Modello sperimentale di immunoterapia del melanoma utilizzando la vaccinazione tumorale con una citochina ematopoietica

Riepilogo

Il protocollo presenta un modello di immunoterapia del cancro che utilizza la vaccinazione tumorale basata su cellule con melanoma B16-F10 che esprime Flt3L. Questo protocollo dimostra le procedure, compresa la preparazione di cellule tumorali in coltura, l'impianto del tumore, l'irradiazione cellulare, la misurazione della crescita tumorale, l'isolamento delle cellule immunitarie intratumorali e l'analisi della citometria a flusso.

Abstract

Il ligando tirosin-chinas-simile 3 (Flt3L) è una citochina ematopoietica che promuove la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule dendritiche (DC). È stato utilizzato nei vaccini tumorali per attivare l'immunità innata e migliorare le risposte antitumorali. Questo protocollo dimostra un modello terapeutico che utilizza un vaccino tumorale basato su cellule costituito da cellule di melanoma B16-F10 che esprimono Flt3L insieme all'analisi fenotipica e funzionale delle cellule immunitarie nel microambiente tumorale (TME). Vengono descritte le procedure per la preparazione delle cellule tumorali in coltura, l'impianto del tumore, l'irradiazione cellulare, la misurazione delle dimensioni del tumore, l'isolamento delle cellule immunitarie intratumorali e l'analisi della citometria a flusso. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un modello preclinico di immunoterapia dei tumori solidi e una piattaforma di ricerca per studiare la relazione tra cellule tumorali e cellule immunitarie infiltranti. Il protocollo di immunoterapia qui descritto può essere combinato con altre modalità terapeutiche, come il blocco del checkpoint immunitario (anticorpi anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1) o la chemioterapia al fine di migliorare l'effetto terapeutico del melanoma sul cancro.

Introduzione

L'immunoterapia del cancro è stata riconosciuta come una strategia terapeutica promettente basata sui suoi effetti collaterali meno tossici e risposte più durature. Sono stati sviluppati diversi tipi di immunoterapie, tra cui terapie con virus oncolitici, vaccini contro il cancro, terapie con citochine, anticorpi monoclonali, trasferimento cellulare adottivo (cellule CAR-T o CAR-NK) e blocco del checkpoint immunitario¹.

Per i vaccini contro il cancro, ci sono diverse forme di vaccini terapeutici, come vaccini a base di cellule intere, vaccini proteici o peptidici e vaccini a RNA o DNA. La vaccinazione si basa sulla c....

Protocollo

Tutti i topi utilizzati nello studio sono stati mantenuti e ospitati nel vivaio dell'Istituto di immunologia La Jolla (LJI) in specifiche condizioni prive di agenti patogeni con temperatura e umidità controllate. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti con topi femmina C57BL / 6 di 8-14 settimane secondo le linee guida e i protocolli approvati dal LJI Animal Care Committee.

1. Preparazione di cellule tumorali in coltura per l'impianto

1. Cellule di melanoma B16-F10 di coltura nel terreno di Dulbecco modificato (IMDM) di Iscove contenenti il 10% di FBS inattivato dal calore, 2 mM di glutammina, 1 mM di piruv....

Risultati

Un punto nero visibile delle cellule B16-F10 impiantate viene solitamente osservato sulla superficie della pelle ~ 3 giorni dopo l'impianto del tumore. I topi vengono trattati con il vaccino tumorale 3, 6 e 9 giorni dopo che il nodulo tumorale ha raggiunto una dimensione di ≥2 mm. Abbiamo osservato una significativa riduzione della crescita tumorale nel gruppo di topi vaccinati ~ 2 settimane dopo l'impianto del tumore (Figura 1). Alla fine dell'esperimento, abbiamo isolato le cellule immun.......

Discussione

Il protocollo qui descritto si basa sullo studio del gruppo di Allison. Hanno dimostrato che la combinazione del vaccino B16-Flt3L con il blocco CTLA-4 ha mostrato un effetto sinergico sul tasso di sopravvivenza e sulla crescita del tumore, mentre nessuna riduzione della crescita tumorale è stata osservata nei topi che hanno ricevuto il vaccino B16-Flt3L o il trattamento con anticorpi anti-CTLA-4 da solo⁷. Studi recenti hanno rivelato una nuova via di segnalazione CTLA4-PKCη intrinseca Treg-intr.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G needle	BD Biosciences	305106
96 well V-shape-bottom plate	SARSTEDT	83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixation buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cell fixation buffer (4.2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Electronic digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor)	BD Biosciences	554724	1:1500 dilution
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM nonessential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	density gradient specific medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Sterile cell strainer 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antibodies
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200