptoetanolo e 2 mM di L-glutammina) e stimolare con 50 ng / mL di PMA più 1 μM di ionomicina in presenza di inibitore del trasporto proteico per 4 ore a 37 °C sotto il 5% di CO₂.
   2. Eseguire la colorazione superficiale per i marcatori di superficie come descritto sopra al punto 5.1.
   3. Aggiungere la soluzione di permeabilizzazione (50-100 μL/pozzetto) e incubare per 5 minuti a RT per la colorazione intracellulare. Incubare le cellule con anticorpi specifici per citochine o proteine nucleari in soluzione di permeabilizzazione (50-100 μL/pozzetto) per 60 minuti su ghiaccio o per una notte a 4 °C.
   4. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti e lavarle due volte con tampone FACS. Conservare i campioni a 4 °C e proteggere dalla luce. Acquisire i campioni su un citometro a flusso.
      NOTA: potrebbe essere necessario regolare la diluizione degli anticorpi secondo necessità per ottenere una colorazione ottimale.

Risultati

Un punto nero visibile delle cellule B16-F10 impiantate viene solitamente osservato sulla superficie della pelle ~ 3 giorni dopo l'impianto del tumore. I topi vengono trattati con il vaccino tumorale 3, 6 e 9 giorni dopo che il nodulo tumorale ha raggiunto una dimensione di ≥2 mm. Abbiamo osservato una significativa riduzione della crescita tumorale nel gruppo di topi vaccinati ~ 2 settimane dopo l'impianto del tumore (Figura 1). Alla fine dell'esperimento, abbiamo isolato le cellule immun...

Discussione

Il protocollo qui descritto si basa sullo studio del gruppo di Allison. Hanno dimostrato che la combinazione del vaccino B16-Flt3L con il blocco CTLA-4 ha mostrato un effetto sinergico sul tasso di sopravvivenza e sulla crescita del tumore, mentre nessuna riduzione della crescita tumorale è stata osservata nei topi che hanno ricevuto il vaccino B16-Flt3L o il trattamento con anticorpi anti-CTLA-4 da solo⁷. Studi recenti hanno rivelato una nuova via di segnalazione CTLA4-PKCη intrinseca Treg-intr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G needle	BD Biosciences	305106
96 well V-shape-bottom plate	SARSTEDT	83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixation buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cell fixation buffer (4.2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Electronic digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor)	BD Biosciences	554724	1:1500 dilution
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM nonessential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	density gradient specific medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Sterile cell strainer 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antibodies
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200